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本发明涉及载体，其包含：(i)5’位置的反向末端重复(ITR)核苷酸序列；(ii)中间位置的与启动子功能性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码毒素；和(iii)3’位置的反向末端重复(ITR)核苷酸序列，其中除根据(i)和(iii)的ITR序列以外，所述载体不包含鹿眼蛱蝶浓核病毒(Junonia coenia densovirus)的任何病毒核苷酸序列。本发明还涉及使用该载体产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒(JcDNV)颗粒的方法。最后，本发明涉及根据上述方法产生的重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒作为蛾防治剂的用途。

权利要求书
1.   载体，其包含：
(i)在5’位置，至少包含序列SEQ ID No.1的第1至149位核苷酸的5’反向末端重复核苷酸序列(ITR)，所述5’ITR序列的长度小于或等于259个核苷酸；
(ii)在中间位置，与启动子可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码毒素；以及
(iii)在3’位置，至少包含序列SEQ ID No.3的第369至518位核苷酸的3’反向末端重复核苷酸序列(ITR)，所述3’ITR序列的长度小于或等于259个核苷酸，
除根据(i)和(iii)的ITR序列以外，所述载体不包含鹿眼蛱蝶(Junonia coenia)浓核病毒的任何病毒核苷酸序列。

2.   根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述毒素选自毒性多肽或者核酸分子例如siRNA或miRNA。

3.   用于产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒(JcDNV)的方法，所述方法包括以下步骤：
1)用以下来转化至少一个昆虫细胞：
a)权利要求1或2之一所述的载体；
b)至少一种第二补充载体，其包含：
i)编码所述鹿眼蛱蝶浓核病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4或其衍生物的核苷酸序列，所述核苷酸序列与启动子可操作性连接，所述启动子优选为JcDNV的启动子P9；和
ii)编码所述鹿眼蛱蝶浓核病毒的非结构蛋白NS1、NS2和NS3或其衍生物的核苷酸序列，所述核苷酸序列与启动子可操作性连接，所述启动子优选为JcDNV的启动子P93；
iii)所述至少一种第二载体不包含根据权利要求1或2的载体的所述5’和3’反向末端重复序列(ITR)，
2)收获所述重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。

4.   根据权利要求3所述的方法，其特征在于编码以下的核苷酸序列存在于至少两种不同的补充载体中：
(i)所述鹿眼蛱蝶浓核病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4或其衍生物，和
(ii)所述鹿眼蛱蝶浓核病毒的非结构蛋白NS1、NS2和NS3或其衍生物。

5.   细胞，其用以下转化：
a)权利要求1或2中之一所述的载体，
b)一种或几种权利要求3或4之一所述的补充载体。

6.   用于通过根据权利要求3或4之一所述方法产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的试剂盒，其包含：
a)权利要求1或2之一所述的载体；
b)权利要求3所述的至少一种第二补充载体。

7.   重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒，其可以通过根据权利要求3或4中任一项所述的产生方法来获得，并且由含有以下核苷酸序列的衣壳组成，所述核苷酸序列包含：
(i)在5’位置，权利要求1所述的5’反向末端重复核苷酸序列(ITR)；
(ii)在中间位置，权利要求1或2之一所述的与启动子可操作性连接的核苷酸序列；
(iii)在3’位置，权利要求1所述的3’反向末端重复核苷酸序列(ITR)。

8.   权利要求7所述的重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒作为用于防治鳞翅目的试剂的用途。

9.   组合物，其包含权利要求7所述的非复制重组鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。

10.   权利要求9所述的组合物作为用于防治鳞翅目的试剂的用途。

11.   植物处理方法，所述方法包括以下步骤：散布权利要求7所述的或者通过根据权利要求3或4之一所述的方法获得的非复制重组鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。

