说明书抗IGF抗体
本申请是申请日为2009年12月11日、中国申请号为200980148017.9、发明名称为“抗IGF抗体”的发明申请的分案申请。
本发明涉及过度增殖疾病之疗法，特定言之，涉及癌症之疗法。
发明背景
胰岛素样生长因子-1(IGF-1；70个氨基酸之多肽)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2；67个氨基酸之多肽)为存在于血清中的7.5kD可溶性因子，其可强烈刺激多种哺乳动物细胞之生长(回顾于Pollack等人，2004)。IGF在分泌进入血流中后即与IGFBP形成复合物，从而防止其在去往靶组织之途中、在血清中发生蛋白水解性降解且防止其与IGF受体结合。亦已知IGF可在靶组织自身中以自分泌或旁分泌方式分泌。已知此过程可在正常胎儿发育期间发生，其中IGF对组织、骨和器官的生长起重要作用。其亦发现于许多癌组织中，其中咸信存在肿瘤细胞与基质细胞之间的旁分泌信号传导或肿瘤细胞自身的自分泌IGF产生(回顾于LeRoith D,2003)。
IGF-1和IGF-2能够结合许多正常组织上所表达的IGF-1受体(IGF-1R)，其在功能上为由具有相似亲和力之二聚合α-亚基和β-亚基组成的460kD异四聚体(Rubin等人，1995)。IGF-2亦可结合IGF-2受体，咸信此可防止IGF-2结合IGF-1R和经由IGF-1R进行信号传导。就此而言，IGF-2R已证明为肿瘤抑制蛋白。IGF-1R在结构上类似于呈两种形式即IR-A和IR-B存在的胰岛素受体，不同之处在于IR-A胞外域缺失可变剪接之12个氨基酸的外显子。IR-B为表达于大多数正常成人组织中的主要IR同功异型物，其作用为介导胰岛素对代谢之影响。另一方面，已知IR-A高度表达于正发育的胎儿组织中，而非成人正常组织中。最近研究亦已显示IR-A(而非IR-B)高度表达于某些癌症中。IR-A中外显子缺失不影响胰岛素结合，但引起小的构象变化，致使IGF-2结合其的亲和力比结合IR-B的亲和力高得多(Frasca等人，1999；Pandini等人，2002)。由于IR-A在癌组织中表达且更易与IGF-2结合，因此IR-A在癌症中介导IGF-2 之促有丝分裂效应可同IGF1-R一样重要。
IGF结合IGF-1R可触发复杂的胞内信号传导级联，导致刺激增殖和存活之蛋白质的活化(回顾于Pollack等人，2004)。
不同于EGFR和Her2neu受体，知癌症中不存在IGF1-R或IR-A受体之扩增，表明受体活化由活性配体的存在控制。大量的科学、流行病学和临床文献显示IGF在许多不同癌症类型之形成、进展和转移中之作用(回顾于Jerome等人，2003及Pollack等人，2004)。
举例而言，在结肠直肠癌中，IGF-2mRNA和蛋白质在临床结肠直肠肿瘤样品中之表达高于在相邻正常组织中之表达(Freier等人，1999；Li等人，2004)。在患有结肠直肠瘤之患者中，升高的IGF血清水平亦与增殖细胞指数正相关(Zhao等人，2005)。另外，升高的IGF-2循环水平与形成结肠直肠癌和腺瘤之升高的风险相关(Renehan等人，2000a)及b)；Hassan等人，2000)。IGF-2基因之亲本印记丧失(LOI)(导致IGF-2高表达之后生变异)为最近已在结肠直肠瘤和其它肿瘤类型之患者中鉴定的可遗传分子性状。IGF-2印记丧失已显示与结肠直肠瘤(Cui等人，2003；Cruz-Correa等人，2004)和腺瘤(Woodson等人，2004)之五倍风险相关。抗体靶向IGF-1Rα-亚基、从而阻断IGF结合且使受体内化已显示可延缓异种移植之来源于结肠癌之细胞系(诸如COLO205)的生长(Burtrum等人，2003)。
高IGF含量与人类肺腺癌的不良预后有关(Takanami等人，1996)且许多来源于SCLC和NSCLC之细胞系可表达和分泌IGF(Quinn等人，1996)。IGF-2之转基因过度表达在鼠类模型中诱发自发性肺肿瘤(Moorhead等人，2003)。就肝细胞癌(HCC)而言，HCC之人类临床样品和动物模型表达IGF mRNA和蛋白质的水平高于相应正常组织且此与肿瘤生长增强相关(Wang等人，2003；Ng等人，1998)。亦已显示IGF-2为HCC之血清学标记，与对照者相比，IGF-2在HCC患者血清中的水平更高(Tsai等人，2005)。
许多幼年期实体肿瘤(诸如尤因(Ewing)氏肉瘤和横纹肌肉瘤)之生长似乎特别依赖于IGF信号传导路径(Scotlandi等人，1996)。已显示IGF-2基因之LOI为胚胎横纹肌肉瘤形成中之初期遗传事件(Fukuzawa等人，1999)。在1型EWS-FLI1嵌合转录因子经由染色体转位加以表达(导致靶基因(包括IGF配体和IGF-1R)之表达升高和IGFBP-3之表达降低)的情况下，亦认为自分泌IGF信号传导可强烈影响尤因氏肉瘤生长。已显示靶向IGF-1R之抗体和小分子化合 物可降低异种移植之来源于小儿实体肿瘤之细胞系的生长(Kolb等人，2008；Manara等人，2007)。
已证明使用IGF配体特异性抗体可抑制植入SCID小鼠中之成人骨中之人类前列腺癌细胞的生长(Goya等人，2004)。另外，已证明相同IGF配体抗体可在鼠类异种移植系统中阻断IGF之旁分泌补给且抑制人类结肠直肠癌细胞之肝转移(Miyamoto等人，2005)。
亦有大量证据表明IGF信号传导系统降低癌症对化学治疗剂和辐射之敏感性。在此方面最早的发现之一为证实IGF-1R敲除小鼠胚胎难以藉由病毒、致癌基因和过度表达之生长因子受体转化(Sell等人，1993；Sell等人，1994)和IGF-1R之过度表达可保护细胞防止紫外线照射和γ辐射诱发之凋亡(Kulik等人，1997)。此外，使用分泌大量IGF-2之肝肿瘤细胞系，发现体外中和IGF-2可明显增强对化学治疗剂(诸如顺铂(cisplatin)和依托泊苷(etoposide))的反应，尤其在较低抑制细胞的剂量，表明IGF-2可降低对化学治疗剂的敏感性(Lund等人，2004)。与此等发现一致，已证明靶向IGF-1R之抗体可使肿瘤异种移植物对化学治疗药物和辐射之生长抑制作用的敏感性增强(Goetsch等人，2005)。
已报导许多抗体显示与人类IGF-1和人类IGF-2交叉反应性结合。抗体sm1.2系针对人类IGF-1产生，显示与人类IGF-2之40%交叉反应性，且显示可抑制以20ng/mL人类IGF-1刺激之小鼠成纤维细胞细胞系BALB/c3T3之增殖(Russell等人，1984)。在一项设计藉由产生针对完整IGF-1蛋白质和该蛋白质之一部分的单克隆抗体而在功能上对IGF-1表位定位的研究中，已鉴定出许多可与IGF-2交叉反应的抗体(Manes等人，1997)。与IGF-2交叉反应百分率范围为0至800%，已鉴定出几种与IGF-1和IGF-2相等反应的抗体。KM1486为可与人类IGF-1和IGF-2交叉反应之大鼠单克隆抗体，且已证实KM1486可抑制植入非肥胖糖尿病/严重复合型免疫缺陷小鼠中之成人骨中的人类前列腺癌细胞的生长(Goya等人，2004)。另外，已证实KM1486可抑制人类结肠直肠癌之肝转移(Miyamoto等人，2005)。KM1486亦已描述于WO03/093317、JP2003-310275、WO2005/018671、WO2005/028515及WO2005/027970中。
就治疗人类疾病而言，非常需要具有完全人类序列之抗体以使产生人类抗抗体反应和中和抗体之风险减至最低程度，产生人类抗抗体反应和中和抗体会快速消除体内所施用之抗体且因此降低治疗作用。因此(及鉴于IGF-1和 IGF-2依赖性信号传导在癌症形成和进展中起作用)，需要获得完全人类抗体。WO2007/070432描述共中和两种配体之促有丝分裂效应的完全人类抗体。
本发明之一目标系提供具有高亲和力之替代性人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供对IGF-1具有高亲和力之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供对IGF-1和对IGF-2具有高亲和力之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供对IGF-1和对IGF-2具有适当相对亲和力之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供对IGF-1的亲和力比对IGF-2的亲和力要高的人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供具有高IGF-1中和效力之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供具有高IGF-1和IGF-2中和效力之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系提供具有高溶解度和稳定性之人类抗IGF抗体。
本发明之另一目标系获得不影响胰岛素与其受体结合之抗体。
藉由药物活性之药效学生物标记可有助于临床开发治疗剂。使用靶向IGF-1R之抗体的临床研究已证明总血清IGF-1水平之增加可为此等药剂之适用药效学标记(Pollack等人，2007)。总血清IGF-1水平增加的原因可能系由于涉及垂体生长激素(GH)分泌的反馈机制，该反馈机制促使IGF-1与IGFBP自肝脏释放。事实上，已在人类中证明占总IGF-1水平仅约1%之游离或生物活性IGF-1决定该反馈反应(Chen等人，2005)。
因此本发明之另一目标系提供一种伴有生物标记之疗法(该生物标记容许对该疗法之有效性进行药理学监测)，用于治疗疾病形成和/或进展在病因上与IGF相关的疾病。
在本发明实验中，可证明总血清IGF-1水平随本发明抗IGF抗体之应用而升高。因此，总IGF-1水平为抗IGF抗体疗法之有效性的适用药效学标记。因此非常有利的是本发明之抗体与适合动物物种(例如小鼠或大鼠)之IGF发生交叉反应，使得药效学效应已可在临床前进行测试。
“总IGF-1水平”系指血浆或血清中IGF-1之相加量，包含结合血清结合蛋白之IGF-1加上游离(未结合)IGF-1之量。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种测定可结合IGF-1和IGF-2之抗体 分子治疗癌症患者之有效性的方法。在该方法第一步骤中，测量患者生物样品(例如血清或血浆)中总IGF-1水平。接着施用抗体分子且随后经过一段足以使治疗性抗体发挥其效应的时间后，再次测定总IGF-1水平。总IGF-1水平比第一步骤中所测得之总IGF-1水平相增加之量指示患者对该抗IGF抗体分子发生反应的程度。此方法优选用于监测施用本发明抗体之疗法。
附图简述
图1A-1G显示命名为60814、60819和60833之IgG1抗体针对人类IGF-1(图1A)、小鼠IGF-1(图1B)、大鼠IGF-1(图1C)、人类IGF-2(图1D)、小鼠IGF-2(图1E)、大鼠IGF-2(图1F)和人类胰岛素(图1G)之ELISA结合滴定。
图2A-2B显示使用基于细胞之ELISA，抗体60833中和IGF-1(20ng/mL)(图2A)和IGF-2(100ng/mL)(图2B)诱发之IGF-1R磷酸化的典型滴定。
图3A显示抗体60833中和IGF-2(100ng/mL)诱发之IR-A磷酸化之典型滴定。图3B显示抗体60833中和人类血清(20%)诱发之IGF-1R磷酸化之典型滴定。两检定均使用基于细胞之ELISA来进行。
图4A-4D显示抗体60814和60819对IGF-1(图4A和4C)和IGF-2(图4B和4D)刺激之MCF-7(图4A和4B)和COLO205(图4C和4D)细胞增殖的影响。
图5显示在10%生长培养基中，抗体60819和60833对来源于尤因氏肉瘤之细胞系TC-71增殖的影响。
图6显示施用25mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3.13mg/kg单次剂量后24小时，抗体60819对鼠类总血清IGF-1水平的影响；0mg/kg代表抗体处理前的总血清IGF-1水平；
图7显示藉由10分钟静脉内输注施用30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg单次剂量后24小时，抗体60819对大鼠总血浆IGF-1水平的影响。0mg/kg代表抗体处理前的总血清IGF-1水平。
图8说明在含有10%FCS之生长培养基中，抗体60819和雷帕霉素(rapamycin)(单独或组合)对来源于尤因氏肉瘤之细胞系SK-ES-1之增殖的影响。
图9显示抗体60819和雷帕霉素(单独或组合)对AKT磷酸化和PTEN水平的影响。
图10说明在含有10%FCS之生长培养基中抗体60819和埃罗替尼 (erlotinib)/得舒缓(Tarceva)(单独或组合)对来源于NSCLC之细胞系A-549之增殖的影响。
图11显示人类IGF-1之3D结构，其中突出显示（深灰色）了被抗体60833结合之氨基酸。在下面显示了人类IGF-1之线性氨基酸序列，其中与抗体60833相互作用之氨基酸标有下划线。
图12A-12B显示抗体60814(图12A)、60819(图12B)和60833(图12C)之可变链之氨基酸和DNA序列；CDR呈粗体字。
发明概述
一方面，本发明涉及一种分离之人类抗体分子，其
a)可结合人类IGF-1和IGF-2，以便
i)防止IGF-1和IGF-2与IGF-1受体结合，及
