说明书制备产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法
政府利益的声明
本发明是基于美国国立卫生研究院授予的资助金DK057539和DK58282在政府的支持下做出的。政府对本发明有一定的权利。
发明背景
1.技术领域
治疗和预防1型和2型糖尿病的方法。
2.背景技术
糖尿病是一类以慢性高血糖以及长期并发症为特征的病症。这类病症包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其它类型的糖尿病。免疫介导型（1型）糖尿病（或胰岛素依赖型糖尿病，IDDM）是一种儿童和成人的疾病，目前还没有合适的治疗或预防方法。1型糖尿病占所有人糖尿病的约10%。
1型糖尿病与非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）的区别在于仅1型糖尿病涉及胰岛郎格罕细胞（pancreatic islets of Langerhans）中产生胰岛素的β细胞的特异性损坏；胰腺中的α细胞（产生胰高血糖素）或δ细胞（产生生长激素抑制素）是多余的。胰腺β细胞的逐渐减少导致产生的胰岛素不足，因此引发伴随并发症的糖代谢异常。1型糖尿病主要发生在有遗传性糖尿病倾向的人中。虽然1型糖尿病的病因主要是来自基因组分，但是环境或非生殖基因因素也发挥着重要作用。在美国，患有1型糖尿病的人为1/300。1型糖尿病的患者数每年以约3%-5%的速率增长。
从1992年开始，胰岛素已经成为治疗各型糖尿病和其它与胰岛素缺乏或产量减少有关的疾病的唯一可用的治疗方法，然而，胰岛素并不能预防所述疾病的长期并发症，所述疾病的并发症包括对血管、神经、眼睛和肾脏的损伤，这可能会影响视力、肾功能、心脏功能和血压，而且还可能引起循环系统的并发症。这是因为胰岛素治疗不能完全代替丧失的胰岛素功能。尽管经过数十年的研究，且在1974年出现了胰腺细胞移植以及埃德蒙顿方案（Edmonton Protocol）用于胰腺细胞移植成功的新主张，但是替换产生胰岛素的细胞的成功还是不乐观。与胰腺或胰腺移植有关的阻碍包括难以获得足量的组织，并且还没有克服被移植的胰腺存活率低和在受体体内成功发挥功能的问题。在移植四年后，还有不到10%的已经接受胰腺细胞移植的患者仍然表现为胰岛素依赖型。而且，尽管有了新的免疫抑制方法，但仍对18%的患者存在严重的副作用。
因此，需要其它的治疗方案来治疗、预防和/或降低发展成与胰腺功能受损相关的糖尿病或其它疾病的风险。
在描述本发明的实施方式之前，应该理解的是，本发明并不限于描述的具体过程、组分或方法，因为这些可以变化。还应该理解的是，说明书中使用的术语仅是为了描述特定的实施例（version）或实施方式，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围由随附的权利要求限定。除非明确指明，否则，本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实施方式的实践或试验中可以使用与本文中描述的这些相似或等价的任一方法和原料，但是现在描述的是优选的方法、设备和原料。本文提及的所有出版物都以引用的方式将其全部内容纳入本文。不能借助在先发明而将本发明理解为承认本发明没有资格早于这些公开文本。
附图说明
附图中的各图仅以示例性方式而不是以限制性的方式来说明本发明，其中：
图1.NKO小鼠中的产生胰岛素的肠细胞。（A）对照小鼠和交叉有Neurog3-Gfp报告小鼠的NKO小鼠的肠中Neurog3-Gfp（红）和Foxo1（绿）的共定位分析。（B）NKO小鼠中Neurog-Gfp和Foxo1的共定位分析的缺乏。（C）胰腺（轮廓）和肠中的胰岛素免疫组织化学（红）染色。最初放大倍数：200×。样本是从1天大的小鼠中获得的。（D）在对照小鼠和交叉有Ins2-Gfp敲入小鼠的NKO小鼠的胰腺（顶部）和绒毛（底部）中的直接荧光。（E）用pNKO：Ins2-Gfp小鼠中的胰岛素（红）和Gfp（绿）进行两倍免疫荧光。（F）在NKO:Rosa26eGf小鼠和对照杂合同窝出生仔畜中进行谱系跟踪实验。用Gfp（绿）和胰岛素（红）进行免疫组织化学染色分析。Gfp+/Ins+细胞（用箭头表示）是重组酶介导的重组发生的细胞的后代。图1的1G（临时图（prov）中的旧图1L）总结了Ins2+细胞的定位。成年小鼠肠的示意图表明了神经元素3‐Gfp+(红三角形)和Ins2+细胞的定位，这从NKO:Ins2‐Gfp和NKO:神经元素3‐GFP小鼠中可以得出。将这个插入到图1F之后的PPT中。
图2.消化道Ins+细胞与胰腺β-细胞具有共同的基本特征。
用（A）葡糖激酶（Gck）、（B）激素原转化酶2（Pc2）、（C）磺酰脲受体1（Sur1）、（D）葡萄糖转运子2（Glut2）和（E）突触素进行免疫荧光。C中的插图显示了双阳性细胞的实例。最初放大倍数：100×（A、C、D、E）和200×（B）。
图3.胰岛素的分泌和生物活性。（A，B）补充有指示浓度的葡糖糖和0.5mM二氮嗪（Dzx）或10nM格列本脲（Glib）的HEPES-Krebs Ringer缓冲液中培养的NKO(蓝柱)和对照（黑柱）肠中葡萄糖依赖型胰岛素和C肽的分泌。使用成年肠进行实验（n=4）。将WT胰腺作为对照。（C）NKO(蓝柱) 或对照小鼠（黑柱）中酸-乙醇提取物对5天大的小鼠腹腔注射后的血糖水平的影响。用抗胰岛素中和抗体（Ins Ab）或同种型匹配对照IgG（IgG）预培养所述样品。在注射前，先将重组人胰岛素经过酸-乙醇沉淀（酸/EtOH）（a和b中n=8，c中n=12）。