说明书用于在昆虫中进行基因转移的源自浓核病毒的载体
技术领域
本发明涉及用于产生允许编码毒素之基因在昆虫中的转移的非复制型重组鹿眼蛱蝶(Junonia coenia)浓核病毒的方法，及其在防治作物害虫中的用途。
背景技术
浓核病毒(Densovirus，DNV)是能够通过自身复制的致病性病毒，属于细小病毒家族。浓核病毒的基因组包装于未被包裹的二十面体衣壳中，由长度为约6kb的线性单链DNA组成，并且包含两个编码序列区。这些编码区之一在一条链上包含编码四种衣壳蛋白质(VP)的5’开放阅读框(ORF1)。另一编码区在互补链上包含三个5’开放阅读框ORF2、ORF3和ORF4并且编码浓核病毒的非结构蛋白(NS)。这两个编码区在5’端和3’端以具有发夹结构的反向末端重复序列(ITR)(长度大于500个核苷酸)为界，并且包括负责VP蛋白和NS蛋白表达的启动子。
浓核病毒具有只对无脊椎动物并且特别是昆虫和贝类具有致病性的有趣特性。事实上，在哺乳动物中并且更特别地在人中并未发现致病性。因此，对使用这样的浓核病毒来防治作物害虫有极大兴趣。该兴趣由以下确认：因浓核病毒基因组的小尺寸而将其插入细菌质粒从而促进遗传工程操作以及重组浓核病毒产生的可能性。
但是，浓核病毒在环境中复制和扩增的能力对于使用浓核病毒防治作物害虫是缺点。
出于克服该缺点的目的，本发明人开发了用于由鹿眼蛱蝶产生没有任何复制能力的重组浓核病毒颗粒并且进一步在昆虫的受感染细胞中表达毒素的方法。
鹿眼蛱蝶浓核病毒(JcDNV)的特征是获益于扩展到几鳞翅目(Leoidoptera)物种的宿主谱，特别是荨麻蛱蝶(Aglais urticaeL.)(蛱蝶科，Nymphalidae)、舞毒蛾(Lymantria disparL.)(毒蛾科，Lymantriidae)、家蚕(Bombyx moriL.)(蚕蛾科，Bombycoidae)、Mamestraoleracea，M.brassicaeL.(夜蛾科，Noctuidae)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、S.littoralis、草地贪夜蛾(S.frugiperda)(夜蛾科)。
本发明的重组JcDNV颗粒不能在环境中复制但有这样的可能性，即通过在感染后的所述昆虫细胞中表达毒素来防治作物害虫(特别是鳞翅目)。
附图说明
图1.用于产生重组且非复制的JcDNV颗粒的构建体。
发明详述
本发明的第一目的涉及载体，所述载体源自鹿眼蛱蝶的浓核病毒基因组，其包含如下列出的核苷酸序列：
(i)在5’位置，至少包含序列SEQ ID No.1的第1至149位核苷酸的5’反向末端重复核苷酸序列(ITR)，所述5’ITR序列的长度小于或等于259个核苷酸；
(ii)在中间位置，与启动子可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码毒素；和
(iii)在3’位置，至少包含序列SEQ ID No.3的第369至518位核苷酸的3’反向末端重复核苷酸序列(ITR)，所述3’序列ITR的长度小于或等于259个核苷酸，优选地，所述3’核苷酸序列ITR与5’的ITR核苷酸序列互补；
除根据(i)和(iii)的ITR序列以外，所述载体不包含鹿眼蛱的任何病毒核苷酸序列。
“载体”指能够促进核苷酸序列在一种细胞(优选为昆虫细胞)中的转移的任何运载体。一般而言，本发明的载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒(phagemid)或通过插入或整合核苷酸序列而被操作的源自病毒来源或细菌来源的任何其它运载体，例如且不限于，杆状病毒类型的载体。
此外，所述载体可包含选择标记以允许鉴定良好整合所述载体的细胞。
优选地，本发明的载体是质粒载体，也称为质粒。质粒已在现有技术中广泛描述并且对于本领域技术人员而言是公知的(参见例如SANBROOK等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版，冷泉港实验室出版社，1989)。作为实例，可提及最常用的质粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。可以通过使用用于去除或添加特定DNA片段的限制酶和连接反应来设计质粒。向其中插入核苷酸序列的质粒为线性或环状单链或双链DNA的形式。
根据下述方法，可以通过转化将质粒递送至细胞。
可以将源自鹿眼蛱蝶浓核病毒的载体称为“毒性载体”，因为其具有编码在受感染昆虫细胞中持久表达之毒素的核苷酸序列。
术语“核苷酸序列”指DNA序列(例如，cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA序列(例如信使RNA或其它合成RNA)以及包含非天然核苷酸类似物、非天然核苷酸间键或二者的DNA或RNA的类似物。优选地，所述核苷酸序列是DNA序列。核苷酸序列可具有任何拓扑构型，例如线性或环状构型。
“反向末端重复序列”(更经常称为“反向末端重复”或ITR)是指具有位于鹿眼蛱蝶浓核病毒基因组之5’端和3’端的具有发夹结构的序列(分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3)。已知这些长度为518个核苷酸的ITR序列参与病毒基因组的衣壳化现象及其在病毒基因组复制中起作用。