ii)抑制IGF-1受体介导之信号传导，
b)可结合小鼠和大鼠IGF-1和IGF-2，
c)不结合人类胰岛素；
其中该抗体分子系选自包含以下之组：
i)重链CDR包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)和SEQ ID NO:3(CDR3)之氨基酸序列且轻链CDR包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)和SEQ ID NO:6(CDR3)之氨基酸序列的抗体分子；
ii)重链CDR包含SEQ ID NO:11(CDR1)、SEQ ID NO:12(CDR2)和SEQ ID NO:13(CDR3)之氨基酸序列且轻链CDR包含SEQ ID NO:14(CDR1)、SEQ ID NO:15(CDR2)和SEQ ID NO:16(CDR3)之氨基酸序列的抗体分子；
iii)重链CDR包含SEQ ID NO:21(CDR1)、SEQ ID NO:22(CDR2)和SEQ ID NO:23(CDR3)之氨基酸序列且轻链CDR包含SEQ ID NO:24(CDR1)、SEQ ID NO:25(CDR2)和SEQ ID NO:26(CDR3)之氨基酸序列的抗体分子。
另一方面，本发明涉及一种抗IGF抗体分子，其中该抗体分子具有包含SEQ ID NO:1(CDR1),SEQ ID NO:2(CDR2)和SEQ ID NO:3(CDR3)之氨基酸序列的重链CDR及包含SEQ ID NO:4(CDR1),SEQ ID NO:5(CDR2)和SEQ ID NO:6(CDR3)之氨基酸序列的轻链CDR。
另一方面，本发明涉及一种抗IGF抗体分子，其中该抗体分子具有包含SEQ ID NO:11(CDR1),SEQ ID NO:12(CDR2)和SEQ ID NO:13(CDR3)之氨基酸序列的重链CDR及包含SEQ ID NO:14(CDR1),SEQ ID NO:15(CDR2)和SEQ ID NO:16(CDR3)之氨基酸序列的轻链CDR。
另一方面，本发明涉及一种抗IGF抗体分子，其中该抗体分子具有包含SEQ ID NO:21(CDR1),SEQ ID NO:22(CDR2)和SEQ ID NO:23(CDR3)之氨基酸序列的重链CDR及具有包含SEQ ID NO:24(CDR1),SEQ ID NO:25(CDR2)和SEQ ID NO:26(CDR3)之氨基酸序列的轻链CDR。
另一方面，本发明涉及抗IGF抗体分子，其具有重链和轻链或CDR，它们具有如图12A-12C所绘之氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及一种抗IGF抗体分子，其中该抗体分子结合IGF-1内之非线性表位，其包含人类IGF-1(SEQ ID NO:43)之氨基酸序列LCGAELVDALQFVCGDR(SEQ ID NO:41)和CCFRSCDLRRLEM(SEQ ID NO:42)。在一个优选实施方案中，该抗体分子接触人类IGF-1(SEQ ID NO:43)之氨基酸序列LCGAELVDALQFVCGDR(SEQ ID NO:41)内之至少8个氨基酸和氨基酸序列CCFRSCDLRRLEM(SEQ ID NO:42)内之至少10个氨基酸。在另一个优选实施方案中，此类抗IGF抗体分子接触人类IGF-1(SEQ ID NO:43)之Leu(5),Cys(6),Glu(9),Leu(10),Asp(12),Ala(13),Phe(16),Val(17),Arg(21),Cys(47),Cys(48),Phe(49),Ser(51),Cys(52),Asp(53),Leu(54),Arg(55),Leu(57)和Glu(58)，如藉由X-射线晶体学测定的。一种相应方法披露于本文实施例9中。优选地，该抗体分子具有包含SEQ ID NO:21(CDR1),SEQ ID NO:22(CDR2)和SEQ ID NO:23(CDR3)之氨基酸序列的重链CDR及具有包含SEQ ID NO:24(CDR1),SEQ ID NO:25(CDR2)和SEQ ID NO:26(CDR3)之氨基酸序列的轻链CDR。
抗体之结合系定义为经由非共价键发生的相互作用，该等非共价键使抗原(或结构上相似之蛋白质或其片段)占据抗体结合位点，亦即与适当抗原(或结构上相似的蛋白质)之决定子结合之免疫球蛋白区域。
亲和力(亦即抗体上之单个抗原结合位点与单个表位之间的相互作用)系藉由结合常数KA=kass/kdiss或解离常数KD=kdiss/kass表示。
一方面，根据a)，抗体以0.02nM至20nm，例如0.2nM至约2nM范围内 之KD值之亲和力，例如以0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1.0nM之亲和力结合各种IGF蛋白，如藉由表面等离振子共振分析所测定。基于此性质实现IGF功能信号传导之中和。
一方面，根据c)，在为结合人类IGF-1或IGF-2所需之最小浓度之至少100倍的浓度，抗体不结合人类胰岛素。
另一方面，c)中定义之抗IGF抗体分子之性质可如下表征：抗IGF抗体分子对IGF-1和IGF-2之亲和力分别为其对胰岛素之亲和力的至少100倍及甚至1000倍以上。若不能完全排除弱结合，则抗IGF抗体分子在治疗性剂量不结合胰岛素，即使在极高剂量(例如超过100mg/kg)。
在一个实施方案中，本发明之抗体分子不影响人类胰岛素藉由与胰岛素受体结合所介导之促有丝分裂性质。(一般而言，促有丝分裂性质系定义为化合物能够促进细胞开始细胞分裂、从而触发有丝分裂，例如就胰岛素而言，其能够促进细胞生长)。
在另一个实施方案中，本发明之抗体除能够抑制经由IGF-1受体介导之IGF信号传导之外，亦能够抑制经由胰岛素受体IR-A介导之IGF-2信号传导。
本发明之抗体具有高得惊人的对IGF-1和IGF-2的中和效力。此外，它们对IGF-1的效力和结合亲和力出乎意料地比对IGF-2的效力和结合亲和力要高。它们具有高溶解度和稳定性，它们在可变域中没有不想要的糖基化或水解基序，而且具有长循环半衰期。
发明详述
在下文中，可结合人类IGF-1和IGF-2之本发明抗体分子系称为“抗IGF抗体分子”。
术语“抗IGF抗体分子”涵盖人类抗IGF抗体、抗IGF抗体片段、抗IGF抗体样分子和任何上述抗体分子之缀合物。抗体在本发明中之含义中包括(但不限于)单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和双特异性或多特异性抗体。术语“抗体”涵盖由淋巴细胞产生且例如存在于血清中之完整免疫球蛋白、由杂交瘤细胞系分泌之单克隆抗体、由宿主细胞中重组表达产生的具有免疫球蛋白或单克隆抗体之结合特异性之多肽，和来源于该等免疫球蛋白、单克隆抗体或多肽、经进一步加工且同时保持其结合特异性之分子。
详言之，术语“抗体分子”优选包括包含两个重链和两个轻链之完全人 类完整免疫球蛋白。
在另一个方面，抗体分子为具有抗原结合区之抗IGF抗体片段。为获得抗体片段(例如Fab片段)，可藉助于常规技术(例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)进行消化。木瓜蛋白酶消化之实例系描述于WO94/29348及US4,342,566中。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个各自具有单个抗原结合位点的相同抗原结合片段(所谓Fab片段)，和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍然能使抗原交联之F(ab')2片段。抗体片段亦可由产生相应编码DNA片段之分子生物学方法生成。
Fab片段亦含有轻链之恒定域和重链之第一恒定域(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段之处在于，其在重链CH1域之羧基末端含有其它残基，包括一或多个来自抗体铰链区之半胱氨酸。Fab'-SH在本文中系指其中恒定域之半胱氨酸残基带有游离硫醇基之Fab'。F(ab')2抗体片段最初呈其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对之形式产生。
结合抗原之抗体片段或抗体样分子(包括单链抗体和线性抗体，如Zapata等人，1995中所述)可在单一多肽上包含单独之可变区或与以下之整体或一部分组合之可变区：轻链之恒定域、CH1、铰链区、CH2和CH3域，例如所谓“SMIP”(“小模块免疫药物(Small Modular Immunopharmaceutical)”)，其为采用单一多肽链作为其结合域Fv之抗体样分子，该单一多肽链连接至单链铰链和缺少恒定域CH1之效应域(WO02/056910)。SMIP可呈单体或二聚体形式制备，但其并不呈现传统抗体之二聚体之二聚体结构。本发明亦包括包含可变区与轻链之恒定域区、VH1、CH1、铰链区、CH2和CH3域之任何组合的抗原结合片段。
只要抗体片段或抗体样分子显示与IGF-1/IGF-2抗原之相关部分特异性结合，则该等抗体片段或抗体样分子可含有恒定区之全部或仅一部分。若不需要诸如补体结合或抗体依赖性细胞毒性之效应功能，则选择恒定区类型和长度主要视抗体蛋白之所需药理学性质而定。抗体分子通常为由两个轻链/重链对组成之四聚体，但亦可为二聚体，亦即由一个轻链/重链对组成之二聚体，例如Fab或Fv片段，或其可为单体单链抗体(scFv)。
抗IGF抗体样分子亦可为单域抗体(例如所谓“纳米抗体”)，其在单Ig样域中包含抗原结合位点(描述于例如WO03/050531及Revets等人，2005中)。抗体样分子之其它实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF；Srinivasan和Roeske,2005) 或含有CDR或CDR移植之分子或“域抗体”(dAb)。dAB为抗体之功能结合单位，相当于人类抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。域抗体具有约13kDa之分子量或小于完整抗体尺寸之十分之一。已开发出一系列大型且功能齐全的完全人类VH和VL dAb文库。dAB亦可用于“双重靶向”，亦即除IGF-1/IGF-2外，dAb亦可结合一个分子中之另一标靶。dAb文库、选择和筛检方法、用于双重靶向和延长血清半衰期之dAb形式描述于例如US6,696,245、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609中。
一般而言，抗体片段和抗体样分子较好地表达于细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中。
在一个优选实施方案中，如上文i)中所定义之本发明抗体分子具有包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列(此序列可在其C末端含有额外的Gln。根据Kabat编号方案，此氨基酸位置可视为可变区之C末端，或者，根据序列表中之序列，其可表示恒定轻链的第一个氨基酸，参见SEQ ID NO:34)的可变轻链。
可变重链包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列且可变轻链包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列的抗体优选具有IgG1恒定重链区。该抗体优选具有Igλ恒定轻链区。该抗体优选为命名为60814之抗体，其具有包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列的轻链恒定区。命名为60814之抗体的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO:35(重链)和SEQ ID NO:36(轻链)中。
在另一个优选实施方案中，如上文ii)中所定义之本发明抗体分子具有包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:20之氨基酸序列(此序列可在其C末端含有额外的Gln。根据Kabat编号方案，此氨基酸位置可视为可变区之C末端，或者，根据序列表中之序列，其可表示恒定轻链的第一个氨基酸，参见SEQ ID NO:34)的可变轻链。
可变重链包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列且可变轻链包含SEQ ID NO:20之氨基酸序列的抗体优选具有IgG1恒定重链区。该抗体优选具有Igλ恒定轻链区。该抗体优选为命名为60819之抗体，其具有包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列的轻链恒定区。命名为60819之抗体的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO:37(重链)和SEQ ID NO:38(轻链)中。
在另一个优选实施方案中，如上文iii)中所定义之本发明抗体具有包含SEQ ID NO:28之氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列(此序列可在其C末端含有额外的Gln。根据Kabat编号方案，此氨基酸位置可视为可变区之C末端，或者，根据序列表中之序列，其可表示恒定轻链的第一个氨基酸，参见SEQ ID NO:34)的可变轻链。