图4.STZ-介导的消融后消化道Ins+细胞的再生。（A）NKO小鼠（正方形）和对照小鼠（菱形）中喂食的葡萄糖水平。箭头表示STZ给药（STZ）和处死（SAC）的时间。从第3天至第28天，给药WT对照小鼠胰岛素（2-4U/qd）（n=16）。（B）STZ后NKO小鼠和WT对照小鼠的存活图（n=16并且，各自地）。（C）给药STZ前后NKO小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验和给药STZ后WT对照小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验。（D）用抗胰岛素（D0和D3）以及抗胰岛素和抗Pc2抗体（D28）进行注射STZ前（D0）后（D3和D28）NKO肠中的消化道Ins+细胞的免疫组织化学染色分析。右图中显示的是注射STZ前（D0）后（D28）的对照胰腺部分的胰岛素免疫染色。（E）注射STZ后消化道Ins+细胞的谱系追踪。用如该方法所示STZ处理NKO:Ins2-Gfp双突变小鼠，并用抗Gfp(绿)或Pc2(红)抗体给肠部分染色。在D和E中，我们从每个区域测量到了三种水平的十二指肠、空肠、回肠和结肠（n=4）。最初的放大倍数：200×。
图5.肠Neurog3的定位。用Neurog3-Gfp转基因小鼠的新生消化道中的抗Neurog3（红）和抗Gfp（绿）进行免疫组织化学染色分析。两种检测方法的完全重叠表明ffp是消化道中Neurog3定位可靠的标记。最初的放大倍数：100×。
图6.肠内分泌祖细胞中Foxo1消融扩大了Neurog3+细胞池。（A）在WT和NKO小鼠中用抗Neurog3抗体（绿）进行免疫组织化学染色分析。（B）在Neurog3-Gfp和NKO:Neurog3-Gfp小鼠中用抗Gfp抗体和抗嗜铬粒蛋白A（Chromagranin A）抗体（分别为绿和红）进行免疫组织化学染色分析。最 初的放大倍数：A和B中都为20×。（C）肠上皮细胞制备中Neurog3mRNA的水平（n=8）。（D）从Neurog3-Gfp和NKO:Neurog3-Gfp小鼠分离的肠上皮细胞制备中的流式细胞术数据。（E）D中数据的定量（n=6）*＝P<0.05,**=P<0.01。
图7.消融了Foxo1的消化道中产生胰腺激素的细胞。显示NKO小鼠的末端回肠和结肠的Gcg+和Pp+细胞（绿）的荧光免疫组织化学染色分析，而不是对照小鼠的。最初的放大倍数：200×。
图8.用抗胰岛素抗体（红）进行荧光免疫组织化学染色分析，这显示的是4个月大的成年NKO小鼠结肠中存在Ins+细胞。最初的放大倍数：100×。
图9.从NKO小鼠（蓝）中富含DTZ的片段和对照小鼠（黑）中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中Ins1和Ins2mRNA表达的qPCR分析（n=8）。*＝P<0.05.
图10.PKO小鼠的产生和分析。（A）一天大的PKO小鼠和交叉有Neurog3-Gfp转基因报告小鼠的对照小鼠中的Foxo1(绿)和Gfp免疫化学染色（红）。（B）9个月大的PKO小鼠回肠中胰岛素免疫染色（红）。（C）一天大的PKO:Neurog3-Gfp和Neurog3-Gfp对照小鼠的十二指肠中的胰岛素（红）和Gfp免疫染色（绿）。最初的放大倍数：200×。
图11.从NKO小鼠（蓝）中富含DTZ的片段和对照小鼠（黑）中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中β细胞分化物Gck、Pc2、Kir6.2和Sur1的mRNA表达的qPCR分析（n=8）。*＝P<0.05,**=P<0.01。
图12.调节从NKO小鼠（蓝）中富含DTZ的片段和对照小鼠（黑）中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中β细胞分化物Nkx6.1、MafA、Pdx1、NeuroD1、Pax4、Nkx2.2和Arx的转录因子的mRNA表达的qPCR分析（n=8）。*＝P<0.05,**=P<0.01。
图13.β细胞转录因子表达的免疫组织化学染色分析。（A）Pdx1表达和 (B)NKO小鼠和WT对照小鼠的成年结肠和末端回肠中的Nkx6.1(绿)。胰岛素的免疫反应活性用红色表示在两块板组合中。两个转录因子的细胞质定位可能是由于固定步骤。最初的放大倍数：400×（顶端）和200×（底部）。
图14.NKO小鼠中Aes的表达。从NKO小鼠（蓝）中富含DTZ的片段和对照小鼠（黑）中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中Aes mRNA表达的qPCR分析。**=P<0.01。（B）给药STZ后成年NKO小鼠和WT对照小鼠结肠中抗胰岛素（绿）和Aes（红）的免疫反应活性。最初的放大倍数：200×。（C）用NKO:Rosa26eGfp和对照小鼠的胰腺和消化道中的Pc2和Aes抗体（红）进行的免疫组织化学染色分析。最初的放大倍数：20×。