本发明的ITR序列的特征是已被部分缺失。因此，本发明载体的ITR最小序列保留将基因组在衣壳结构蛋白中衣壳化的功能。载体上任何其它病毒来源序列的不存在防止载体通过自身复制。
优选地，5’的核苷酸序列ITR不包含多于225个来自SEQ ID No：1序列的核苷酸(例如不多于200个或175个核苷酸)，更优选不多于160个SEQ ID No：1序列的核苷酸。
更优选地，5’的ITR序列包含于序列SEQ ID No.1的第1至149位核苷酸(SEQ ID No.2)中。
优选地，5’的核苷酸序列ITR不包含多于225个SEQ ID No：3序列的核苷酸(例如不多于200个或175个核苷酸)，更优选不多于160个SEQ ID No：3序列的核苷酸。
更优选地，3’的ITR序列包含于SEQ ID No.3的第369至518位核苷酸(SEQ ID No.4)中。
“毒素”指对细胞具有毒性作用的分子，该毒性作用可引起细胞死亡以及一个或更多个细胞功能的干扰，所述细胞干扰可引起生物体生长延迟或所述生物体的死亡。
术语“生物体”指用重组且非复制的JcDNV颗粒感染的任何昆虫。
根据一个具体实施方案，本发明的毒素可以是多肽，在其表达的细胞中的毒性的载体。该毒性特别地引起有害作用，例如细胞组分或功能的破坏。因此，可以使用已知对昆虫并且特别是鳞翅目有毒性作用的多肽，例如来自多种动物之毒液的毒性多肽(蝎毒的神经毒素AaH‑IT1、寄生蜂毒液腺的毒素等)或由植物或微生物产生的其它毒性多肽，例如蓖麻毒素或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry毒素(Bt kurstaki1970，Bt aizawai1989)。
将使用具有蛋白质序列SEQ ID No.5的蝎毒神经毒素AaH‑IT1。
根据另一实施方案，本发明的毒素可以是DNA或RNA核酸分子，例如干扰RNA(iRNA)，所述分子对指定基因的表达具有抑制活性。该活性特别地通过靶信使RNA的快速降解来实现并且引起靶基因转录的消失。
优选地，将选择具有中等稳定性的毒素。中等稳定性指在小于7天、小于1天或小于7小时内降解的毒素。
还优选地是，将选择对其中产生本发明的重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的细胞没有任何毒性作用的毒素。
“与启动子可操作性连接”指使启动子的位置与目的核苷酸序列相邻以控制所述序列表达的连接。在这种情况下，启动子与编码毒素的核苷酸序列可操作性连接以控制其表达。
作为使得毒素在昆虫细胞中表达的启动子的实例，可以使用普遍(ubiquitous)启动子例如序列SEQ ID No.6的家蚕启动子Actine A3或组织的其它特异性启动子。
优选地，使得本发明载体的毒素表达的启动子是可诱导启动子，从而能够通过同时或不同时施用所述载体以及所述启动子的介导因子来调节所述毒素的表达。
除根据(i)和(iii)的ITR序列以外，本发明的载体不包含鹿眼蛱蝶浓核病毒的任何病毒核苷酸序列。事实上，该载体由包含SEQ ID No.7的鹿眼蛱蝶浓核病毒之全基因组的载体构建。因此，除5’和3’的ITR核苷酸序列之外，本发明的载体不包含来自序列SEQ ID No.7的任何其它核苷酸序列。
本发明的第二目的涉及用于产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒(JcDNV)的方法，所述方法包括以下步骤：
1)用以下来转化至少一个昆虫细胞：
a)如上所述的载体；
b)至少一种包含以下的第二补充载体：
(i)编码鹿眼蛱蝶浓核病毒结构蛋白VP1(SEQ ID No.8)、VP2(SEQ ID No.9)、VP3(SEQ ID No.10)和VP4(SEQ ID No.11)或其衍生物的核苷酸序列，所述核苷酸序列与启动子可操作性连接，优选为Jc DNV的启动子P9，和
(ii)编码鹿眼蛱蝶浓核病毒非结构蛋白NS1(SEQ ID No.13)、NS2(SEQ ID No.14)和NS3(SEQ ID No.15)或其衍生物的核苷酸序列，所述核苷酸序列与启动子可操作性连接，优选为JcDNV的启动子P93，
(iii)所述至少一种第二载体在载体不包含如前所述的5’和3’的反向末端重复序列(ITR)，
2)收获重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。
本发明的第二载体形成补充载体(也称为“辅助”载体)，即，具有多种功能或者具有编码毒素之核苷酸序列的载体的缺少元件(产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒所需的)的载体，例如编码衣壳化所需蛋白质(NS)或形成衣壳的蛋白质(VP)的核苷酸序列。
结构蛋白(也称为“病毒蛋白”(VP))形成浓核病毒衣壳的蛋白质。它们有4种：VP1、VP2、VP3和VP4，分别具有如下蛋白质序列：SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。优选地，用于所述结构蛋白质VP的表达的启动子是序列SEQ ID No.12的鹿眼蛱蝶浓核病毒启动子P9。