可变重链包含SEQ ID NO:28之氨基酸序列且可变轻链包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列的抗体优选具有IgG1恒定重链区。该抗体优选具有Igλ恒定轻链区。该抗体优选为命名为60833之抗体，其具有包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列的轻链恒定区。命名为60833之抗体的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO:39(重链)和SEQ ID NO:40(轻链)中。
本发明抗体与小鼠和大鼠IGF-1交叉反应可容许检查其在此等物种中的内分泌影响，例如对生长激素路径的影响。由于大鼠为优选用于药物开发以研究毒理学效应的优良动物模型，因此可与大鼠IGF交叉反应尤其有利。
可能由于移除游离IGF-1引起经由生长激素路径的反馈调节、导致肝脏分泌IGF-1增加，因此所观察到的抗体对总IGF-1水平之药效学效应为适用之药效学标记。在动物物种中利用该标记(容许在药物开发早期判定剂量/效应关系)有助于准备I期临床研究，其中除PK分析之外，亦监测患者对总IGF-1水平的药效学反应。
本发明之抗IGF抗体分子亦可为序列表中所示之氨基酸序列所定义之抗体的变异体。因此，本发明亦包含作为具有上文a)至c)所定义之特征之此等多肽变异体的抗体。熟习此项技术者使用常用技术将可制备、测试和使用抗体60814、60819和60833之功能性变异体。实例为CDR和/或框架中至少一个位置改变之变异抗体；框架区中存在与种系序列不符之单氨基酸取代之变异抗体；具有保守氨基(酸)取代之抗体；由在严格条件下与序列表中所述之编码60814、60819或60833抗体可变链之DNA分子杂交之DNA分子所编码之抗体；60814、60819和60833之功能上等效之密码子最优化变异体。
亦可藉由使用本发明之抗体作为最优化之起始点且多样化一或多个氨基酸残基，优选多样化一或多个CDR中之氨基酸残基并针对性质改良之变异体筛检所得抗体变异体群来获得变异体。尤其优选为多样化可变轻链之CDR3、可变重链之CDR3、可变轻链之CDR1和/或可变重链之CDR2中的一 或多个氨基酸残基。可藉由此项技术中已知之方法进行多样化，例如WO2007/042309中提及之所谓TRIM技术。
在给定个别氨基酸性质的情况下，可进行合理取代以获得保留抗体60814、60819或60833整体分子结构之抗体变异体。氨基酸取代(意即“保守取代”)可例如基于各氨基酸之极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质之相似性进行。熟习此项技术者熟知通常实施之氨基酸取代(例如WO2007/042309中所描述)和获得如此经修饰之抗体的方法。在给定遗传密码与重组和合成DNA技术的情况下，可常规地设计编码具有一或多处保守氨基酸交换之变异抗体的DNA分子且容易获得各抗体。
优选抗体变异体在可变区中具有至少60%，更优选至少70%或80%，仍更优选至少90%且最优选至少95%之序列同一性。优选抗体在可变区中亦具有至少80%，更优选为90%且最优选为95%之序列相似性。
(两个多肽序列间之“序列同一性”表示两个序列间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”表示相同氨基酸的百分比或显示保守氨基酸取代之氨基酸的百分比。)
在另一个实施方案中，本发明之抗IGF抗体分子为“亲和力成熟”抗体。
“亲和力成熟”抗IGF抗体为来源于亲本抗IGF抗体(例如60814、60819或60833)的抗IGF抗体，其在一或多个CDR中具有一或多个变异或其中一或多个完整CDR已置换，引起对抗原之亲和力改良(与各亲本抗体相比)。产生该等抗体突变体之程序之一包括噬菌体展示(Hawkins等人，1992及Lowman等人，1991)。简言之，使多个高变区位点(例如6-7个位点)发生突变以在各位点产生所有可能之氨基酸取代。如此所产生之抗体突变体以单价方式、以与封装于各粒子中之M13之基因III产物之融合体形式自丝状噬菌体粒子中展示。接着如本文所揭示，针对突变体之生物活性(例如结合亲和力)筛检噬菌体展示之突变体。
亦可藉由以下文献中所述之方法产生亲和力成熟抗体：例如Marks等人，1992(藉由可变重链(VH)和可变轻链(VL)域改组进行亲和力成熟)；或Barbas等人，1994；Shier等人，1995；Yelton等人，1995；Jackson等人，1995及Hawkins等人，1992(CDR和/或框架残基之随机诱变)。优选亲和力成熟抗体将具有针对靶抗原之极高亲和力，例如低皮摩尔浓度。
本发明亦关于编码本发明抗IGF抗体分子之DNA分子。此等序列包括(但 不限于)如序列表中所示之编码抗体60814、60819和60833之彼等DNA分子：分别编码抗体60814可变重链和轻链之SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9；分别编码抗体60819可变重链和轻链之SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19；分别编码抗体60833可变重链和轻链之SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29。
编码可变轻链之SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19和29中所示之序列可在其3'端含有额外的Gln密码子。
因此，本发明亦关于可在高严格度之结合和洗涤条件(如WO2007/042309中所定义)下与序列表中所述之DNA分子杂交的核酸分子，其中该等核酸分子编码具有等效于或优于抗体60814、60819或60833之性质的抗体或其功能片段。优选分子(自mRNA角度)为与本文所述之DNA分子之一具有至少75%或80%(优选至少85%，更优选至少90%且最优选至少95%)同源性或序列同一性之彼等分子。
属于本发明范畴内之又一类DNA变异体可参照其编码之多肽来定义。此等DNA分子就其序列而言有别于序列表中所述之彼等序列(分别为SEQ ID NO:7、17和27，或9、19、29)，但由于遗传密码之简并，此等DNA分子分别编码之抗体具有抗体60814、60819或60833之相同氨基酸序列。举例而言，由于在真核细胞中表达抗体60814、60819或60833，编码可变轻链之最后三个氨基酸的最后九个核苷酸可分别设计成匹配真核细胞密码子选择。若需要在大肠杆菌中表达抗体，则可改变此等序列以匹配大肠杆菌密码子选择。
本发明之DNA分子变异体可以WO2007/042309中所述之多种不同方法建构。
产生本发明之重组抗IGF抗体分子时，将编码全长轻链(在抗体60814的情况下，序列包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:33)和重链(在抗体60814的情况下，序列包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:31)之DNA分子(cDNA和/或基因组DNA)或其片段插入表达载体内以使得序列可操作地连接至转录和/或翻译控制序列。在抗体60819的情况下，序列分别为SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:33以及SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:31之彼等序列；在抗体60833的情况下，序列分别为SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:33以及SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:31之彼等序列。
制造本发明之抗体时，熟习此项技术者可自此项技术中熟知之多种表达系统(例如Kipriyanow和Le Gall,2004所评述之彼等表达系统)中选择。
在另一个方面，本发明涉及一种表达载体，其含有一种DNA分子，该DNA分子包含如上所述之抗体分子之可变重链和/或可变轻链的编码核苷酸序列。优选地，此类表达载体含有一种DNA分子，该DNA分子包含SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:9之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:19之序列，或包含SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:29之序列。优选地，此类表达载体另外包含一种分别编码恒定重链和/或恒定轻链的DNA分子，该DNA分子连接至分别编码可变重链和/或可变轻链之DNA分子。
表达载体包括质粒、反转录病毒、粘粒、来源于EBV之附加体等等。表达载体和表达控制序列经选择可与宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入独立载体中。在某些实施方案中，将两种DNA序列插入同一表达载体中。适宜之载体为编码功能完整之人类CH(重链恒定区)或CL(轻链恒定区)免疫球蛋白序列之彼等载体，其中适当限制性位点经工程改造以使任何VH(重链可变区)或VL(轻链可变区)序列可如上所述容易插入和表达。在抗体具有60814、60819和60833之可变区的情况下，对于抗体轻链而言，恒定链通常为κ或λ，对于抗体重链而言，其可为(不限于)任何IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其它免疫球蛋白(包括等位基因变异体)。
重组表达载体亦可编码促进宿主细胞分泌抗体链之信号肽。编码抗体链之DNA可克隆于载体中以使信号肽同框连接至成熟抗体链DNA之氨基端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或非免疫球蛋白之异源肽。或者，编码抗体链之DNA序列可已含有信号肽序列。
除抗体链DNA序列外，重组表达载体含有调控序列，包括启动子、增强子、终止和聚腺苷酸化信号和其它控制宿主细胞中抗体链表达之表达控制组件。启动子序列之实例(针对在哺乳动物细胞中表达来例示)为来源于CMV(诸如CMV猿病毒40(SV40)启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤（病毒）之启动子和/或增强子和强哺乳动物启动子(诸如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子)。聚腺苷酸化信号之实例为BGH polyA、SV40晚期或早期polyA；或者，可使用免疫球蛋白基因等之3′UTR。
重组表达载体亦可含有调控宿主细胞中载体复制之序列(例如复制起点)和可选择之标记基因。编码抗IGF抗体重链或其抗原结合部分和/或抗IGF抗体轻链或其抗原结合部分之核酸分子和包含此等DNA分子之载体可根据此项技术中熟知之转染方法(包括脂质粒介导之转染、聚阳离子介导之转染、 原生质粒融合、显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔或藉由病毒载体的转移)引入宿主细胞(例如细菌细胞或高等真核细胞，例如哺乳动物细胞)中。
编码重链和轻链之DNA分子优选存在于两个共转染至宿主细胞(优选为哺乳动物细胞)中之载体中。
在另一个方面，本发明涉及一种携带一或多个如上所述之表达载体的宿主细胞，优选为哺乳动物细胞。
可用作表达宿主之哺乳动物细胞系在此项技术中已熟知且尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类癌细胞(例如Hep G2和A-549细胞)、3T3细胞或任何该类细胞系之衍生物/后代。可使用其它哺乳动物细胞，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、猴和啮齿动物细胞系，或其它真核细胞，包括(但不限于)酵母、昆虫和植物细胞，或诸如细菌之原核细胞。藉由将宿主细胞培养足以使抗体分子在宿主细胞中表达之时间来产生本发明之抗IGF抗体分子。
如此，在另一个方面，本发明涉及一种产生如上所述之抗体分子的方法，其包含用一或多个如上所述之载体转染哺乳动物宿主细胞，培育该宿主细胞，及回收并纯化该抗体。在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生如上所述之抗体的方法，其包含获得包含一或多个如上所述之载体的哺乳动物宿主细胞，及培育该宿主细胞。在另一个实施方案中，该方法进一步包含回收并纯化该抗体。
抗体分子优选作为分泌型多肽自培养基中回收，或若例如表达时无分泌信号，则其可自宿主细胞溶胞物中回收。必须使用重组蛋白和宿主细胞蛋白所用之标准蛋白质纯化方法、以获得实质上均质之抗体制剂的方式纯化抗体分子。举例而言，适用于获得本发明抗IGF抗体分子之最新纯化方法包括自培养基或溶胞物中移除细胞和/或微粒细胞碎片作为第一步骤。接着自污染之可溶蛋白质、多肽和核酸中纯化抗体，例如在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、逆相HPLC、Sephadex层析、在硅土或阳离子交换树脂上层析。在获得抗IGF抗体分子制剂之过程中，作为最后步骤，可如下所述干燥(例如冻干)纯化之抗体分子以用于治疗应用。