图15.Foxo1作用模型。在胰腺中，N3Prog会产生所有的内分泌细胞类型（橙色标志）。在消化道中，它们会产生消化道内分泌细胞（橙色标志），其中，一些消化道内分泌细胞与胰腺有共同之处，而一些消化道内分泌细胞是消化道特有的。在这些过程中，Foxo是自由的，也就是它可以使这些事件发生。胰腺特异性细胞类型包括产生胰岛素的β细胞、产生胰高血糖素的α细胞和产生胰腺多肽的细胞，在正常的消化道中没有发现这些细胞类型。我们提出，通常Foxo会对消化道中这些细胞类型的产生发挥抑制作用，并且Foxo抑制会导致消化道中出现这些细胞类型。
图16.放大倍数为100×时活体（live）荧光显微照片。将隐窝（crypts）从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。第3天：未观察到隐窝细胞转化为Ins-GFP细胞，因为在正常小鼠和Neurog3-Foxo1敲除小鼠中没有绿色细胞。
图17.第6天：由于Foxo1DNA失活，隐窝细胞转化为Ins+GFP细胞，这可由表示胰岛素+GFP细胞的绿色细胞证明。将隐窝从搬运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。分离的 肠细胞在培养基1中保持3天，然后转换到培养基2中保持3天。放大倍数为100×时的活体荧光显微照片。
图18.第6天：在Foxo1消融的隐窝中，隐窝细胞转化为Ins+GFP细胞的转化率提高（即NKO小鼠）放大倍数为200×时的活体荧光显微照片。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。转化效率提高，可由表示胰岛素+GFP细胞的绿色细胞的增加证明。将分离的肠细胞在培养基1中保持1天，在培养基2中保持2天，并转换到培养基4b中保持3天。
图19.第6天胰岛素+GFP细胞为活细胞。绿色细胞表示胰岛素+GFP细胞。蓝色表示死细胞。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。将分离的肠细胞在培养基1中保持1天，在培养基2中保持2天，并转换到培养基4b中保持3天。
图20.第6天：隐窝细胞转化成的Ins+GFP是由于Foxo1RNA抑制作用的细胞；绿色细胞表示胰岛素+GFP细胞。放大倍数为200×时的活体荧光显微照片。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。将分离的消化道细胞在培养基1中保持1天，在培养基2中保持2天，并用50nM的Foxo1siRNA处理正常小鼠的消化道细胞(右)或将GC含量匹配的阴性对照小鼠（左）在培养基4b中保持72小时。
发明内容
一种治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的方法，所述方法包括用治疗有效量的药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA 和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。所述疾病或病症选自包括1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良、高血糖症、胰岛素敏感性下降、空腹血糖增加、餐后血糖增加和肥胖症组成的组中。所述治疗有效量是指产生效果的量，所述效果选自由葡萄糖耐受性增强、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增强、空腹血糖降低、餐后血糖下降、体重增加减少、脂肪量降低、体重减轻增加和胃肠道中生成产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞组成的组中。在优选的实施方式中，将所述药剂给药至胃肠道。
其它的实施方式涉及用于治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的药物制剂，所述药物制剂含有有效量的药剂，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。在某些实施方式中，所述有效量是指产生效果的量，所述效果选自由葡萄糖耐受性增强、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增强、空腹血糖降低、餐后血糖下降、体重增加减少、脂肪量降低、体重减轻增加，以及在胃肠道中生成产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞组成的组中。
另一个实施方式涉及一种制备肠内分泌细胞的方法，在哺乳动物中，所述肠内分泌细胞产生和分泌胰岛素，所述方法包括用药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义 DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。在一个实施方式中，应答于药剂的给药，产生胰岛素的肠内分泌细胞还产生一种或多种胰腺激素，所述胰腺激素选自由以下胰腺激素组成的组中：胰高血糖素、胰腺多肽、葡糖激酶和葡萄糖转运体2（glut2）。在一个实施方式中，产生胰岛素的肠内分泌细胞还产生一种或多种蛋白，所述蛋白选自由激素原转化酶Pc2、Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2和Pax4组成的组中。