非结构蛋白(也称为“非结构蛋白”(NS))参与用于形成衣壳的结构蛋白VP的复制和组装。这些非结构蛋白有3种：NS1、NS2和NS3，分别具有如下蛋白质序列：SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。优选地，用于表达所述非结构蛋白NS的启动子是序列SEQ ID No.16的JcDNV启动子P93。
“衍生物”指编码与前述鹿眼蛱蝶浓核病毒之结构蛋白(VP)或非结构(NS)蛋白的多肽序列有至少95％的同一性百分比的多肽的核苷酸序列。
“两条多肽序列之间的同一性百分比”指通过需要进行比较的两条序列之间的最佳可能比对得到所述序列的相同氨基酸的百分比。该百分比是纯统计学的并且两条序列之间的差异随机分布于氨基酸序列的全长。
“最佳可能比对”或“最佳比对”指可以得到最高同一性百分比的比对。两条氨基酸序列之间的序列比较通常通过以下来实施：在根据最佳可能比对来比对所述序列之后比较所述序列；然后对比较区段实施比较以鉴定和比较相似区域。可以通过以下获得用于实施比较的最佳可能比对：使用由SMITH和WATERMAN(Ad.APP.Math，第2卷，第482页，1981)以及由NEDDLEMAN和WUNSCH(J.Mol.Biol.，第48卷，第443页，1970)开发的全局同一性算法；通过使用由PEARSON和LIPMAN(Proc.Natl.Acd.Sci，USA，第85卷，第2444页，1988)开发的相似性方法；通过使用基于这样的算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TTASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI USA)；通过使用多重比对算法MUSCLE(Edgar，Robert C.，Nucleic Acid Research，第32卷，第1792页，2004)。为了获得最佳可能比对，将优选使用具有矩阵BLOSUM62或矩阵PAM30的程序BLAST。通过比较以最佳方式比对的两条序列来确定同一性百分比，与参照序列相比，所述序列可包含添加或缺失以得到这两条序列之间的最佳可能比对。通过以下来计算同一性百分比：确定两条序列之间相同的位置的数目，用所得数目除以被比较位置的总数，并将所得结果乘以100以得到这两条序列之间的同一性百分比。
如上所述，包含至少序列SEQ ID No.1的第1至149位核苷酸的5’的反向末端重复序列(ITR)(所述5’的ITR序列的长度小于或等于259个核苷酸)未包含于上述任何补充载体中。
同样，包含至少序列SEQ ID No.3的第369至518位核苷酸的3’位置的反向末端重复核苷酸序列(ITR)(所述3’的序列ITR的长度小于或等于259个核苷酸)未包含于任何补充载体中。
本发明的两种载体不共有具有大于50％的同一性、30％的同一性或20％的同一性的大于100个碱基对、大于50个碱基对或大于25个碱基对的序列。
根据一个优选实施方案，编码以下的核苷酸序列存在于至少两种不同的载体上：
(i)鹿眼蛱蝶浓核病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4或其衍生物，和
(ii)鹿眼蛱蝶浓核病毒的非结构蛋白NS1、NS2和NS3或其衍生物。
“转化”指使得进行基因转移(优选地在昆虫细胞中)的任何方法。昆虫细胞的转化可以通过使用对于本领域技术人员而言已知的方法来实施，例如使用转染或转导。
优选地，使用转染在昆虫细胞中转移核苷酸序列。“转染”指在真核细胞中引入DNA。可以使用磷酸钙、脂质体或脂质载体例如(INVITROGEN)、高度支化聚阳离子剂来实施细胞转染。
可以根据下述步骤来实施重组且非复制的JcDNV颗粒的收获，所述步骤不限于：转染后第4天，收获细胞和培养上清液以进行3个冷冻/解冻循环，接着进行本地(domestic)超声处理。然后，将上清液以5,000g澄清10分钟，随后通过在4℃于Beckman SW41ti转子中以175,000g超速离心2小时来浓缩病毒颗粒。将病毒颗粒重悬于PBS中。
本发明的第三目的涉及昆虫细胞，其包含：
a)具有上述编码毒素的核苷酸序列的载体；
b)一种或几种的上述补充载体。
所述昆虫细胞特别用于根据之前所述的方法产生重组且非复制的的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。
本发明的昆虫细胞具有能够被培养和转化的特征。在用本发明的载体转化之后，所述细胞也能够复制重组浓核病毒，以及表达病毒蛋白(VP)和非结构(NS)蛋白从而产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒。
作为昆虫细胞的实例，可以使用如下细胞：
‑Sf9(草地贪夜蛾，Spodoptera frugiperda)
‑High5(粉纹夜蛾，Trichoplusia ni)
‑Ld(舞毒蛾，Lymantria dispar)。
