蛋白质的生产方法 技术领域
本发明介绍的是在培养程序中控制培养基的底物添加速度生产蛋白质的方法，这种方法能够高效率地生产蛋白质。具体地说，本发明把增殖速率μ作为指标，在流动添加培养系统中，在培养环境最适合的条件下，通过控制培养基的底物添加速度来实现蛋白质的高效率生产。
技术背景
现在，大多数具有商业价值的蛋白质是通过培养能表达该蛋白质基因的宿主细胞来生产的。
采用培养技术或基因重组技术生产所希望的蛋白质，是通过培养以指数形式增殖的宿主细胞而实现的。为提高蛋白质的产量，有必要完善和控制培养环境，使宿主细胞地功能达到最有效的利用。为此，在培养程序方面，人们探索着各种短时间、高效率、高产量地培养生产蛋白质的方法。
宿主细胞的增殖速率与该宿主细胞产生蛋白质的量之间有密切的联系，为使蛋白质的生产量达到最大，就有必要使宿主细胞的增殖速率控制在非常合适的数值。为此，有关宿主细胞(微生物)的产量和增殖速率之间的关系已从各个方面进行了研究，并提出了许多方案。
根据这些方案，为了提高蛋白质的产量，在培养阶段，细胞的增殖速率至少要改变一次。(发酵工学会志，第70卷，第5号，395-404，1992)。
但是，本发明者的研究，第一次搞清了为使这种培养更优化而改变增殖速率，并不能使蛋白质的产量像所希望的那样增加。
(参照本说明书实施例1)。
因而，当需要增加蛋白质的产量而改变宿主细胞的增殖速率的时候，应在不影响宿主细胞的功能的情况下，采用新的高效率地生产蛋白质的培养方法。
本发明的目的是提供一种方法，即在流动添加培养系统中，通过控制培养基的底物的流动添加速度来控制宿主细胞的增殖速率μ，从而在短时间内得到所希望的大量蛋白质。
另外，本发明的目的是提供能高效率地生产所希望的蛋白质所用的宿主细胞的培养方法。
发明内容
本发明者们发明了不用反馈控制，而是把宿主细胞的增殖速率μ调整、控制为最合适的值(目的值)的方法，并探讨了在流动添加培养中，底物的流动添加速率和宿主细胞的增殖速率，以及目的物(蛋白质)的产量之间的关系。在培养中，通过连续改变培养基的底物的流动添加速度，在改变细胞的增殖速率μ的同时，不影响细胞功能及目的生产物的产量，并增加目的产物的产量。
本发明中包括用宿主细胞来生产蛋白质，或者通过诱导物质使宿主细胞增殖，而产生所希望的蛋白质的方法，以及宿主细胞通过流动添加培养而增殖，产生所希望的蛋白质的方法。通过连续改变培养基的底物的添加速度来控制宿主细胞增殖，把宿主细胞的增殖速率μ从最初的增殖速率改变成所设定的增殖速率，用这种方法生产所需的蛋白质。
附图简述
图1表示向培养液添加甲醇速度的时间曲线变化(实施例1)
图2表示使甲醇的添加速度连续变化的系统(本发明)的增殖速率μ的时间曲线变化(图a)、及使甲醇的添加速度瞬时变化的体系(对照1)的增殖速率μ的时间曲线变化(图b)。
图3表示使甲醇的添加速度连续变化的系统(本发明-△-)和使该添加速度瞬时变化的系统(对照①-●-)的增殖菌体浓度的比较。
发明详述
本发明中“所希望的蛋白质的组成性表达”的意思是指所希望的蛋白质经常不断的产生，而与宿主细胞的生长条件无关。
本发明中“由诱导物质使宿主细胞增殖而组成性表达所希望的蛋白质”的意思是指宿主细胞的生长条件和蛋白质的产生之间有某种关系，当宿主细胞增殖所必需的物质和诱导物质相同时，随着宿主细胞的增殖同时也产生所希望的蛋白质。
这里的“诱导物质”是指使所希望的蛋白质的编码、基因的转录、翻译能够开始的物质。例如：甲醇、半乳糖、蔗糖等。
本发明采用的“能产生所希望的蛋白质的宿主细胞”(以下简称宿主细胞)是自然生长的天然的细胞，或者是能产生外源蛋白质的变异细胞(以下也称为转化细胞)。
宿主细胞的来源并不特别加以限制。例如：微生物[细菌(如大肠杆菌属菌、芽孢杆菌属菌等)，酵母(如酵母菌属，毕赤酵母菌属等)。具体地说，埃希氏杆菌属菌中，如大肠杆菌(Escherichia coli，以下简称为E.coli)K12DH1，M103，JA221，HB101，X600，XL-1Blue，JM109等。芽孢杆菌属中如：枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114，207-21等，及酵母类的酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22，AH22R，NA87-11A，DKD-5D，及毕赤酵母等。但并不限定这些，最优选的是酵母。