另一个实施方式涉及一种增强哺乳动物中葡萄糖耐受性或胰岛素敏感性的方法，所述方法包括用治疗有效量的药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。
一个实施方式涉及一种制备产生胰岛素的肠内分泌细胞的方法，所述方法包括：a.从哺乳动物中获得不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的细胞群，b.在使有效部分细胞群产生胰岛素的条件下，将细胞群与药剂按一定量进行接触，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，和c.收集产生胰岛素的肠内分泌细胞。另一个实施方式涉及一种治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的方法，所述方法包括给哺乳动物再引入足量的产生胰岛素的肠内分泌细胞，以治疗或预防所述疾病或病症。另一种实施方式涉及由所述方法制得的产生胰岛素的肠内分泌细胞并涉及含有所述细胞的药物制剂。
另一种实施方式是一种用于预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾 病或病症的药物，所述药物含有治疗有效量的药剂，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。
其它的实施方式涉及用于鉴别诱导哺乳动物消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞表达胰岛素的药剂的基于细胞的高通量筛选分析的变化方案，所述变化方案包括：a.分离包括消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的细胞群，并在适于产生和分泌胰岛素的条件下培养所述细胞群，b.提供不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的对照细胞群和测试细胞群，c.将测试细胞群与测试药剂接触，d.测定对照细胞群和测试细胞群的胰岛素表达水平，和e.如果测试细胞群中的胰岛素水平明显高于对照细胞群中的胰岛素水平，筛选出该测试药剂。在某些实施方式中，消化道肠内分泌细胞中编码胰岛素的基因可以与被可视化（visualized）的蛋白或肽可操作地连接。
定义
本文中使用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物，如人、犬、牛、马、袋鼠、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人类动物。优选的动物、患者或受试者为人。
“列举的疾病或病症”是指以胰腺功能受损为特征的疾病或病症，包括不适当的低胰岛素水平、1型和2型糖尿病、代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、胰岛素敏感性下降、空腹血糖增加、餐后血糖增加。由不适当的低胰岛素水平是指胰岛素水平低至足以成为所述疾病或病症的至少一种症状的原因。胰腺功能受损的病理与受试者产生和/或分泌胰岛素的胰 腺的生产力减退和/或分泌胰腺肽如胰高血糖素、胰腺多肽、生长激素抑制素的能力改变（增加或减少）有关。与胰腺功能受损有关的病症包括有时被称作成年隐匿性自身免疫性糖尿病的病症、前驱糖尿病（pre-diabetes）、空腹血糖受损、葡萄糖耐受性受损、空腹高血糖症、胰岛素抵抗综合征和高血糖症状。
实施方式中使用的荧光示踪剂包括GFP和其衍生物、双脒基黄（Diamidino yellow）、快蓝（Fast blue）、辣根过氧化物酶、霍乱毒素B、伪狂犬病病毒、羟芪巴脒（Hydroxystilbamidine）、德克萨斯红和异硫氰酸荧光素，以及本领域已知的其它物质。本文描述的实验中使用了绿色荧光蛋白（GFP），然而，现在有许多GFP的突变体[Shaner N,Steinbach P，Tsien R(2005)."A guide to choosing fluorescent proteins"(PDF).Nat Methods2(12):905–9.]。从http://nic.ucsf.edu/dokuwiki/doku.php?id=fluorescent_proteins中可以找到各种荧光蛋白的名单。
“活性剂”是指使任何肠内分泌祖Ins-细胞分化为Ins+细胞的任何药剂、多肽、核酸、小分子。优选的活性剂是那些降低Foxo蛋白表达或生物活性的活性剂（包括分别通过降低基因或mRNA的转录或翻译，或降低生物活性）。核酸活性剂包括siRNA、shRNA和反义RNA或DNA；多肽包括抗体和抗体片段和酶如COP1。
“干细胞”是指未分化的细胞，所述细胞可以无限分裂而自我更新，并分化为多种类型的细胞。所述PKO小鼠实验（图4）是敲除包括干细胞的所有消化道细胞中的Foxo1，而且结果表明其表型与NKO相似。
消化道中的“祖细胞”是指来源于干细胞的细胞，是多能细胞，但自我更新能力有限。