作为昆虫细胞培养条件的实例，可以使用如下条件：
Sf9(草地贪夜蛾)在26℃于TC100培养基(INVITROGEN，USA)+10％FCS+1％抗生素/抗真菌素中培养；
High5(粉纹夜蛾)在26℃于Grace培养基(INVITROGEN，USA)+10％FCS+1％抗生素/抗真菌素中培养；
Ld(舞毒蛾)在26℃于TC100培养基(INVITROGEN，USA)+10％FCS+1％抗生素/抗真菌素中培养。
本发明的第四目的涉及用于根据之前所述的方法产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的试剂盒，其包含：
a)具有如上所述编码毒素的核苷酸序列的载体，和
b)至少一种上述补充载体。
根据一个优选实施方案，本发明的用于产生重组且非复制的JcDNV颗粒的试剂盒包含：
a)具有如上所述编码毒素的核苷酸序列的载体，和
b)至少两种不同的上述补充载体。
根据一个具体的实施方案，用于产生重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的试剂盒还包含上述昆虫细胞。
本发明的第五目的涉及重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒，其可根据之前所述的方法得到，并且由含有以下核苷酸序列的衣壳组成且通过之前所述的产生方法获得，所述核苷酸序列包含：
(i)在5’位置，如前所述的5’反向末端重复核苷酸序列(ITR)；
(ii)在中间位置，与启动子可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码毒素；和
(iii)在3’位置，如前所述的3’反向末端重复核苷酸序列(ITR)。
“重组鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒”指由经修饰浓核病毒基因组产生的病毒颗粒。在这种情况下，本发明的重组鹿眼蛱蝶浓核病毒的基因组通过以下来修饰：5’和3’反向末端重复序列(ITR)的部分缺失(以至少维持序列的衣壳化功能)以及通过抑制包含于两条ITR序列之间的全部病毒JcDNV序列。此外，编码毒素的核苷酸序列也被插入部分缺失的ITR序列之间。
“重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒”指不具有复制其基因组之能力(在只由其遗传物质或从宿主细胞的遗传物质产生浓核病毒方面)的鹿眼蛱蝶浓核病毒的重组病毒颗粒。
重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒在之前所述的方法中由具有编码毒素之核苷酸序列的载体通过具有衣壳化和病毒复制所需之病毒序列的补充载体产生。因此，在不存在这些表达结构蛋白和非结构蛋白的补充载体的情况下，重组鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒不能复制。
本发明的第六目的涉及上述重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒作为防治鳞翅目的试剂的用途。
本发明的重组且非复制的JcDNV颗粒的基因组包含与启动子可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码毒素。所述毒素可以在受感染昆虫细胞中表达并且形成用这些浓核病毒颗粒防治作物害虫鳞翅目的工具。
本发明的第七目的涉及包含之前所述的重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的组合物。
优选地，当所述启动子是可诱导启动子时，根据本发明所述的组合物还包含与编码毒素的核苷酸序列可操作性连接的启动子的介导因子。
本发明的第八目的涉及如前所述的组合物作为防治鳞翅目的工具的用途。
本发明的第九目的涉及用于处理植物的方法，所述方法包括在植物培养物上散布如前所述的重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的步骤。
优选地，根据所述处理方法处理的植物是稻、玉米、棉花、大豆、高粱(sorghum)、蔗糖、番茄、甜椒、苜蓿(lucerne)。
优选地，编码毒素的序列受可诱导启动子控制，根据本发明用于处理植物的方法包括在如前所述的散布重组且非复制的鹿眼蛱蝶浓核病毒颗粒的步骤的同时、之前或之后散布所述启动子的介导因子化合物的步骤。
实施例1构建体
所有所产生的构建体源自含鹿眼蛱蝶浓核病毒(JcDNV)的完整感染序列(即在每一侧以5’和3’反向末端重复序列(ITR)为界的结构(VP)基因和非结构(NS)基因)的质粒pBRJ‑H，(SEQ ID No：7)(图1)(Jourdan等，1990，Virology，第179卷，第403至409页；Rolling，1992，phD thesis at the University ofAix‑Marseille II，第153页)。
a)补充质粒的构建
补充载体具有受启动子控制的结构基因(VP)和/或也受启动子控制的非结构基因(NS)但不具有ITR序列。