在一个实施方案中，本发明之抗IGF抗体分子可藉由一系列现有技术纯化步骤来纯化，包括亲和层析(重组蛋白A)、低pH病毒灭活、深度过滤(depth filtration)、阳离子交换层析、阴离子交换层析、纳米过滤、和30kD超滤/渗 滤(Shukla等人，2007)。
在另一个方面，本发明涉及供医药中使用的一种如上所述之抗体分子。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其含有本发明之抗IGF抗体分子、优选完全抗体作为活性成份。
为在治疗中使用，将抗IGF抗体分子包括于适当药物组合物中以便于施用于动物或人类。典型之抗IGF抗体分子调配物可藉由使抗IGF抗体分子与生理学可接受载剂、赋形剂或稳定剂混合而制备为冻干或其它干燥调配物或水溶液或水性或非水性悬浮液之形式。在所用剂量和浓度，载剂、赋形剂、调节剂或稳定剂系无毒的。其包括缓冲系统，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它无机或有机酸及其盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯己双胺(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖、寡糖或多糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或离子或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM(聚山梨酯)、PLURONICSTM或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。抗体调配物亦可含有诸如乙醇或异丙醇之有机溶剂。赋形剂亦可具有释放调节或吸收调节功能。
抗IGF抗体分子亦可干燥(冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、藉由近临界或超临界气体干燥、真空干燥、风干)、沉淀或结晶，或截留于微胶囊(分别使用例如羟基甲基纤维素或明胶和聚(甲基丙烯酸甲酯)、例如藉由凝聚技术或界面聚合而制得)中、于胶状药物传递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中、于粗滴乳液中，或沉淀或固定化于载剂或表面上，例如pcmc技术(蛋白质包被微晶(protein coated microcrystal))。该等技术揭示于Remington,2005中。
用于体内施用之调配物当然必须为无菌的；可藉由习知技术(例如经由无菌过滤膜过滤)实现灭菌。
增大抗IGF抗体之浓度可用于达成所谓的高浓度液体调配物(HCLF)；各 种产生该等HCLF之方法已有描述。
抗IGF抗体分子亦可含于持续释放型制剂中。该等制剂包括疏水或亲水聚合物之固体、半固体或液体基质，且可呈成形制品之形式(例如膜、药卷(stick)或微胶囊)且可经施药装置施加。持续释放型基质之实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯或蔗糖乙酸丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(US3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶在更短时期内释放蛋白质。当囊封抗体长时间留于体内时，其因在37℃暴露于水分而会变性或聚集，导致生物活性损失和可能之免疫原性变化。视所涉及机制而定，可设计合理策略来实现稳定化。举例而言，若发现聚集机制为经由硫基-二硫化物互换形成分子间S-S键，则可藉由修饰硫氢基残基、由酸性溶液冻干(例如WO89/011297中所述)、控制水分含量、使用适当添加剂和形成特定聚合物基质组合物来达成稳定。
US7,060,268及US6,991,790中描述的调配物亦可用于本发明抗IGF抗体分子。
IGF抗体分子亦可并入其它施药形式，诸如分散体、悬浮液或脂质体、片剂、胶囊剂、粉剂、喷雾剂、有或无渗透增强装置之经皮或皮内贴片或乳膏、糯米纸囊剂(wafer)、鼻、颊或肺部调配物，或可藉由植入之细胞产生，或在基因治疗后藉由个体自身细胞产生。
抗IGF抗体分子亦可用化学基团(诸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团)衍生化。该等基团可适用于改进抗体之生物学特征，例如延长血清半衰期或增加组织结合。
优选施药模式为胃肠外(静脉内、肌内、皮下、腹膜内、皮内)输注或注射，但其它施药模式(诸如吸入、经皮、鼻内、含服、口服)亦可适用。
在一个优选实施方案中，本发明之药物组合物含有10mg/ml浓度之抗IGF抗体(例如抗体60814、60819或60833)且进一步包含25mM柠檬酸钠pH6、115mM NaCl、(聚山梨醇20)。
在另一个实施方案中，本发明之药物组合物系一种水溶液，其含有10mg/ml浓度之抗IGF抗体(例如抗体60814、60819或60833)，且进一步包含25 mM组氨酸HCl pH6、38.8g/L甘露醇、9.70g/L蔗糖、和聚山梨酯20)。
静脉内输注时，本发明之药物组合物可以用生理溶液例如用0.9%氯化钠或G5溶液稀释。
药物组合物可冷冻-干燥并在使用前用注射用水(WFI)重建。
预防或治疗疾病时，抗体之适当剂量将视以下因素而定：欲治疗之疾病类型、疾病之严重程度和病程、抗体施用系出于预防或治疗目的、先前疗法、患者临床病史和对抗体之反应及主治医师之判断。抗体宜一次性或经一系列治疗而施用于患者。
视疾病之类型和严重程度而定，无论例如经一或多次分开施用或连续输注(1小时的输注)，约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg至15mg/kg)抗体为向患者施用之最初候选剂量。视上述因素而定，典型治疗进度通常包括以约0.1μg/kg至约20mg/kg或20mg/kg以上范围内之剂量每周施用抗体一次至每三周施用一次。例如，每周剂量可以为5、10、或15mg/kg。该疗法之进程易由习知技术和检定监测。
欲施用之抗体之“治疗有效量”为预防、改善或治疗疾病或病症所需之最低量。
本发明之抗IGF抗体分子及含有其之药物组合物适用于治疗过度增殖病症。
在某些实施方案中，过度增殖病症为癌症。
癌症系依两种方式分类：癌症发起之组织之类型(组织类型)和癌症首先发生之原发部位或体内位置。癌症发生之最常见部位包括皮肤、肺、乳房/乳腺、前列腺、结肠和直肠、子宫颈和子宫。
本发明之抗IGF抗体分子适用于治疗各种癌症，包括(但不限于)以下各种癌症：
●AIDS相关之癌症，诸如卡波西(Kaposi)氏肉瘤；
●骨相关癌症，诸如尤因氏家族之肿瘤和骨肉瘤；
●脑相关癌症，诸如成人脑瘤、幼年期脑干神经胶质瘤、幼年期小脑星形细胞瘤、幼年期大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、幼年期室管膜瘤、幼年期成神经管细胞瘤、幼年期幕上原始神经外胚层瘤、幼年期视路和下丘脑神经胶质瘤和其它幼年期脑瘤；
●乳腺癌；
●消化道/胃肠相关癌症，诸如肛门癌、肝外胆管癌、胃肠类癌瘤、胃肠基质瘤(GIST)、胆管癌、结肠癌、食管癌、胆囊癌、成人原发性肝癌(肝细胞癌、肝母细胞瘤)、幼年期肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和胃癌；
●内分泌相关癌症，诸如肾上腺皮质癌、胃肠类癌瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰)、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤和甲状腺癌；
●眼睛相关癌症，诸如眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；
●生殖泌尿相关癌症，诸如膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、威尔姆斯氏(Wilms)肿瘤和其它幼年期肾肿瘤；
●生殖细胞相关癌症，诸如幼年期颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤和睾丸癌；
●妇科癌症，诸如子宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养层瘤(gestational trophoblastic tumour)、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、低恶性潜在卵巢瘤(ovarian low malignant potential tumour)、子宫肉瘤、阴道癌和阴门癌；
●头颈相关癌症，诸如下咽癌、喉癌、唇和口腔癌、原发隐匿之转移性鳞状颈癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌和唾液腺癌；
●血液学/血液相关癌症，诸如白血病，诸如成人急性淋巴母细胞白血病、幼年期急性淋巴母细胞白血病、成人急性髓样白血病、幼年期急性髓样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病和毛细胞白血病；和淋巴瘤，诸如AIDS相关淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、成人何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、幼年期何杰金氏淋巴瘤、妊娠期间何杰金氏淋巴瘤、蕈样真菌病、成人非何杰金氏淋巴瘤、幼年期非何杰金氏淋巴瘤、妊娠期间非何杰金氏淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里(Sezary)综合征、皮肤T-细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦()氏巨球蛋白血症和其它血液学/血液相关癌症，诸如慢性骨髓增殖病症、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓发育不良综合征和骨髓发育不良/骨髓增殖病；
●肌肉骨骼相关癌症，诸如尤因氏家族之肿瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、幼年期横纹肌肉瘤、成人软组织肉瘤、幼年期软组织肉瘤和子宫肉瘤；血管肉瘤(hemangiosarcoma)和管肉瘤(angiosarcoma)；
●神经相关癌症，诸如成人脑瘤、幼年期脑瘤、脑干神经胶质瘤、小 脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤和其它脑瘤，诸如成神经细胞瘤、垂体瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤；
●呼吸/胸相关癌症，诸如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤和胸腺癌；
●皮肤相关癌症，诸如皮肤T-细胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤、梅克尔(Merkel)细胞癌和皮肤癌；
●小蓝圆细胞瘤(small blue round cell tumour)。
详言之，本发明之抗IGF抗体分子及含彼等之药物组合物有利于治疗以下癌症：造血系统之癌症，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；胃肠道之癌症，包括食管癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌和胆囊癌和胆管癌；肾癌、前列腺癌和膀胱癌；妇科癌，包括乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌；皮肤癌和头颈癌，包括恶性黑色素瘤；儿科癌症，诸如威尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤和尤因氏肉瘤；脑癌，诸如成胶质细胞瘤；肉瘤，诸如骨肉瘤、软组织肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌、间皮瘤和甲状腺癌。
在本发明的一个优选方面，本发明之抗IGF抗体分子及含彼等之药物组合物有益于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是局部晚期的或转移性的NSCLC(IIIB/IV期)。在此语境中，本发明之抗IGF抗体分子可以与基于铂的化疗，特别是帕利他赛(paclitaxel)/卡铂(carboplatin)或吉西他滨(gemcitabine)/顺铂(cisplatin)之铂双联疗法(platinum doublet therapy)组合。
在本发明的另一个优选方面，本发明之抗IGF抗体分子及含彼等之药物组合物有益于治疗肝细胞癌，特别是局部晚期的或肝细胞癌(III/IV期)。在此语境中，本发明之抗IGF抗体分子可以与索拉非尼(Sorafenib)(Strumberg D.,2005)组合。