当采用酵母为宿主细胞时也可以用甲醇营养性酵母，合适的甲醇营养性酵母有：汉逊酵母属及毕赤酵母属中能在甲醇中增殖的酵母。但并不限定于这些[The Biochemestry of methylotrophs，269(1982)]。优选毕赤酵母属的甲醇营养性酵母。例如：营养缺陷型毕赤酵母GTS115(NRRL Y-15851)，毕赤酵母GS190(NRRL Y-18014)，毕赤酵母PPFI(NRRL Y-19017)，野生型毕赤酵母株(NRRL Y-1430、NRRL Y-11431)等。
优选的宿主细胞，是能够产生和该宿主细胞异种的所希望的蛋白质(以下称为异源蛋白质)的转化细胞。这种细胞只要具有能够编码异源蛋白质的氨基酸外源DNA序列，并且根据该DNA的编码产生所希望的异源蛋白质即可。并且获得该细胞方法也不特意加以限定。例如：使用重组DNA技术，用含编码所需蛋白的DNA的质抗或噬菌体转化获得。
作为本发明的宿主细胞的具体例子，如产生HSA的宿主细胞。通过该细胞的准备及使用而产生HSA的方法，可以通过众所周知的方法实施。
具体的说，例如使用已知的人血清白蛋白基因的方法。(特开昭58-56684号，和58-90515号，和58-150517号公报)，使用新的人血清白蛋白基因的方法(特开昭62-29985号，特开平1-98486号公报)，使用合成的信号序列的方法(特开平1-240191号公报)，使用血清白蛋白信号序列的方法(特开平2-167095号公报)，把重组质抗整合入染色体的方法(特开平3-72889号公报)，使宿主细胞相互融合的方法)特开平3-53877号公报)，在含有甲醇的培养基中使其突变的方法，使用突变的AOX2启动子的方法(特开平4-299984号公报)，由枯草菌产生HSA的方法(特开平62-25133号公报)，由酵母产生HSA的方法(特开昭60-41487号，和63-39576号，和63-74493号公报)，由毕赤酵母属酵母产生HSA(特开平2-104290号公报)等。
本发明方法所生产的蛋白质，也无特别限定，上述的来自天然的宿主细胞产生的该细胞的结构蛋白质，以及转化细胞产生的外源蛋白质等无论哪种蛋白质都可以。
具体地说，作为宿主细胞的结构蛋白质，例如RNA聚合酶、肌动蛋白和呼吸系统及糖酵解系统相关的酶等等。作为异源蛋白质，例如：干扰素、尿激酶、尿激酶原、t-PA(组织纤维蛋白溶酶原激活因子)，G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)，HSA(人血清白蛋白)，IGF(胰岛素样生长因子)，尿性胰蛋白酶抑制剂(UTI)等。优选的是HSA、干扰素、尿激酶、尿激酶原、IGF、UTI。最优选的是HSA。
对于宿主细胞的异源蛋白质的组合也无特别限制，可以适当的组合。例如：大肠杆菌和干扰素，酿酒酵母和尿激酶原，酿酒酵母和HSA，毕赤酵母和HSA等。
宿主细胞(转化细胞)的培养，可以通过流动添加培养法，采用含有各种碳能源及/或营养的培养基(初期培养基)培养，并根据其状况从某一时刻开始，向该培养基中追加控制宿主细胞增殖的底物，使到培养终结时都不将目的蛋白质分离出此系统的方法。(特开平3-83595号公报)。
本发明中的“控制宿主细胞增殖的底物”是指适合于让宿主细胞增殖的底物。优选的是能成为碳源的底物。
该底物实施例包括：甲醇、甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖等。这些并不限定一种成分，也可以是两种以上成分。
当采用毕赤酵母作为宿主细胞时，其优选的底物是甲醇、甘油及其组合物。宿主细胞是酿酒酵母时，其优选的底物成分是半乳糖、蔗糖等。采用大肠杆菌时，适合的底物例子是乳糖。
另外，往培养基中添加的底物的形态，可以是单一的，也可以是几种成分(例如维生素、无机盐等)的混合物。并且添加的形态无论是固体状、粉状、颗粒状、液体状等都可以，而优选的是能够均匀迅速的溶解到培养液中的液体状态。