“N3肠内分泌祖细胞”和“N3Prog”是指表达神经元素3（neurogenin3）的胰岛素阴性消化道祖细胞的子集（subset），产生Ins-肠内分泌细胞。已经 发现消化道中的N3Prog，后称作“消化道N3Prog”有分化为产生和分泌胰岛素的细胞（“消化道Ins+细胞”）的潜力，但是这种能力在发育过程中会受到Foxo1的抑制。胰腺N3Prog在胎儿发育过程中分化为胰腺产生胰岛素的细胞，但仍然不清楚的是，出生后是否有N3Prog，或出生后胰腺N3Prog在正常或异常条件下是否能够分化为胰腺的激素分泌细胞。应该注意的是，虽然肠内分泌细胞（消化道）和胰腺N3Prog通常都被称作N3细胞，但它们具有不同的特征。
“不产生胰岛素的消化道祖细胞”或“Ins-消化道Prog”广义地指能够分化为产生胰岛素的消化道细胞（消化道Ins+细胞）的任何消化道祖细胞，包括干细胞和N3Prog。
“肠内分泌细胞”是指胃肠道专有的内分泌细胞，大多数细胞是不再产生神经元素3的N3Prog的子代。肠内分泌细胞是胰岛素阴性细胞（消化道Ins-）；它们产生各种其它的激素，如胃泌激素、胃饥饿素、神经肽Y、肽YY3-36(PYY3-36)血清素、分泌素、生长激素抑制素、胃动素、缩胆囊素、抑胃肽、神经降压素、舒血管肠肽、葡萄糖依赖型促胰岛素多肽（GIP）和胰高血糖素-样-肽-1（glucagon-like peptide-1）。
“消化道Ins+细胞”和“胰岛素阳性消化道细胞”是指产生和分泌来源于Ins-消化道的胰岛素的任何肠内分泌细胞。消化道Ins+细胞有胰岛素阳性表型（Ins+)，从而它们可以表达成熟β细胞的标记物，并分泌应答于葡萄糖和磺酰脲的胰岛素和C肽。消化道Ins+细胞主要来自N3Prog，且也来自于消化道干细胞。这些细胞是在NKO（敲除了Foxo1）小鼠中意外发现的。与胰腺β细胞不同的是，消化道Ins+细胞在消融（ablation）后可通过β细胞毒素、链脲毒素的作用再生，并逆转小鼠的高血糖症。
“NKO小鼠”或“敲除了Foxo1的小鼠”是指在N3Prog中不表达Foxo1的转基因小鼠。并不是敲除了Foxo1的小鼠（下文称作“NKO小鼠”）消化道中 的所有肠内分泌细胞都产生和分泌胰岛素；一些也是不产生胰岛素的细胞（下文称作“Ins-”）。
在降低Foxo蛋白的表达或生物活性的情况下，显著的降低是指将Foxo蛋白的水平降低至足以使肠内分泌细胞或其它不产生胰岛素的细胞获得Ins+表型，包括表达胰岛素。
明显高于测试中的对照水平是指可通过通常使用的测试方法（酶联免疫吸附测定法或放射免疫法）进行检测，而在对照细胞群中通过这样的测试不能检测到胰岛素。Foxo蛋白表达水平的显著下降是指下降量大于对照值的50%（注释：我们知道下降量高达50%时，什么也不会发生，因此所述下降量必须高于50%）。
在测定对照细胞群和测试细胞群胰岛素表达水平的条件下，在与使测试细胞群变成产生胰岛素的细胞的药剂接触后，明显更高是指胰岛素的任何可靠的可检测水平，因为未处理的细胞是不产生胰岛素的细胞。筛选试验领域的技术人员根据试验能够定义明显更高或明显更低。
“预防疾病”包括但不局限于预防可能易感染疾病（或病症）的受试者中发生的疾病，但还未被诊断为患有所述疾病；抑制疾病，如抑制组织疾病的发展；如通过疾病的恢复减轻疾病；如通过减轻疾病的症状和/或延迟疾病的发作减轻由疾病引起的症状。一个实例是降低高血糖症患者的血糖水平，和/或对受试者的血糖水平保持可接受的控制。本领域技术人员可以确定所述治疗、预防、症状和/或病症，而且标准的教科书中也有记载。
“治疗”患者的疾病、病症或症状是指采取措施以获得有益的或想要的效果，包括临床效果。为了本发明的目的，有益或想要的临床效果包括但不局限于减轻或改善所述疾病的一种或多种症状；缓解疾病的程度；延迟或减慢疾病的恶化；改善和减轻或稳定病情。
当所述疾病为1型糖尿病时，所述症状包括尿频、烦渴、极度饥饿 （extreme hunger）、非正常的体重降低、容易疲劳（increased fatigue）、易怒、视力模糊、外阴瘙痒（genital itching）、奇怪的周身疼痛（odd aches and pains）、口干、皮肤干痒、阳痿、阴道酵母菌感染（vaginal yeast infections）、切伤和擦伤的愈合不良、过度或非正常的感染。这些症状与特征性的临床实验发现有关，所述临床实验发现包括高血糖（血液中过高的糖浓度，即>125mg/dl)、血糖失控（即血糖浓度在生理范围上下频繁且过度的改变，通常保持在40-125mg/dl)、饭后血糖波动、血胰高血糖素的波动、血甘油三脂的波动，而且包括病症的结果改善或缓解速率的下降，所述病症是由更高频率的包括微血管疾病的糖尿病加速和/或引发的，微血管疾病包括但不局限于伴随或不伴随中风、心绞痛、冠心病、心肌梗死、周围性血管疾病、肾病、肾脏损伤、蛋白尿升高、视网膜病变、视网膜中血管的新血管形成、神经病（包括可能造成四肢失去知觉和截肢和/或来自神经病变的中枢、自主和外围神经病变，或造成血流量减少）、皮肤病症（包括但不局限于糖尿病皮肤病变）、糖尿病脂性渐进坏死（Necrobiosis Lipoidica Diabeticorum）、糖尿病性大疱病（bullosis diabeticorum）、硬皮水疱病（cleroderma diabeticorum）、环状肉芽肿、细菌性皮肤感染（但不限于葡萄球菌，这会导致更深的感染），以及胃轻瘫（gastoparesis）（胃排空异常）。1型糖尿病可以用本领域普通技术人员熟知的方法来进行诊断。例如，通常地，糖尿病患者的空腹血浆血糖的结果大于126mg/dL葡萄糖。血糖水平为100-125mg/dL葡萄糖的患者通常被诊断为前驱糖尿病。其他症状也可以用于诊断糖尿病、相关疾病和病症，以及受胰腺功能降低影响的疾病和病症。