在另一个实施方案中，抗IGF抗体分子及含彼等之药物组合物适用于非癌性过度增殖病症，诸如(但不限于)银屑病和血管成形术后再狭窄。另外，根据最近的观察结果(Reinberg,2008)：减小IGF-1活性之基因突变对于寿命具有正效应，本发明抗体当在治疗中应用于成人时具有适用于减缓衰老和预防年龄相关疾病的潜能。
如此，在另一个方面，本发明涉及如上所述之抗体分子在制备用于治疗上文所述之癌性疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗如上所述之癌性疾病的如上所述之药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗罹患如上所述之癌性疾病之患者的方法，其包括向该患者施用有效量的如本文所述之药物组合物。
视欲治疗之病症而定，本发明之抗IGF抗体分子可单独或与一或多种其它治疗剂(尤其选自DNA损伤剂或抑制癌细胞中血管生成、信号转导路径或有丝分裂检查点之治疗活性化合物)组合使用。
其它治疗剂可在施用抗IGF抗体分子同时(视情况作为相同医药制剂之组份)或之前或之后施用。
在某些实施方案中，其它治疗剂可为(但不限于)一或多种选自以下群组之抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、AuroraA、AuroraB、PLK和PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP或PDK1之抑制剂。
其它治疗剂之其它实例为CDK、Akt、src/bcr-abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制剂，刺猬(hedgehog)拮抗剂，JAK/STAT抑制剂，Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho、wnt信号传导抑制剂或泛素化路径抑制剂。
Aurora抑制剂之实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT-9283、CYC-116、R-763、VX-667、MLN-8045、PF-3814735、SNS-314、VX-689、GSK-1070916、TTP-607、PHA-680626、MLN-8237和ENMD-2076。
PLK抑制剂之实例为GSK-461364。
raf抑制剂之实例为BAY-73-4506(亦为VEGFR抑制剂)、PLX-4032、RAF-265(亦为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(亦为VEGFR抑制剂)、XL-281和Nevavar(亦为VEGFR抑制剂)。
KSP抑制剂之实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK-246053A、GSK-923295、MK-0731、SB-743921、LY-2523355和EMD-534085。
src和/或bcr-abl抑制剂之实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼(bosutinib)、XL-228(亦为IGF-1R抑制剂)、尼罗替尼(nilotinib)(亦为PDGFR和cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(亦为cKit抑制剂)、NS-187、KX2-391、AP-24534(亦为EGFR、FGFR、Tie2、Flt3之抑制剂)、KM-80和LS-104(亦为Flt3、Jak2之抑制剂)。
PDK1抑制剂之实例为AR-12。
Rho抑制剂之实例为BA-210。
PI3激酶抑制剂之实例为PX-866、PX-867、BEZ-235(亦为mTor抑制剂)、XL-147、XL-765(亦为mTor抑制剂)、BGT-226、CDC-0941、GSK-1059615。
cMet或HGF抑制剂之实例为XL-184(亦为VEGFR、cKit、Flt3之抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦为VEGFR抑制剂)、MGCD-265(亦为VEGFR、Ron、Tie2之抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102、AV-299、ARQ-197、MetMAb、CGEN-241、BMS-777607、JNJ-38877605、PF-4217903、SGX-126、CEP-17940、AMG-458、INCB-028060和E-7050。
c-Myc抑制剂之实例为CX-3543。
Flt3抑制剂之实例为AC-220(亦为cKit和PDGFR之抑制剂)、KW-2449、LS-104(亦为bcr-abl和Jak2之抑制剂)、MC-2002、SB-1317、来他替尼(lestaurtinib)(亦为VEGFR、PDGFR、PKC之抑制剂)、TG-101348(亦为JAK2抑制剂)、XL-999(亦为cKit、FGFR、PDGFR和VEGFR之抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(亦为PDGFR、VEGFR和cKit之抑制剂)和坦度替尼(tandutinib)(亦为PDGFR和cKit之抑制剂)。
HSP90抑制剂之实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504、STA-9090、MEDI-561、AUY-922、CNF-2024和SNX-5422。
JAK/STAT抑制剂之实例为CYT-997(亦与微管蛋白相互作用)、TG-101348(亦为Flt3抑制剂)和XL-019。
Mek抑制剂之实例为ARRY-142886、AS-703026、PD-325901、AZD-8330、ARRY-704、RDEA-119和XL-518。
mTor抑制剂之实例为雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus)、德罗莫司(deforolimus)(亦充当VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(亦为VEGF抑制剂)、XL-765(亦为PI3激酶抑制剂)和BEZ-235(亦为PI3激酶抑制剂)。
Akt抑制剂之实例为哌立福新(perifosine)、GSK-690693、RX-0201和曲西立滨(triciribine)。
cKit抑制剂之实例为马赛替尼(masitinib)、OSI-930(亦充当VEGFR抑制剂)、AC-220(亦为Flt3和PDGFR之抑制剂)、坦度替尼(亦为Flt3和PDGFR之抑制剂)、阿西替尼(axitinib)(亦为VEGFR和PDGFR之抑制剂)、舒尼替尼(亦为Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制剂)和XL-820(亦充当VEGFR和PDGFR之抑制 剂)、伊马替尼(亦为bcr-abl抑制剂)、尼罗替尼(nilotinib)(亦为bcr-abl和PDGFR之抑制剂)。
刺猬拮抗剂之实例为IPI-609、CUR-61414、GDC-0449、IPI-926和XL-139。
CDK抑制剂之实例为赛立西尼(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2和PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509、PHA-848125和SCH-727965。
蛋白酶体抑制剂/NFκB路径抑制剂之实例为硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、NPI-0052、CEP-18770、MLN-2238、PR-047、PR-957、AVE-8680和SPC-839。
泛素化路径抑制剂之实例为HBX-41108。
抗血管生成剂之实例为FGFR、PDGFR和VEGF(R)之抑制剂和沙力度胺(thalidomide)，该等药剂选自(不限于)BIBF1120()、贝伐株单抗(bevacizumab)、莫特沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZKCDK(亦为CDK抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiDs、沙力度胺、CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD-0995、IMC-D11、Ki-23057、博瑞拉尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、1B3、CP-868596、IMC-3G3、R-1530(亦为Flt3抑制剂)、舒尼替尼(亦为cKit和Flt3之抑制剂)、阿西替尼(亦为cKit抑制剂)、来他替尼(亦为Flt3和PKC之抑制剂)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦为Flt3和cKit之抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、PF-337210、阿非博赛(aflibercept)、E-7080、CHIR-258、索拉非尼甲苯磺酸盐(亦为Raf抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦为EGFR和Her2之抑制剂)、BAY-57-9352(亦为Raf抑制剂)、BAY-73-4506(亦为Raf抑制剂)、XL-880(亦为cMet抑制剂)、XL-647(亦为EGFR和EphB4之抑制剂)、XL-820(亦为cKit抑制剂)、尼罗替尼(亦为cKit和brc-abl之抑制剂)、CYT-116、PTC-299、BMS-584622、CEP-11981、多韦替尼(dovitinib)、CY-2401401和ENMD-2976。
其它治疗剂亦可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体之实例为(不限于)西妥昔单抗(cetuximab)、盘尼图单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁突木单抗(zalutumumab)；小分子EGFR抑制剂之实例为吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和凡德他尼(亦为VEGFR抑制剂)。EGFR调节剂之另一实例为EGF 融合毒素。
适合与本发明之抗IGF抗体分子组合使用之其它EGFR和/或Her2抑制剂为BIBW2992()、拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、来那替尼(neratinib)、BMS-599626、ARRY-334543、AV-412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦为VEGFR抑制剂)、AZD-8931、ARRY-380、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab、TAK-285、AZD-4769。
宜与本发明之抗IGF抗体分子组合治疗之其它药剂为托西莫单抗(tositumumab)和替坦异贝莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(两种放射性标记之抗CD20抗体)、奥伏托默单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、LY-2469298、欧瑞立单抗(ocrelizumab)、TRU-015、PRO-131921、FBTA05、维尔托佐单抗(veltuzumab)、R-7159(CD20抑制剂)、阿伦单抗(alemtuzumab)(抗CD52抗体)、德诺单抗(denosumab)(破骨细胞分化因子配体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(CD80拮抗剂)、扎木单抗(zanolimumab)(CD4拮抗剂)、SGN40(CD40配体受体调节剂)、XmAb-5485、Chi Lob7/4、路卡木单抗(lucatumumab)、CP-870893(CD40抑制剂)、CAT-8015、依帕珠单抗(epratuzumab)、Y90-依帕珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)(CD22抑制剂)、鲁昔单抗(lumiliximab)(CD23抑制剂)、TRU-016(CD37抑制剂)、MDX-1342、SAR-3419、MT-103(CD19抑制剂)或迈帕突莫单抗(mapatumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、Apomab、AMG-951和AMG-655(TRAIL受体调节剂)。