宿主细胞初期培养时采用的碳能源及/或营养源，是为适合培养的宿主细胞而采用的众所周知的碳能源及/或营养源。采用的碳能源，例如：葡萄糖、甘油。采用的营养源如氮源(例如：酵母提取物，细菌胨，酪蛋白，水解物，氨基酸，磷酸铵，醋酸铵等)，磷酸源(磷酸，磷酸铵等)，无机质源及其它微量元素(例如：铁、锌、铜、镁、锰、钙、钼、钴等)，以及维生素(例如：生物素，泛酸，维生素B1等)。
本发明中“使底物的添加速率连续变化”是指向培养罐内添加底物的速度，不中断地连续地改变。其结果，宿主细胞的增殖速率μ由当初的增殖速率平稳地转变为所预定的增殖速率。
本发明中“宿主细胞的增殖速率μ是指单位时间(hr)内相当于单位细胞量的宿主细胞增殖量，一般以下式表示：μ=1XV×ΔXVΔt]]>
式中：X是菌体浓度(g/L)，V是培养基量(L)，t是培养时间(hr)，ΔXV，Δt分别表示XV，t的变化量。
本发明中“从最初的增殖速率转变为所预定的增殖速率”意思是指把宿主细胞的最初增殖速率，在流动添加培养过程中转变为不同的所预定的增殖速率。优选的最初增殖速率，所预定的增殖速率及何时转变(换句话说：保持最初的增殖速率的时间)可以通过增殖速率μ和生产速率p之间的关系求得(发酵工学会志，第70卷，第5号，395-404，1992)。
在此所言的生产速率ρ是单位时间(hr)内，单位细胞量的蛋白质生产的增加量，一般以下式表示：ρ=1XV×ΔXVΔt]]>
式中：P是蛋白质的生产量(g/L)，V是培养基量(L)，t是培养时间(hr)，ΔPV，Δt各自表示PV，t的变化量。
该转变也可以进行多次。
本发明中所采用的理想培养温度，是适合所培养的宿主细胞增殖，并产生所需的蛋白质的温度。宿主细胞是大肠菌时为20-46℃，优选温度是36-38℃；是酵母时大约20-35℃，优选温度大约23-30℃；是枯草菌时28-40℃，优选温度为36-38℃。
培养液的pH也可以调整为适合培养的宿主细胞的增殖，及产生所希望的蛋白质的pH。再者，培养槽的溶解氧含量可以在10％-70％的饱和范围内适当地选用。
以下根据实例及参考实例详细说明本发明，只是本发明并不限定于此。
实例1：
采用把能够产生HSA的毕赤酵母属酵母UHG42-3株(特开平4-29984号公报上记载着制作方法。)的增殖速率μ由当初的增殖速率μ′＝0.025转变为μ″＝0.002来生产HSA。具体方法如下：
(1)培养方法
①前培养
前培养采用YPD肉汤(2％细菌胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)。详细作法：把放在20％甘油中冰冻保存的毕赤酵母属酵母UHG42-3株的的菌体悬液1ml(OD540＝10)，植入含有50ML的YPD肉汤，300ml量的锥形瓶中，30℃，24小时振动培养。
②正式培养
正式培养，在一定时间里，采用表1组份的培养基(初期培养基)，阶段培养后，把甲醇按图1所示的流动添加速度，连续地添加。
表1初期培养基的组成成份 浓度(/l)甘油H3PO4(85％)CaSO4 2H2OK2SO4MgSO4 7H2OKOH0.2g/I生物素溶液YTM溶液 40.0g 14.0mg 0.6g 9.5g 7.8g 2.6g 1.6ml 4.4ml
YTM溶液的组成成份 浓度(/l)FeSO4 2H2OCuSO4 5H2OMnSO4 4-5H2OZnSO4 7H2OH2SO4 65.0 6.0 4.11 20.0 5.0(ml)
详细的培养方法是：把1.7L的成批培养基放入10L容量的发酵缸(D型、10L)，再植入34mL前培养液，通气搅拌培养。培养温度是30℃。搅拌速度设置在900rpm，进行成批培养，pH值控制在5.85，为了消除泡沫，根据必要添加泡沫消除剂。
在培养时，初期培养基中的甘油全部耗尽时(培养24小时)开始添加甲醇，甲醇的添加速度根据下式来控制。[t表示甲醇添加开始后的时间间隔(hr)]。
0≤t＜72时、F(t)＝3.712×exp(0.025×t) (g/hr)
72≤t＜92时、F(t)＝22.456×exp[-0.025×(t－72)]
92≤t时、F(t)＝13.62×exp[0.002×(t－92)]