具有NS和VP基因而不具有ITR序列的质粒(称为pJA质粒)是由pBRJ‑H质粒通过缺失FspI位点处的反向末端重复区(ITR)得到的(Li，1993，phD Thesis at the Universtiy of Montpellier II.第124页)。在该构建中，JcDNV的结构基因(VP)和非结构域基因(NS)分别受其自身启动子P9和P93控制。
为了获得只具有非结构基因(NS)的构建体，通过以下来实施结构基因(VP)的缺失：用限制酶BamHI和HpaI(38bp位至2162bp位)消化pJA质粒，然后用T4DNA连接酶(INVITROGEN，USA)再连接，从而产生pJAΔVP质粒(图1a)。
同样，通过实施以下缺失非结构基因(NS)来获得只具有结构基因(VP)的质粒：用限制酶BsmI和KpnI(2732bp位至5211bp位)消化pJA质粒来从而产生pJAΔNS质粒(图1b)。
b)衣壳化载体的构建
衣壳化可需要病毒基因组末端的反向末端重复区(ITR)。开发了具有重组基因组的不同构建体以确定衣壳化所需的最小ITR序列。在第一阶段，通过在BstEII位点(337bp位至6028bp位)或BamHI位点(446bp位至5920bp位)消化pBRJ‑H质粒从而缺失编码NS和VP的病毒基因组部分，获得只具有ITR的构建体。
然后，通过以下来构建第一重组载体：在pBRJ‑H质粒的酶BstEII和BamHI之限制性位点克隆家蚕A3的Actine启动子(SEQ ID No.6)控制下的包含编码“绿色荧光蛋白”(GFP)的基因的表达盒A3GFP，缺失所述质粒的病毒基因组。所使用的表达盒A3GFP源自质粒pΔSA3‑GFP‑鳞翅目的表达载体(Bossin，1998，Thesis at the University of Montpellier II，第240页)(图1c)。这样产生的载体形成待衣壳化的重组基因组之一。相应的构建体称为pITR‑A3GFP‑BstEII和pITR‑A3GFP‑BamHI。
通过在限制性位点BamHI和NotI处缺失报告基因GFP由载体pITR‑A3GFP‑BstEII构建含编码红色荧光蛋白DsRed2之基因的重组质粒载体。用整合有限制性位点BamHI和NotI的引物通过PCR由质粒pDsRed2(CLONTECH，USA)扩增基因DsRed2，然后插入GFP基因的位置。该构建体称为pITR‑A3DsRed2‑BstEII。
根据针对载体pITR‑A3DsRed2‑BstEII的方法来构建含编码黄肥尾蝎(Androctonus australis)之神经毒素(AaH‑IT1)(SEQ ID No.5)(得自质粒pcD‑Tox(Bougis等，1989))的基因的重组质粒载体。产生的载体称为pITR‑A3AaH‑IT1‑BstEII
实施例2细胞系和多重转染测试
在昆虫细胞中通过多重转染来产生重组JcDNV颗粒。将昆虫细胞系舞毒蛾IPLB‑Ld652(Ld)(Goodwin等，1978，In vitro，第14卷，第6期，页码：485‑94；1985，Techniques in the life sciences，cell biology，”第C1卷，“techniques in setting up and maintenance of tissue and cell cultures.”Separate C109，第28页，Elsevier，County Clare，Ireland 或Techniques in the Life Sciences，Setting Up and Maintenance of Tissue and Cell Cultures，Elsevier Scientific Publishers Ireland，Ltd.，(1985)，页码：C109/1至C109/28)在26℃保持于补充有10％的胎牛血清和1％的抗生素/抗真菌素(Sigma，USA)的TC100培养基(Invitrogen，USA)中。
根据供应商的说明书使用转染剂(Roche Diagnostics，USA)进行细胞Ld的下述不同共转染反应：
‑按照1∶1或1∶2的比，使用具有基因NS和VP的补充载体pJA和重组衣壳化载体pITR‑A3GFP或pITR‑A3DsRed2或pITR‑A3AaH‑IT1进行双转染；
‑按照1∶1∶1或1∶1∶2的比，使用具有基因VP的补充载体pJAΔNS和具有NS基因的pJAΔVP以及重组衣壳化载体pITR‑3GFP或pITR‑A3DsRed2或pITR‑A3AaH‑IT1进行三转染。
通过用荧光显微镜观察转染有构建体pITR‑A3GFP的Ld细胞来确定转染效率，并且显示其为至多30％。
实施例3JcDNV颗粒的产生
转染之后第4天，收获细胞和培养上清液以进行3个冷冻/解冻循环，接着用超声波进行本地处理(domestic treatment)。然后，将上清液以5,000g澄清10分钟，随后通过在4℃于Beckman SW41ti转子中以175,000g超速离心2小时来浓缩病毒颗粒。将病毒颗粒重悬于PBS中。
为了检查病毒颗粒的存在和浓度，将前述悬液的一部分沉积在载物架上以实施负染色(2％磷钨酸，pH7.0).