症状“减少”是指症状的严重性或频率的降低，或症状的消除。
“与胰腺功能受损有关的病理”或胰腺功能异常是与受试者的产生和/或分泌一种或多种胰腺激素的胰腺的功能减退有关的病理，所述胰腺激素包括胰岛素和/或胰腺肽如胰高血糖素、胰腺多肽或生长激素抑制素。与胰腺功能 受损有关的病理包括1型糖尿病和2型糖尿病。其它的病理包括那些有时被称作成年隐匿性自身免疫糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、葡萄糖耐受性受损、空腹高血糖症、胰岛素抵抗综合征和高血糖病症。
用本领域中已知的任何方法用药物或治疗性的药物组合物对受试者“进行给药”或“给药”包括直接给药，包括自我给药（包括口服给药或静脉注射、皮下注射、肌肉注射或腹腔内注射，通过肛门直肠给药）、直接进入靶组织内或上的局部给药（如有消化道Ins-Prog的消化道区域，如消化道N3Prog）或通过将治疗有效量的药物或组合物递送到靶细胞或组织的任意途径或方法进行给药。
“受试者”或“患者”是哺乳动物，通常是人，但可选地为兽医学上有意义的哺乳动物，包括但不局限于马、牛、绵羊、犬和猫。
活性剂或药物组合物的“治疗有效量”是可以实现预期治疗效果的量，所述效果如缓和、改善、减轻或消除受试者的疾病或病症的一种或多种临床表现。完整的治疗效果通过单剂量给药不一定会出现，可能仅在多剂量给药后才会出现。因此，可以通过一次或多次给药来实现治疗有效量的给药。
药物的“预防有效量”是对受试者给药时，会有预期预防效果的药物量，所述预防效果如预防或延迟疾病或症状的发作（或复发），或降低疾病或症状发作（或复发）的可能性。完整的治疗效果通过单剂量给药不一定会出现，可能仅在多剂量给药后才会出现。因此，可以通过一次或多次给药来实现治疗有效量的给药。对于糖尿病，治疗有效量也可以为增加胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性、提高血葡萄糖耐受性或减少体重、体重降低或脂肪量的量。
药剂的“有效量”是产生预期效果的量。
“药物学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分兼容，并且对其接受者无害。
“Foxo蛋白”包括小鼠的Foxo1、Foxo2、Foxo3和Foxo4；人的FOXO1、 FOXO2、FOXO3和FOXO4，和任何其他动物的Foxo1-4蛋白，包括变体、和同源基因（orthologs）、和其生物活性片段。需要注意地是，虽然FOXO2是单独被发现的，但是被证明与FOXO3基因相同。虽然它们具有两个NM数，但是它们指向相同的基因位点。
“Foxo基因”是指编码Foxo蛋白的任意基因，包括同源基因和其生物活性片段。
“Foxo mRNA”是指编码Foxo蛋白的任意mRNA，包括同源基因和其生物活性片段。
“联合”给药包括在一段时间内对患者平行用两种药剂进行给药，如用单克隆抗FOXO1、3和/或4抗体（或抗Foxo1-4）或对抗其它同源基因的抗体）和在一段时间内降低FOXO1、3和/或4表达或生物活性的药剂、共同给药（co-administration）（其中在大约相同的时间用药剂进行给药，如相互给药时间在几分钟至几小时内）、和联合制剂（co-formulation）（其中将药剂结合或混合成一种适合口服、皮下给药或胃肠外给药的单一剂型）进行给药。
具体实施方式
本发明的实施方式部分基于如下发现：敲除了Neurog3-Foxo1（NKO）的小鼠中编码Foxo1蛋白的基因的体细胞消融使显著比例的消化道N3Prog分化为胰岛素阳性肠内分泌细胞（消化道Ins+细胞），所述肠内分泌细胞产生和分泌生物活性胰岛素和C-肽和其他胰腺激素和转录因子。重要地是，消化道Ins+细胞在葡萄糖的刺激下以剂量依赖性方式分泌胰岛素，而且NKO突变小鼠消化道中的酸-乙醇提取物在体内有降血糖作用。而且，对NKO小鼠的体内研究显示：与胰腺β细胞不同的是，胰腺β细胞在用毒素链脲霉素处理后不会再生，而全功能的消化道Ins+细胞在NKO小鼠中可以再生，这可以在仅10天后就能使得高血糖症发生自发地逆转，并且在实验的92天中 保持比未处理的动物(自由采食时约为250mg/dL或空腹约为160mg/dL)保持明显更低的血糖水平。重要地是，与未处理动物不同的是，所述动物在缺少胰岛素治疗的情形下总是死亡，75%的NKO动物在没有任何附加治疗的情形下会存活，消化道Ins+细胞分泌胰岛素的能力与环境中的血糖浓度成正比，这是胰腺中产生胰岛素的健康细胞的主要特征，到目前为止，还没有其他群组具有此特征。
数据显示消化道N3Prog具有分化为产生和分泌胰岛素的细胞的能力，但是这种能力会受Foxo1基因表达的抑制。一些消化道干细胞也可以分化为Is+细胞，因此，本文中使用的术语“消化道Ins-Prog”包括能够变成Ins+细胞的任何消化道祖细胞。