图1表示甲醇添加速度的时间曲线变化，(培养时间在24至96小时之间时用实线，培养时间在96-116小时之间时用细虚线，培养时间大约在116-360小时时用实线。)开始添加甲醇时，培养时间约在第24小时到第96小时。根据甲醇的添加把毕赤酵母属酵母的最初增殖速率μ′设置在0.025。接着，甲醇的添加速度一旦象图中的细虚线所示的那样平稳时，就减少添加量，继续添加甲醇把毕赤酵母属酵母的增殖速率μ″定在0.002。
作为比较进行两组对照实验，①μ从0.025转变为0.002时，添加速度瞬时改变体系的培养，②μ不转变体系的培养。
①在μ转变时，甲醇的添加速度瞬时改变体系中，甲醇的添加速度由下式控制[t表示甲醇添加开始后的间隔时间(hr)]。该系统的甲醇添加速度的随时变化，在图中用实线及粗实线表示。
0≤t＜72时F(t)＝3.712×exp(0.025×t) (g/hr)
72≤t＜时F(t)＝13.086×exp[0.002×(t－72)]
即甲醇添加开始时，培养大约在24小时到96小时之间，根据甲醇的添加而把毕赤酵母属酵母的最初增殖速率μ′定为0.025，接着把毕赤酵母属酵母所规定的增殖速率μ″转变为0.002时，甲醇的添加速度瞬时改变，把μ控制转变为0.002。
②中的μ不转变体系的甲醇添加速度根据下式控制。[(t表示甲醇添加开始后的间隔时间(hr)]。该式的控制是μ不转变体系中适宜的培养方法。即μ＝0.015时开始送料，溶解氧浓度(培养液中溶入的氧浓度)降低到一定的浓度时，开始固定速度流动添加的方法。该系统的甲醇添加速度的随时变化用图1中的虚线表示。
0≤t＜127时F(t)＝2.176×exp(0.015×t)＋1.632(g/hr)
127≤t时、F(t)＝16.253
图2是表示甲醇的添加速度在连续变化的体系(本发明)中μ转变的方法[图2(a)]，和在添加速度瞬时变化的体系(比较对照①)中μ的转变方法[图2(b)]相比较的结果。
作为培养的结果，图3表示菌体浓度的随时变化(本发明和对照①)。表2表示培养结束时HSA产生的比例(本发明，对照①及②)。
表2培养系统SHA产生比例有无μ转变添加速度的转变无(对照②)有 瞬时变化(对照①)有 连续变化(本发明) 100％ 107％ 156％
比较培养360小时后产生的HSA量，μ转变(本发明、对照①)与不转变(对照②)相比，从转变得结果更好。即使在转变的情况下，与瞬时改变流动添加速度时HSA的产生量(107％)相比，连续变化流动添加速度时，HSA的产生量增大为156％，由此可知，μ转变并使底物(甲醇)的添加速度进行连续的变化，所需的蛋白质(HSA)的产生量会增加。
实例2
本培养只是把甲醇换成表3所记载的送料培养基，其它与实例1相同。其结果同实例1相似。
表3送料培养基的组成 成份 量(ml) YTM溶液 2 甲醇 1000
参考实例1菌体浓度的测定：
在任意培养时间内对培养液进行取样，用蒸馏水稀释，使测定时的OD540值为0.3以下，用分光光度计(UV2200型，岛津制作所)测定540nm时的吸光度，其值乘以稀释率，作为培养液的吸光度，根据公式OD540值/5.6(OD540＝5.6相当于1g干细胞)，从该吸光度算出干燥菌体浓度。
参考实例2HSA浓度的测定：
在任意时间内对培养液进行取样，以15,000rpm离心5分钟，得到的上清液通过超滤器C3HV澄清过滤后，在下述条件下，由HPLC进行凝胶过滤分析。
层析柱：TSKgel G3000SWxl
流动相：0.3M NaCl，50mM磷酸钠，0.1％NaN3 pH6.5。
流速：1.0ml/min
注射量：50μl
检测：A280、A350(双波长)
参考实例3 甲醇浓度的测定：
在任意培养时间内对培养液进行取样，以15000rpm离心5分钟，将得到的上清液通过超滤器C3HV澄清过滤后，在下述条件下，由HPLC进行定量分析。
层析柱：Sugar-pak Ca(Waters社制)
流动相：0.02％NaN3
层析柱温度：80℃
注射量：28μl
检测仪器：差示折射计
在工业上利用的可能性
本发明通过培养基的底物添加速度的变化，在流动添加培养系统最适宜的状态下，能够求得最合适的增殖速率μ和生产速率ρ。并且由此进行流动添加培养，使宿主细胞的高密度培养成为可能，在短时间内，能够高效率地生产所需的蛋白质。因此本发明的方法对于HSA、IGF、尿激酶原、UTI等商业价值很大的蛋白质的工业生产极为有用。