可与本发明之抗IGF抗体分子组合使用之其它化学治疗药物系选自(但不限于)激素、激素类似物和抗激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸环丙氯地孕酮(cyproterone acetate)、柔沛(finasteride)、醋酸丁瑞林(buserelin acetate)、氟氢可的松(fludrocortinsone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐普芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制剂(例如阿纳托唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美司坦(formestane))、LHRH激动剂 和拮抗剂(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙立德(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代谢物(例如抗叶酸物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、培美曲唑(pemetrexed)；嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)和吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤和腺苷类似物，诸如巯嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)和喷司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine))、抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)，诸如多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)和伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹克生琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))、铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥赛力铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、撒塔铂(satraplatin))、烷基化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、甲二氯二乙胺(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基尿素(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲诸如卡莫司汀(carmustine)和洛莫司汀(lomustine)、塞替派(thiotepa))、抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱(vinca alkaloid)，诸如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)和长春新碱(vincristine)；和紫杉烷，诸如帕利他赛(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)及其调配物、拉洛他赛(larotaxel)；司莫紫杉醇(simotaxel)和埃坡霉素(epothilone)，诸如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕妥匹隆(patupilone)、ZK-EPO)、拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))和各种化学治疗药物(诸如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)和普非莫(porfimer)、贝瑟罗汀(bexarotene)、赛利克西(celecoxib))。
在一个方面，本发明之抗IGF抗体分子与基于铂的化疗组合，例如与帕利他赛/卡铂或吉西他滨/顺铂之铂双联疗法组合使用。在一个实施方案中，此类组合疗法可重复多次，例如6个循环(q3周)。此治疗可继以用单独抗IGF 抗体分子进行之别的重复治疗(例如6个循环q3周)。此方案可用于例如治疗NSCLC。在另一个方面，本发明之抗IGF抗体分子与索拉非尼组合使用。在一个实施方案中，抗IGF抗体分子可以以1-3周之间隔重复施用，例如12个循环，与索拉非尼之连续施用组合。此方案可用于例如治疗肝细胞癌。
本发明之抗IGF抗体分子例如当在较低浓度下使用时，亦可与靶向IGF-1R之药剂组合。该等药剂包括可结合IGF-1R之抗体(例如CP-751871、AMG-479、IMC-A12、MK-0646、AVE-1642、R-1507、BIIB-022、SCH-717454、rhuMab IGFR)和靶向IGF1-R激酶域之新颖化学体(例如OSI-906或BMS-554417、XL-228、BMS-754807)。
本发明之抗IGF抗体分子亦可与其它疗法(包括手术、放射疗法、内分泌疗法、生物反应调节剂、过热和冷冻疗法)和减弱任何副作用之药剂(例如止吐药，及在一个优选实施方案中为糖尿病药，例如二甲双胍(metformin))组合使用。
本发明之抗IGF抗体分子亦适用于诊断癌症，其中升高的IGF-1和/或IGF-2血清水平与疾病之形成或进展相关，例如测定因印记损失(LOI)(影响胰岛素样生长因子II基因(IGF2)之后生变异)所致之升高的IGF-2水平。在某些实施方案中，用于诊断应用(例如藉由免疫组织染色检测人类组织切片中之IGF-1)之抗体为来源于人类抗体之嵌合抗体。在该抗体中，恒定区或其一部分已由另一物种(例如小鼠)抗体之各别序列置换。使用该嵌合抗体作为一抗，二抗(例如与鼠类Fc部分发生特异性反应之山羊抗体)将特异性识别嵌合一抗之鼠类序列且不与存在于人类组织样品中之其它人类免疫球蛋白分子之Fc部分结合。从而可避免不希望有的背景染色。
藉由阻断IGF-1和IGF-2介导之信号转导，本发明抗体亦可用于控制体重和脂肪组织形成。为此目的，本发明之抗体可单独或与其它减肥药物组合施用。
材料与方法
选择可结合IGF-1之高亲和力完全人类抗体
用三轮淘选自人类组合抗体文库(HuCAL Gold)(Knappik等人，2000)中选择可以低纳摩尔浓度亲和力结合人类IGF-1之特异性Fab片段克隆，基本上如Rauchenberger等人，2003所述。为鉴定对人类IGF-1之亲和力改良之Fab片段，使多种此等“亲本”Fab克隆进行“体外亲和力成熟”，基本上如Nagy等人， 2002所述。各克隆之L-CDR3(轻链CDR3)和H-CDR2(重链CDR2)序列分别以约108个选自HuCAL(Knappik等人，2000)之L-CDR3和H-CDR2盒取代亲本序列来多样化。自所得“成熟文库”制备噬菌体且针对人类IGF-1对各文库进行溶液淘选。为选择最大亲和力之人类IGF-1结合剂，根据此项技术中已知之方法，在一般和升高的严格度之洗涤条件下，在抗原减少以及在人类胰岛素封闭和不封闭的情况下进行溶液淘选。将三轮噬菌体淘选后的淘选产物亚克隆于Fab表达载体中且藉由BioVeris(Witney,Oxfordshire,UK)开发之基于电化学发光之平衡滴定技术测定各Fab对人类IGF-1之亲和力，基本上如Haenel等人，2005所述。对具有最佳IGF-1亲和力之Fab克隆测序，接着如Krebs等人，2001所述转型为人类IgG1抗体，其对人类IGF-1具有亚纳摩尔浓度亲和力且与亲本抗体相比，特异性没有任何改变。
克隆和重组表达IgG1抗体
藉由限制酶消化自Fab表达载体中切取可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)且接合至分别含有人类IgG1重链和人类Igλ轻链恒定区之基于pcDNA3.1之质粒的兼容限制酶位点。制备EndoFree质粒制剂(Qiagen)且根据供货商之方案，在各质粒1mg/L的浓度下将重链和轻链质粒共转染至HEK293Freestyle细胞(Invitrogen)中。72小时后，收集上清液且藉由ELISA测定IgG浓度。在经修饰之蛋白A柱(GE Healthcare)上纯化抗体，洗脱至柠檬酸盐缓冲液中且随后于PBS中透析直至2.5mg/ml之浓度。或者，产生稳定整合有抗体表达质粒之CHO细胞系且用于生产抗体。
表面等离振子共振分析以测定亲和常数
a)抗体捕捉方法
使用胺偶联试剂盒中之偶联试剂将传感器芯片在流动室1中包被约1000RU之参考抗体及在流动室2中包被约1000RU之家兔抗人类Fc-γ特异性抗体。利用Biacore3000软件之表面制备向导，将1000RU之标靶以5μl/min之流速设立。所用运行缓冲液为HBS-EP。使用以下参数进行亲和力测量：20μl/min流动(HCB运行缓冲液：)；25℃检测温度；Fc1、Fc2流动路径；Fc1、Fc2检测；抗IGF-huMAb捕捉：1μg/ml溶液3分钟；5分钟IGF-Ag结合；5分钟IGF-Ag解离；再生：以50mM HCl进行30秒脉冲。IGF抗原于运行缓冲液(HCB)中稀释至500nM、250nM、125nM、62.5nM和31.3nM且以随机次序在Fc1和Fc2上单独运行不同抗原稀释液。其间运行仅使用运行缓冲液之空白运行。在亲 和力分析前，自各结合曲线减去空白运行曲线。使用BIAevaluation软件(4.1版,Biacore,Freiburg,Germany)进行数据评估。单独拟合解离和结合阶段之动力学。单独拟合kdiss值时，使用解离阶段初始200-300秒之时间范围(信号稳定减弱之范围)。单独拟合kass值时，使用约100秒之初始时间范围(信号稳定增强之范围)且计算时以1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型使用个别kdiss值。计算动力学数据之平均值和标准偏差以及相应解离常数(KD)和结合常数(KA)。
b)IGF包被方法
当以IGF配体包被传感器芯片时，基本如上所述测定IGF抗体对IGF配体之结合常数，例外之处为分别以35.1pg/mm2和38.5pg/mm2IGF-1和IGF-2包被传感器芯片。接着抗体以下列浓度流过芯片：50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
在免疫吸附检定中测量与人类IGF、鼠类IGF和大鼠IGF及与人类胰岛素之结合
在直接免疫吸附检定(ELISA)中，亦测试以高亲和力结合IGF-1之完全人类IgG1抗体与人类IGF-1之结合。藉由在4℃以0.5μg/mL浓度之人类IGF-1(R&D Systems,编号291-G1)包被96孔Maxisorb板(100微升/孔)过夜进行检定。单独包被缓冲液用作非特异性结合之对照。接着用洗涤缓冲液(1xTBS-T)洗孔一次，且在室温在轨道震荡器上用200μl封闭缓冲液封闭残余结合位点1小时，接着进行另一轮洗涤。在包被板上直接制备各测试抗体于封闭缓冲液中之一系列三倍稀释液。所用典型浓度为50ng/mL、16.6ng/mL、5.6ng/mL、1.8ng/mL、0.6ng/mL、0.2ng/mL和0.07ng/mL。单独封闭缓冲液用作阳性对照。接着板在摇动下在室温培育2小时。三轮洗涤后，向所有孔中各孔添加100μl于封闭缓冲液中稀释之HRPO缀合的抗人类IgG二次试剂(Jackson ImmunoResearch Inc.)。在室温摇动下培育2小时后，洗板三次，TMB底物溶液(等量溶液A与B)以100微升/孔吸移至所有孔中。板在室温摇动下培育10-20分钟，随后藉由每孔添加100μl之1M磷酸停止反应。以450nm之波长测量吸光度(参考波长650nm)。
亦如上针对人类IGF-1所述，测试完全人类IGF-1结合IgG1抗体与小鼠IGF-1(R&D Systems,编号791-MG)、大鼠IGF-1(IBT,编号RU100)、人类IGF-2(GroPep,编号FM001)、小鼠IGF-2(R&D Systems,编号792-MG)、大鼠IGF-2(IBT,编号AAU100)和人类胰岛素(Roche)之结合，例外之处为用于包被 之人类胰岛素浓度为3μg/mL。
测定中和效能之体外细胞增殖检定
将来源于MCF-7乳腺癌之细胞系(ATCC,HTB-22)和来源于COLO205结肠癌之细胞系(ATCC#CCL-222)于无血清RPMI培养基中以每孔1000个细胞之细胞密度接种于96孔板中。在12ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL和3000ng/mL浓度之不结合IGF-1或IGF-2的人源化同种型对照抗体或抗体60814、60819和60833存在或不存在下，添加10ng/mL IGF-1或IGF-2。培养细胞5天，接着使用CellTiter-Glo发光细胞存活率检定(Promega)测定各孔中相对细胞数目。使用XFluor GENios Pro4记录发光度(LU=发光单位)。