透射电子显微镜(TEM)观察步骤使得确认由细胞产生病毒颗粒。
实施例4JcDNV颗粒的表征
为了检查衣壳化DNA确实对应于期望构建体(特别是表达盒A3GFP)，从病毒颗粒提取病毒DNA，然后用DpnI消化。随后通过使用表达盒A3GFP特异的引物对被消化的DNA实施PCR扩增步骤，正义引物：5’‑ATTTACTAAggTgTgCTCgAACAgT‑3’(SEQ ID No.17)，反义引物：5’‑TACTTgTACAgCTCgTCCATgCCg‑3’(SEQ ID No.18)。结果显示从病毒颗粒提取的DNA特异性扩增，而在用DpnI消化的质粒对照(pΔSA3‑GFP)中没有扩增。这些结果确认了重组基因组确实在转染细胞中扩增和衣壳化。
实施例5重组病毒的分析
使用实施例3中得到的病毒颗粒悬液感染Ld细胞。因此，在96孔板中制备培养于完全TC100培养基中的Ld细胞以在培养24小时之后有80％汇合。次日，除去细胞的培养基，添加50μl的经纯化的病毒颗粒。在26℃用接种物将细胞孵育1小时。然后，添加完全TC100培养基，将细胞保持于26℃烘箱中直至观察。
感染之后，每日监测细胞Ld的荧光。结果显示在感染后第4天在约15％的细胞中检测到了荧光报告基因(GFP和DsRed2)的表达。
实施例6病毒颗粒的非复制性质的验证
为了确认分离的病毒颗粒的非复制性质，收获实施例5中受感染细胞的培养上清液，并进行与实施例3相同的步骤(澄清、超速离心和在PBS中重悬沉淀)。使用一体积的该悬液感染新Ld细胞，步骤与实施例4中所使用的步骤相同。同样，感染之后，定期监测Ld细胞的荧光。
结果显示没有荧光痕迹，这可确认所得颗粒的非复制性质。
实施例7基因向害虫的转移
为了确认之前(见实施例3)得到的颗粒的效率，通过微量注射器将所述颗粒注入草地贪夜蛾的夜蛾幼虫(孵化之后7天，第4发育阶段的开始)。
使用了表示为如下的几个组(10至15只幼虫)：
‑向其注入10μl编码蛋白质GFP的重组颗粒的GFP组；
‑向其注入10μl编码蛋白质DsRed2的重组颗粒的DsRed组；
‑向其注入10μl编码蝎毒AaH‑IT1的重组颗粒的AaH‑ITl组；
‑向其注入10μl经纯化野生型JcDNV颗粒的阳性对照组，用感染性质粒pBRJ‑H转染Ld细胞之后产生；
‑向其注入10μlPBS的阴性对照组。
注射之后，以人工培养基饲养幼虫，并在26℃烘箱中保持6天。每天跟踪记录重量和死亡率。将在实验过程中死亡的幼虫储存于‑20℃以用于后续分析。
在感染(PI)后第6天，使用直径为0.2mm的针在假爪(false paw)取血细胞样品。回收各幼虫的血液淋巴并培养于有100μl培养基TC100和1％抗生素和0.03μM PTU(N‑苯基硫脲)的96孔板中。培养后4小时立即用荧光显微镜观察血细胞。
回收血细胞之后，部分地解剖幼虫以分离下述不同组织：肠、气管、神经节和表皮。直接用荧光显微镜观察不同器官。
a)昆虫中重组颗粒GFP和DsRed的递送
培养(6天PI)之后4小时立即用荧光显微镜观察GFP组、DsRed组、阳性对照组和阴性对照组幼虫的血细胞。在注射有编码GFP和DsRed的颗粒的各幼虫的某些血细胞中观察到了绿色和红色荧光信号。在阳性对照和阴性对照中未观察到荧光。
解剖之后，将组织放置在载片上并用荧光显微镜观察。分别在感染有重组颗粒GFP和DsRed的幼虫气管中观察到了特特异绿色荧光和红色荧光。在阳性对照组和阴性对照组的幼虫气管中未观察到特异荧光。
b)重组颗粒AaH‑IT1的致病作用
向其注入天然JcDNV的阳性对照组幼虫死于D+3和D+6PI(死亡率98％)。在向其注入编码蝎毒的重组颗粒的AaH‑IT1组幼虫中观察到了非常低的死亡率(15％)。幼虫的发育发生变化(脱毛和体重增加)。事实上，我们观察到阴性对照组的幼虫的体重与AaH‑IT1组的幼虫的体重之间有显著差异(学生t检验，p＜0.005)。
在阴性对照组没有进一步观察到死亡。
实施例8检查体内的非复制性质
在感染后6天处死感染有重组颗粒的幼虫。在PBS中研磨储存于‑20℃的其余幼虫部分。将上清液以5,000g澄清10分钟，然后用微量注射器以10μl的量注入草地贪夜蛾的夜蛾幼虫(孵化后7天)。注射之后，以人造培养基饲养幼虫并在26℃的烘箱中保持6天。
感染后6天，在假爪(false paw)取血细胞样品，在有100μl的TC100培养基和1％抗生素及0.03μM的PTU(N‑苯基硫脲)的96孔板中培养各幼虫的血液淋巴。培养后4小时立即用荧光显微镜观察血细胞。
回收血细胞之后，部分地解剖幼虫以分离下述不同组织：肠、气管、神经节和表皮。直接用荧光显微镜观察不同器官。
在注射有澄清的经研磨原初感染阳性幼虫的幼虫的血细胞和气管中未观察到荧光。
实施例9杆状病毒表达系统中非复制重组浓核病毒颗粒的产生