以前没有人记载或猜测过保留有分化为产生胰岛素的细胞的能力的消化道中祖细胞的存在。因此，活性剂广泛地包括使消化道Ins-Prog细胞分化为消化道Ins-细胞的任何药剂。优选为降低Foxo蛋白表达或生物活性的药剂。本文中描述的筛选试验是为了鉴别活性剂。虽然本领域中有用瘦素——一种调节饮食的激素——处理可以导致消化道中出现Ins+细胞的先例，但这个过程与本文所述的过程并不同，因为本文需要另一种类型的消化道细胞“L”细胞的部分转化，“L”细胞是肠内分泌细胞。因此，没有人报道过消化道N3细胞能够产生消化道Ins+细胞，也没有任何人报道瘦素处理后Ins+细胞具有产生胰岛素的功能，更不用说以糖剂量依赖性的方式产生胰岛素。
在编码各种Foxo蛋白(Foxo1、3或4蛋白)的基因和动物自身的Foxo蛋白中分别有显著的核酸和氨基酸序列同源性，所述动物包括人和小鼠。虽然优选用减少的Foxo1产生消化道Ins+细胞，但是一种或多种Foxo或mRNA的表达降低或一种或多种Foxo蛋白的生物活性降低都会使显著比例的消化道Ins-Prog分化成消化道Ins+细胞。
使用富含有隐窝的肠片段（segments of intestines）和从正常小鼠中分离 的消化道Ins-Prog培养的细胞群的某些实验已经表明：将消化道Ins-Prog与可充分与小鼠Foxo1 mRNA互补的siRNA接触能够降低产生消化道Ins+细胞的Foxo1的表达。这表明肠内分泌祖细胞转化为产生胰岛素的细胞的能力并不限于对Foxo1基因（即DNA）的操作，而且也能够通过抑制Foxo1mRNA来实现。
至少部分基于这些发现，本发明的某些实施方式涉及产生哺乳动物消化道Ins+细胞的方法，所述方法通过将消化道Ins-Prog与药剂接触而使细胞变为消化道Ins+细胞。优选的药剂包括那些降低编码一种或多种Foxo蛋白的一种或多种Foxo基因或mRNA表达的药剂，或将一种或多种Foxo蛋白的生物活性降低到允许消化道Ins-Prog分化为具有消化道Ins+细胞表型的细胞的水平的药剂。在动物中，消化道Ins-Prog可以在原位与药剂接触，或可以将浓缩的消化道Ins-Prog细胞群从消化道中分离，或可以使用培养基中的肠外植体。实施例10中描述了其中的一些方法。某些其他实施方式涉及分离的消化道Ins+细胞本身和组织外植体，所述组织外植体包括消化道Ins+细胞，优选肠道组织，但也包括人工组织。其他的方法包括从在体外已经被重编（reprogramme）为消化道N3Prog的细胞中产生Ins+细胞。也就是说，通过处理其他类型的细胞而间接获得了消化道N3细胞。例如，其他细胞通过“重编”细胞从皮肤活检中形成产生胰岛素的细胞。虽然作者没有专门对其进行测试，但是可以想象地是，为了变成产生胰岛素的细胞，这些细胞经过了N3Prig阶段。本发明的实施方式中可以使用这些方法和本领域中已知的其他方法。Maehr R， etal.，Proc Natl Acad Sci USA.2009Sep15;106(37):15768-73.Epub2009Aug31,Generation of pluripotent stem cells from patients with type1diabetes。
本文所述治疗方法的疗效可以通过确定所述方法是否改善了所治疗的疾病的任意症状来进行监测。或者，可以监测血清胰岛素或C肽（胰岛素分 泌的副产品和功能Ins+细胞的指标）的水平，在治疗时该水平应该有所提高。或者，可以通过监测正接受治疗的受试者的血糖、葡萄糖耐受性、脂肪量、体重增加、酮体或列举的疾病或病症的其它指标（indicia）来测量疗效。
除了胰岛素分泌减少，胰腺功能受损包括产生和/或分泌一种或多种胰腺激素的能力的改变，所述胰腺激素包括一种或多种胰腺多肽，如胰高血糖素、胰腺多肽、生长激素抑制素或胃饥饿素。熟知的与胰腺功能受损有关的病理包括1型糖尿病和2型糖尿病。其他的病理包括那些有时指成年隐匿性自身免疫性糖尿病的病症、前驱糖尿病、空腹血糖受损、葡萄糖耐受性受损、空腹高血糖症、胰岛素抵抗综合征和高血糖症状。所有这些都属于治疗和预防糖尿病的含义。
其他实施方式涉及使用如测试药剂文库进行筛选以鉴别诱导消化道Ins-Prog分化为消化道Ins+细胞的那些药剂的方法。其中的一些方法将在下面标题为筛选试验部分进行描述。在体外试验中，所述筛选是高产出的。已经研发了体外系统，以在试管中从不产生胰岛素的消化道祖细胞产生消化道Ins+细胞。实施例10。某些其他实施方式涉及从消化道活体组织切片（gut biopsies）得到的胰岛素阴性祖细胞中通过生物工程制成的消化道Ins+细胞，所述消化道活体组织切片是从特殊的糖尿病患者或从有发展成糖尿病危险的患者中得到的，然后，将所述消化道Ins+细胞移植回患者中，以让自身消化道Ins+细胞提供胰岛素分泌调节的来源。
而且，已经发现使用药物二氮嗪（diazoxide）可以切断通过消化道Ins+细胞的胰岛素分泌，这是控制动物中产生任何不需要的胰岛素重要且安全的措施，所述动物已经被诱导而产生了消化道Ins+细胞，或已经通过给药消化道Ins+细胞作为治疗与产生低水平的胰岛素或胰腺功能受损有关的疾病的治疗方法进行了治疗。
本文中记载的数据提供了消化道Ins-Prog可以被诱导分化为消化道Ins+ 细胞的直接证据，所述消化道Ins+细胞以与环境中血糖浓度成正比的方式分泌生物活性胰岛素，而且消化道Ins+细胞可通过二氮嗪进行控制。