来源于尤因氏肉瘤之细胞系的生长检定
来源于尤因氏肉瘤之细胞系TC-71(ATCC#ACC516)和SK-ES-1(ATCC#HTB86)于含有1x NEAA、1x丙酮酸钠、1x glutamax和10%胎牛血清(FCS)之DMEM培养基中以每孔1000个细胞之密度接种于96孔板中且在37℃和5%CO2之增湿氛围下培育过夜。次日向细胞中添加测试抗体、不结合IGF-1或IGF-2之人源化同种型对照抗体(靶向CD44-v6之人源化IgG1抗体)、雷帕霉素或雷帕霉素与测试抗体组合之连续稀释液。所用典型浓度为30μg/ml、10μg/ml、3.3μg/ml、1.1μg/ml、0.37μg/ml和0.12μg/ml(或就组合研究而言，100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM雷帕霉素与测试抗体)且各稀释于三重复孔中进行。接着将细胞与抗体一起培育120小时，之后使用CellTiter-Glo发光细胞存活率检定(Promega)测定各孔中相对细胞数目。使用XFluor GENios Pro4记录发光度(LU=发光单位)且获取三重复孔之平均值用于数据分析且使用具有可变希耳斜率(Hill slope)之S形曲线分析程序(GraphPad Prism)藉由迭代计算来拟合。
Western印迹分析磷酸化AKT和PTEN水平
SK-ES-1细胞于含有10%胎牛血清之培养基中接种于6孔板中且在过夜培育后，用100nM不结合IGF-1或IGF-2之同种型对照抗体(靶向CD44-v6之人源化IgG1抗体)、100nM60819、100nM雷帕霉素或100nM60819与100nM雷帕霉素组合对其进行处理。24小时后，细胞溶解且在以Bradford检定测定蛋白质浓度后冷冻细胞溶胞物。藉由将30μg蛋白质溶胞物施加至SDS PAGE凝胶(BioRad)上且将凝胶于Citerian凝胶印迹夹层上印迹来进行Western印迹 分析。将Western印迹与家兔抗β肌动蛋白(对照)抗体、家兔抗PTEN抗体(Cell Signaling#9559)或家兔抗磷酸化pAKT抗体(Cell Signaling#4060)(于1%乳粉中1:5000(抗β肌动蛋白)、1:1000(抗PTEN)或1:2000(抗磷酸化AKT)稀释)一起培育过夜。在TBS中洗涤后，施加抗家兔IgG HRPO缀合的二抗(Amersham)1小时且在TBS中再洗涤后，藉由ECL检测抗体反应性且捕捉于Hyperfilm(Amersham)上。
抗IGF抗体与EGFR抑制剂体外组合于来源于NSCLC之细胞系中
将来源于NSCLC之细胞系A-549(ATCC#CCL-185)于含有2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清之RPMI1640培养基中以每孔1000个细胞之密度接种于96孔板中且在37℃和5%CO2之增湿氛围下培育过夜。次日向细胞中添加测试IGF抗体、埃罗替尼/得舒缓或测试IGF抗体与埃罗替尼组合之连续稀释液。所用测试IGF抗体之典型浓度为30000ng/mL、10000ng/mL、3333ng/mL、1111ng/mL、370ng/mL、123ng/mL、41ng/mL、14ng/mL，且所用埃罗替尼之典型浓度为20000nM、6667nM、2222nM、741nM、247nM、82nM、27nM、9nM，且各稀释于三重复孔中进行。接着将细胞培育120小时，之后使用CellTiter-Glo发光细胞存活率检定(Promega)测定各孔中相对细胞数目。使用XFluor GENios Pro4记录发光度(LU=发光单位)且获取三重复孔之平均值用于数据分析且使用具有可变希耳斜率之S形曲线分析程序(Graph Pad Prism)藉由迭代计算来拟合。
测定对鼠类血清中总IGF-1水平和大鼠血清中总IGF-1水平之影响
向6-8周龄雌性无胸腺NMRI裸小鼠(n=5)中静脉内单次施用(快速注射)25mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg和3.13mg/kg之测试IGF抗体。向6-8周龄雄性和雌性Wistar Han大鼠(n=4只雄性，4只雌性)中单次10分钟静脉内施用30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg之抗体60819。抗体治疗前和在施用后24小时获取血液样品，收集血清且使用OCTEIA大鼠/小鼠总IGF-1免疫细胞检定测定鼠类或大鼠总IGF-1水平。根据制造商说明书进行检定，在450nm测量吸光度且使用SoftMax Pro软件进行评估。使用标准曲线测定血清中总IGF-1浓度(ng/mL)。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
基于细胞的IGF-1R磷酸化ELISA
重组表达人类IGF-1R或人类IR-A的小鼠成纤维细胞细胞系维持于补充有10%热灭活的FCS、1mM丙酮酸钠(sodium pyrovate)、0.075%碳酸氢钠、 MEM NEAA、和0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM，在37℃和5%CO2的加湿培养箱中。将细胞用胰蛋白酶/EDTA解附，在生长培养基中重悬浮，并稀释至100,000个细胞/mL。将100μL(10,000个细胞)接种入无菌96孔板的孔中，并在37℃和5%CO2的加湿培养箱中温育过夜。然后将细胞用100μL/孔测定培养基(补充有0.5%热灭活的FCS、1mM丙酮酸钠、0.075%碳酸氢钠、和MEM NEAA的DMEM)饥饿，并如上温育过夜。将在测定培养基中制备的一系列测试抗体浓度添加至细胞，所有样品制备三份以测定每种测定条件的标准偏差。还在这些实验中测试一种IGF-1R抗体，αIR-3(Calbiochem,No.GR11L)。然后添加IGF-1(20ng/mL终浓度)、IGF-2(100ng/mL终浓度)、或人类血清(20%终浓度)，并将板在加湿培养箱中温育30分钟。通过用含4%甲醛的PBS替换生长培养基，室温20分钟来固定细胞。在摇动中用300μL/孔清洗缓冲液(含0.1%Triton X-100的PBS)5分钟清洗两轮后，将细胞用100μL/孔含1.2wt%过氧化氢的清洗缓冲液于室温淬灭30分钟。将细胞再次用300μL/孔清洗缓冲液清洗，并用100μL/孔封闭缓冲液(含5%BSA的清洗缓冲液)在摇动中于室温封闭60分钟。除去封闭缓冲液，并添加50μl/孔在封闭缓冲液中1:1000稀释的磷酸化IGF-I受体β(tyr1135/1136)/胰岛素受体β(tyr1150/1151)一抗(Cell Signaling,No.3024)。将板在摇动中于4℃温育过夜，然后如上清洗三次，并添加50μL/孔在封闭缓冲液中1:500稀释的缀合有辣根过氧化物酶的抗家兔IgG山羊免疫球蛋白(Dako,No.P0448)。在摇动中于室温温育60分钟后，将孔如上用清洗缓冲液清洗两次，并用300μL PBS清洗一次。将100μL/孔TMB底物溶液(Bender MedSystems,No.BMS406.1000)添加至孔，并在摇动中温育10分钟，在此之后通过添加100μL/孔1M磷酸来终止反应，并使用分光计读取吸光度(OD450nm,OD650nm作为参考)。通过图形分析来确定IGF-1R或IR-A磷酸化抑制IC50值。
Fab-IGF-1共结晶和结构测定
单克隆抗体在100mM磷酸钠(Na-phosphate)(pH7.0)的缓冲液中制备，之后进行木瓜蛋白酶消化。木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich,P#3125)遵循制造商的指令在消化缓冲液(含有10mM盐酸半胱氨酸、4mM EDTA的磷酸盐缓冲液，pH7.0)中活化。IgG抗体与活化的木瓜蛋白酶混合(比例酶:IgG=1:100)，并将反应在旋转摇床上于37℃温育过夜。通过添加碘乙酰胺(iodacetamid)至终浓度30mM来终止消化。为了分开Fab片段与Fc片段、Fc切割产物和完整Mab， 将消化混合物加载到经磷酸盐缓冲液平衡的蛋白A MabSelect柱上。用5个柱体积的PBS清洗柱，并在流出和清洗级分中收集Fab片段。Fc片段和完整Mab用100mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)自柱洗脱，随后使用HiLoad Superdex 75柱实施Fab片段的大小排阻层析。用20mM三乙醇胺、130mMNaCl,pH8.0以0.5mL/min运行柱。通过测量280nm处的吸光度来测定Fab片段的蛋白质浓度。通过Western印迹和ELISA来分析Fab片段的质量。
如下生成Fab-IGF-1复合物，即将2倍摩尔过量的重组IGF-1(Gropep;Receptor Grade)添加至纯化的Fab，然后在旋转摇床上于4℃温育过夜。浓缩复合物至(15 mg/mL)和除去未结合的IGF-1使用Amicon-Ultra装置来实施。Fab:IGF-1复合物的结晶使用各种技术来进行，诸如悬滴(hanging drop)、坐滴(sitting drop)、和撒种(seeding)。在一个实施方案中，通过使溶液接触如下储液来沉淀晶体，该储液由于存在沉淀剂即诱导沉淀的试剂而降低蛋白质的溶解度。筛选各种条件获得合适缓冲系统，其通过添加沉淀剂和添加剂来操作。沉淀剂的浓度优选介于5-50%w/v之间。缓冲液的pH优选为约3至约6。溶液中蛋白质浓度优选为过饱和以容许沉淀。结晶期间的温度优选介于4和25℃之间。
自晶体的X射线衍射图样及其衍生的电子密度图获得以原子坐标定义的Fab:IGF-1复合物的三维结构。晶体的衍射好于分辨率。晶体优选具有空间群P3221(数目154)和大约=,b=,c=的晶胞尺寸；及γ=120°。用于确定三维结构的方法是分子置换，其涉及使用密切相关分子或受体配体复合物的结构。模型建立和细化以数个迭代步骤进行，至最终R-因子(R和R游离)分别为21和23%。
大鼠中药动学参数的测定
每72小时给予Wistar大鼠五次静脉内推注施用18 mg/kg、52 mg/kg、和248mg/kg抗体。在各个时间点，采集血液样品，并通过三明治式ELISA测定血浆中的人类抗体浓度。这容许计算服药第一天抗体的均值药动学参数及计算服药最后一天之后的半衰期(t(n)=1008小时)。
实施例1：选择可结合IGF-1之高亲和力抗体
为鉴定对人类IGF-1之亲和力改良的Fab片段，使经鉴定可以低纳摩尔浓度亲和力结合IGF-1的多个“亲本”Fab克隆进行“体外亲和力成熟”，其中 各克隆之L-CDR3和H-CDR2序列分别由新L-CDR3和H-CDR2序列之文库取代亲本序列来多样化。所得“成熟文库”进行针对人类IGF-1之溶液淘选且选择具有最佳亲和力之克隆转型为IgG1抗体并进一步测试。具有最佳人类IGF-1亲和力之三种抗体为分别具有180pM、190pM和130pM之亲和力(KD)的60814、60819和60833(表1中所示)，如藉由基于电化学发光之平衡滴定方法所测定。
表1：IGF-1结合总结
抗体亲和力(pM)
60814180
60819190
60833130
还在免疫吸附检定中对抗体测试它们对人类、鼠类、和大鼠IGF-1和IGF-2，以及人类胰岛素的结合。这证明了60814、60819、和60833显示出与小鼠和大鼠IGF-1，以及人类、鼠类和大鼠IGF-2的相当的交叉反应性结合，但是对人类胰岛素没有反应性(在测试的最高浓度，50ng/ml)(图1A-1G)。
还藉由表面等离振子共振(Biacore)分析来测定抗体结合人类、小鼠、和大鼠IGF-1和IGF-2的亲和常数。该方法涉及在传感器上捕捉抗体，并使IGF抗原流过被捕捉的抗体，如此克服将IGF抗原包被到传感器上并添加抗体时可发生的任何亲合效应。使用此方法为抗体60833得到的亲和常数显示于表2，其中可见对人类IGF-1和人类IGF-2的KD测量值分别为0.07nM和0.9nM。表2：抗体60833对人类、小鼠、和大鼠IGF-1和IGF-2的亲和常数，通过表面等离振子共振(抗体捕捉法)测定
抗原Kon[M-1s-1]Koff[s-1]KD[nM]
人类IGF-14.74x1063.01x10-40.07
小鼠IGF-11.00x1063.23x10-40.33
大鼠IGF-13.81x1062.53x10-40.07
人类IGF-23.97x1063.53x10-30.913
小鼠IGF-28.68x1051.1x10-213.4
大鼠IGF-22.56x1066.13x10-32.41
实施例2：对IGF信号传导的抑制
IGF结合IGF-1R后发生的第一信号传导事件是IGF-1R磷酸化。使用一种基于细胞的ELISA检定来测量抗体60833对IGF诱发之IGF-1R磷酸化的抑制。测定了60833在中和重组生物活性IGF-1和IGF-2诱发之IGF-1R磷酸化中的效力和有效性(直至15μg/mL(100nM))。如表3和例如图2A-2B所示，60833有力且有效地抑制IGF-1(图2A)和IGF-2(图2B)诱发之信号传导。在同一检定中，靶向IGF-1R之单抗 IR3在IGF-1诱发之信号传导方面的效力和有效性低得多，并展示很弱的对IGF-2诱发之信号传导的影响。
使用一种相似的基于细胞的IR-A磷酸化ELISA来证明60833还能抑制经IR-A的IGF-2信号传导。如表4和例如图3A所示，60833有力且有效地抑制IGF-2诱发之IR-A磷酸化。相反，不能结合IR-A的 IR3没有显示出抑制效果。