杆状病毒表达系统常常用于产生大量重组蛋白，因为其易于使用并且表达水平高。在杆状病毒表达系统中产生非复制重组浓核病毒颗粒的原则基于：
i)在市售表达载体pFastBacTM1中克隆浓核病毒的目的序列，
ii)使用系统(杆状病毒表达系统，INVITROGEN，USA)产生重组杆状病毒，以及最后
iii)纯化新形成的非复制重组浓核病毒颗粒。
根据与最初开发的相同的原则，即，用具有结构基因、非结构基因和重组基因组的三种质粒多重转染昆虫细胞，产生三种重组杆状病毒并用于昆虫细胞的多重感染。
1)构建体
所有产生的构建体源自含鹿眼蛱蝶浓核病毒(JcDNV)完整感染性序列(即在每一侧以5’和3’反向末端重复序列(ITR)为界的结构(VP)基因和非结构基因(NS))的质粒pBRJ‑H(Jourdan等，1990，Virology，第179卷，第403至409页；Rolling，1992，phD thesis at the University of Aix‑Marseille II，第153页)。
a‑具有补充序列的表达载体的构建体
表达载体(所谓的补充载体)具有受启动子控制的结构基因(VP)或也受启动子控制的非结构基因(NS)但不具有ITR序列。
使用整合有限制性位点NotI和XhoI(下面划线的序列)的引物，在通过PCR扩增包含同源启动子P93的NS序列之后得到具有NS基因而不具有ITR序列的表达载体(称为pFastBac‑NS)：
P93_NS_pFastBAC_F＝5’‑ATAAgCggCCgTTATTgTgACCTCgTTTgA‑3’(SEQ ID No.19)和
NS_pBAC_R＝5’‑CCgCTCgAgTTAAAATgTAATATTATATTTACTCAATAAA‑3’(SEQ ID No.20)                                               。
将所得片段插入表达载体pFastBacTM1的多克隆位点的NotI‑XhoI位点处。在同源启动子P93的控制下完成非结构基因(NS)的表达。
使用整合有限制性位点NotI和XhoI(下面划线的序列)的引物，在PCR扩增序列VP之后得到具有基因VP而没有ITR序列的表达载体，称为pFastBac‑VP：
VP_pFastBAC_F＝5’‑ATAAgCggCCgCATgTCTTTCTACACggCCgggT‑3’(SEQ ID No.21)和
VP_pFastBAC_R＝5’‑CCgCTCgAgTTAAACgTTACCAATAgTAgCTCCA‑3(SEQ ID No.22).
将所得片段插入表达载体pFastBacTM1的多克隆位点的NotI‑XhoI位点处。
在强异源启动子多角体蛋白(polyhedrin)(pPH)的控制下完成结构基因(VP)的表达。
b‑具有待衣壳化基因组的表达载体的构建
称为pFastBac‑ITR‑A3GFP的表达载体具有围绕表达盒A3‑GFP的JcDNV的ITR区。该构建体源自所述质粒pITR‑A3GFP‑BstEII。因此，使用整合有位点EcoRI和XhoI(下面划线的序列)的引物通过PCR扩增含ITR区和表达盒的序列：
A3GFP_pFastBAC_F＝5’‑CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC‑3’(SEQ ID No.23)和
A3GFP_pFastBAC_R＝5’‑CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg‑3’(SEQ IDNo.24).。
将所得片段插入表达载体pFastBacTM1的多克隆位点的EcoRI‑XhoI位点处。
将表达载体pFastBac‑NS、pFastBac‑VP和pFastBac‑ITR‑A3GFP转化入感受态细胞DH10Bac中以产生重组杆粒(bacmid)(BAC‑NS、BAC‑VP和BAC‑ITRA3GFP)。
2)重组杆状病毒的产生
首先通过用重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9来产生低滴度病毒储液。通过Western印迹评价NS、VP和GFP蛋白的表达。
由低滴度储液通过使它们顺序通过昆虫细胞来实施重组杆状病毒的扩增和高滴度病毒储液的产生。也通过定量PCR评估各重组杆状病毒的病毒滴度然后通过平板测定来确认。
3)通过用3种重组杆状病毒进行昆虫细胞Sf9的多重感染来产生非复制重组浓核病毒
使用高滴度重组杆状病毒储液进行昆虫细胞Sf9的多重感染。在该感染过程中产生非复制重组浓核病毒颗粒以及杆状病毒。
通过热进行DNV颗粒的纯化。的确，杆状病毒是衣壳化病毒并且因此并不非常耐热，这与非衣壳化病毒浓核病毒不同。GENETHON组系统地使用了该纯化方法。一旦实施了该纯化，则根据之前所使用的方法来表征和验证所产生的颗粒。