人类血清或血浆样品中的IGF生物活性水平也可使用IGF-1R磷酸化基于细胞的ELISA来测量。使用这来测定60833在中和人类血清IGF生物活性中的效力和有效性(直至15μg/mL(100nM))。如表3和例如图3B所示，60833有力且有效地抑制人类血清中的IGF生物活性。
表3：60833对IGF-1R磷酸化的影响
表4：60833对IR-A磷酸化的影响
实施例3：对IGF-1和IGF-2诱发之细胞增殖的影响
测定抗体60814、60819和60833对IGF-1和IGF-2诱发之MCF-7(来源于乳腺癌)和COLO205(来源于结肠癌)细胞系增殖之影响。抗体60814和60819之影响之实例显示于图4A-4D中。所有三种抗体皆对IGF-1(图4A和4C)和IGF-2(图4B和4D)诱发之MCF-7(图4A和4B)和COLO205(图4C和4D)细胞增殖显示剂量依赖性抑制。将IGF-1或IGF-2诱发之各细胞系增殖抑制50%所需之各抗体浓度显示于表5中。
表5：抑制IGF-1和IGF-2诱发之MCF-7和COLO205癌细胞系增殖
实施例4：对来源于尤因氏肉瘤之细胞系增殖的影响
抗体60819和60833对生长于含有10%FCS之培养基中之来源于尤因氏肉瘤之细胞系TC-71增殖的影响显示于图5中。相对于不结合IGF-1或IGF-2之人源化IgG1同种型对照抗体，60819和60833对TC-71细胞增殖显示剂量依赖性抑制。
实施例5：对鼠类和大鼠总IGF-1水平之影响
用靶向IGF之抗体中和活性IGF-1预期可引起经由GH路径之内分泌反馈，导致血清总IGF-1水平升高。抗体60814、60819和60833与小鼠和大鼠IGF-1可交叉反应，从而容许对此等物种之血清中总IGF-1水平之任何药效学 影响进行测量。如图6和7中所示，向小鼠(图6)和大鼠(图7)中施用抗体60819使得施用后24小时鼠类和大鼠血清中总IGF-1水平有剂量依赖性升高。此代表此等抗体活性之适用药效学标记，其可在临床开发期间于人体中测试。
实施例6：靶向IGF配体之抗体与雷帕霉素组合对来源于尤因氏肉瘤之细胞系增殖和胞内信号传导的影响
抗体60819和mTOR抑制剂雷帕霉素(单独或组合)对来源于尤因氏肉瘤之细胞系SK-ES-1增殖的影响显示于图8中。抗体60819与雷帕霉素单独使用时存在对增殖之剂量依赖性抑制，此两种单药在100nM均实现约60%增殖抑制。抗体60819与雷帕霉素之等价剂量组合可展示对细胞增殖之累加抑制效应，当以100nM剂量组合时，具有约95%抑制作用。
IGF诱发之细胞增殖系经一连串胞内蛋白质磷酸化事件所介导。一种在IGF刺激下磷酸化增强之蛋白质为AKT。图9展示使用100nM剂量处理后24小时，抗体60819和雷帕霉素(单独或组合)对SK-ES-1细胞中AKT磷酸化之影响。与显示AKT磷酸化之未处理细胞之增殖相比，100nM抗体60819可抑制AKT磷酸化。相反，100nM雷帕霉素处理引起磷酸化AKT水平高于对照，此被认为因mTOR抑制后之补偿反馈机制所致。然而，当100nM雷帕霉素与100nM抗体60819组合时，AKT之磷酸化被抑制。此表明导致雷帕霉素处理后AKT磷酸化之补偿反馈系因IGF配体升高所致且此等配体可由抗体60819抑制。图9亦展示抗体60819与雷帕霉素(单独或组合)不会影响PTEN之总含量。
实施例7：靶向IGF配体之抗体与EGFR抑制剂组合对来源于NSCLC之细胞系增殖的影响
抗体60819和EGFR抑制剂埃罗替尼/得舒缓(单独或组合)对来源于NSCLC之细胞系A-549增殖的影响显示于图10中。在此模型中，单独抗体60819对细胞增殖仅存在微小影响，而得舒缓在最大测试剂量(20μM)显示约60%细胞增殖抑制之剂量依赖性影响。然而，当抗体60819与得舒缓组合时，对细胞增殖的抑制更强烈且更有效，表明存在协同效应。
实施例8：在Wistar大鼠中的药动学特性
服用18mg/kg、52mg/kg和248mg/kg的第一天，抗体60833在Wistar大鼠 中的均值药动学参数显示于表6。计算服药的最后一天之后的终末半衰期(t(n)=1008小时)，所有三种剂量水平的平均终末半衰期为221小时(9.2天)。
表6：服药第一天抗体60833在WISTAR大鼠中的均值药动学参数
φ=服药最后一天之后及t(n)=1008 hr
实施例9：Fab-IGF-1共结晶和结构测定以鉴定IGF-1上的抗体结合位点
为了确定地测定人类IGF-1上与IGF抗体相互作用的残基，将Fab和IGF-1共结晶，并以好于的分辨率测定相互作用的结构。IGF-1上受到抗体(Fab)60833接触的残基显示于表7。整个的，IGF-1上19个残基接触60833上15个CDR残基。在这19个IGF-1残基中，17个在比对人类IGF-1和IGF-2氨基酸序列时在人类IGF-2中是相同的(列于表7)。图11显示了IGF-1的3D结构，其中突出显示受到60833结合的氨基酸，还显示了人类IGF-1的线性氨基酸序列，其中相互作用氨基酸标有下划线。
表7：人类IGF-1中与60833 FAB的残基接触的残基
参考文献
Barbas,et al.,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813.
Burtrum et al.,Cancer Res.63:8912-21,2003).
Chen et al.,J.Clin.Endocrinol.90:366-371,2005.
Cui et al.,Science299:1753-55,2003.
Cruz-Correa et al.,Gastroenterology126:1190-3,2004.
Dufner and Thomas,Exp.Cell Res.253:100-109,1999.
Frasca et al.,Mol.Cell.Biol.19:3278-88,1999.
Freier et al.,Gut,May;44(5):704-08,1999;
Fukuzawa et al.,Int.J.Cancer82:490-497,1999.
Goetsch et al.,Int.J.Cancer113:316-28,2005.
Goya et al.,Cancer Res.64:6252-58,2004.
Haenel et al.,Anal.Biochem.339:182-184,2005.
Hassan et al.,Cancer Res.60:1070-6,2000
Hawkins et al.,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896.
Jackson et al.,1995,J.Immunol.154(7):3310-9.
Jerome et al.,End.Rel.Cancer10:561-578,2003.
Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.).NIH Publication No.913242.U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991).
Kipriyanow and Le Gall,Molecular Biotechnology26:39-60,2004.
Knappik et al.,J.Mol.Biol.296:57-86,2000.
Kolb et al.Pediatr.Blood Cancer50:1190-1197,2008.
Krebs,B.et al.,J.Immunol.Meth.245:6784,2001.
Kulik et al.,Mol.Cell.Biol.17:1595-606,1997.
LeRoith D,Experimental Diab.Res.4:205-212,2003.
Li et al.,Tumour Biol.25:62-8,2004.
Lowman et al.,Biochemistry30(45):10832-10837,1991.
Lund et al.,Cancer Lett.206:85-96,2004.
Manara et al.,Clin.Cancer Res.13:1322-1330,2007.
Manes et al.,Endocrinology138:905-915,1997.
Marks et al.,1992,Biotechnology10:779-783.
Miyamoto et al.,Clin.Cancer Res.11:3494-3502,2005.
Moorhead et al.,Oncogene22:853-7,2003.
Nagy et al.,Nature Med.8(8):801-807,2002.
Ng et al.,J.Gastroenterol.Hepatol.13:152-7,1998.
Pandini et al.,J.Biol.Chem.277:39684-95,2002.
Pollack et al.,Nature Rev.Can.4:505-518,2004.
Pollack et al.,American Society for Clinical Oncology(ASCO),Annual Meeting2007,abstract3587.
Quinn et al.,J.Biol.Chem.271:11477-83,1996.
Rauchenberger,R.et al.,J.Biol.Chem.278:38194-38205,2003.
Reinberg,U.S.News World Report,March5,2008.
Remington:“The Science and Practice of Pharmacy”,2005,21st edition,Hendrickson Randy,Editor;Advanced Concepts Institute,University of The Sciences in Philadelphia,600S.43rd Street,Philadelphia,PA19104,USA;
215-895-1184.
Renehan et al.,Br.J.Cancer83:1344-50,2000a).
Renehan et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.85:3402-8,2000b).
Revets et al.,Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24,2005.
Rubin et al.,Lab.Invest.73:311-31,1995.
Russell et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA81:2389-2392,1984.
Scotlandi et al.,Cancer Res.56:4570-4574,1996.
Sell et al.,Natl.Acad.Sci.USA90:11217-21,1993.
Sell et al.,Mol.Cell.Biol.14:3604-12,1994.
Shier et al.,1995,Gene169:147-155.
Shukla et al.,2007,J.Chromatography B,848(1):28-39
Srinivasan,M.and Roeske,RW.,Curr Protein Pept Sci.2005,Apr;6(2):185-96.
Strumberg D.,2005,Drugs Today(Barc).2005Dec;41(12):773-84
Takanami et al.,J.Surg.Oncol.61:205-8,1996.
Tsai et al.,Scand.J.Gastroenterol.40:68-75,2005.
Wang et al.,World J.Gastroenterol.9:267-70,2003.
Woodson et al.,J.Natl.Cancer Inst.96:407-10,2004.
Yao et al.,Clin.Cancer Res.9:2719-26,2003a).
Yao et al.,J.Clin.Invest.111:265-273,2003b).
Yelton et al.,1995,Immunol.155:1994-2004.
Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062.,1995.
Zhao et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.14:1819-22,2005.
WO89/011297
WO94/29348
WO02/056910
WO03/002609
WO03/050531
WO03/093317
WO04/003019
WO04/058821
WO2005/018671
WO2005/027970
WO2005/028515
WO2007/042309
WO2007/070432
JP2003-310275
US4,342,566
US3,773,919
US6,696,245
US6,991,790
US7,060,268