因此，本发明的某些实施方式涉及通过给药诱使消化道Ins-Prog分化为消化道Ins+细胞的治疗有效量的药剂治疗或预防1型或2型糖尿病或本文中定义的其他列举的疾病或病症的方法，所述列举的疾病或病症与动物中不适当低的胰岛素或胰腺功能受损有关。所述药剂包括那些降低Foxo或FOXO基因或mRNA表达的药剂，或将一种或多种FOXO蛋白的生物活性降低到允许消化道Ins-Prog变成消化道Ins+细胞的水平的药剂。在一些其他的实施方式中，可以通过用治疗所需的治疗有效量的消化道Ins+细胞，优选自体细胞或部分的自体细胞对动物进行给药来治疗或预防这些病症。
概述
再生医学的一个长期目标是识别调节产生胰岛素的β细胞的基因、细胞和生化过程，在患有1型糖尿病的患者中持续进行细胞替换以达到支持所述过程的目的。原始内胚层前体细胞具有内分泌命运的过程已经被详细报导3。神经元素是一类通常包括指定神经元分化的bHLH转录因子；神经元素3（Neurog3or N3）促进胰腺激素的产生。胰腺和肠内分泌细胞由以转录因子Neurog3瞬间表达为特征的祖细胞产生(1-3)。关键的步骤似乎是神经元素3-表达细胞的形成，所述细胞继续分化为所有已知类型的胰腺细胞（1,22-23）。有趣的是，神经元素3+内分泌祖细胞（本文中的N3Prog）并不仅限于胰腺，而且也发现于胃和肠中，它们在肠内分泌系统中产生大多数细胞，所述肠内分泌系统为体内最大的内分泌器官（2-3）。尽管它们有共同的内胚层源，然而，胰腺和消化道N3Prog共享即使有也很少的特性：它们产生细胞类型，所述细胞类型产生不同的肽激素，并具有显著不同的发育命运和寿命（8）。胰腺内分泌祖细胞是在胚胎发育过程中形成的，并且除在特殊情况下（24）， 成年器官中不再产生胰腺内分泌祖细胞（7），然而，消化道N3Prog可以从消化道干细胞中不断地更新，并有助于人快速-周转内分泌细胞（3）。
这两种细胞群的不同特点与位置特异性的传统理论一致，鉴于此，部分定向祖细胞会获得命令具体命运的位置-依赖性特性（25）。哺乳动物细胞的分化过程被看作是分级喂食-正向的过程，其中多功能的祖细胞的命运受位置诱因的限制。因此，基于在胰腺中（而不是在消化道中）分化成产生胰岛素的细胞的位置特异性的现有理论预测神经元素3-阳性内分泌祖细胞（N3 Prog）。迄今为止，没有人知道FOXO1、3和/或4-在消化道中表达细胞的发育、定位和功能特性。
转录因子Foxo1调节胰腺β细胞功能的多个方面（4），并在Neurog3+胰腺内分泌祖细胞中广泛表达（5）。在分离的人胎儿胰腺上皮细胞中，FOXO1的降低可增加NEUROG3+的量（39）。与胰腺相似地是，Foxo1在大部分Neurog3+肠内分泌祖细胞中表达，如双重免疫组织化学法所鉴定的（图1a和5）。
研究了小鼠的消化道Ins-细胞中Foxo1的作用，以确定它是否起到决定消化道N3Prog分化成的细胞类型的作用。实验详细描述了Foxo1在消化道Ins-Prog分化为消化道Ins+细胞中的作用，而且发现Foxo1将肠内分泌祖细胞限制为不产生胰岛素的表型，实施例和实验的描述中阐明了该发现，所述实验明确了消化道Ins-细胞的特性和它们的治疗用途。在不受理论的束缚下，所述数据显示消化道N3Prog中Foxo1的生理功能是将消化道N3Prog限制为肠内分泌谱系（lineage），从而抑制胰腺分泌谱系。虽然在胰腺中FOXO1与神经元素3共同表达，但FOXO1消融不会影响不同的胰腺内分泌细胞类型的产生（28-29）。
PKO和NKO小鼠的相似性表明上皮干细胞分化早期的Foxo1表达的降低也会解除胰腺内分泌谱系的Foxo1依赖性抑制。重要地是，消化道N3Prog 在小鼠的整个生命中都产生消化道Ins-细胞。估计这与人的情况相同。这些路径是高度保守地，并且在编码神经元素3的基因中有人突变基因，其中描述了消化道功能的异常。因此，可以在任何时间用降低消化道N3Prog中FOXO蛋白的表达或生物活性的药剂进行给药，以引发内分泌胰腺分化表型。图20也显示了这一点，证明了通过siRNA的Foxo1抑制可以诱导正常小鼠中的消化道细胞变成Ins+。因为肠细胞更新特别快，治疗时可能需要定期重新用这些药剂进行给药，如下所述。显示用链脲霉素处理的NKO小鼠能够在消化道中再生产生胰岛素的细胞的结果显示所述表型比生成一代细胞持续的时间更长。
FOXO蛋白
FOXO转录因子使激素和养分诱因与细胞转录应答相结合，以调节不同的细胞过程，所述细胞过程包括细胞存活、细胞周期进程、DNA修复和胰岛素敏感性（见综述Tran et al.,2003）。除了它们的代谢功能，FOXO蛋白可以抑制多种细胞类型的末端分化（31-32）。在胰腺中，FOXO1在负调节内分泌细胞群（26-28）和促进β细胞对压力的应答中发挥着重要的作用（29-30）。FOXO1消融不会影响不同的胰腺内分泌细胞类型的产生（28-29）。
Nakae等(2002)证明了小鼠Foxo1在不同的组织中表达，而且在肝脏、胰腺β细胞和脂肪细胞中是胰岛素敏感性的负调节子。胰岛素向FOXO1发信号的受损为2型糖尿病的新陈代谢异常提供了统一的机制。对人的研究表明FOXO1可通过人PKB/Akt、在胰岛素信号级联反应中位于PI3下游的丝氨酸/苏氨酸激酶实现负调节。该调节包括FOXO1在三个PKB/Akt磷酸化共同位点上快速且分级的磷酸化作用(Tran et al.,2003)。
Foxo蛋白的定义特征是叉头框（forkhead box）或基序（motif），具有约80-100个氨基酸的DNA结合区，且由三个螺旋（helices）和两个典型的 大环或“翼状物”组成。给这些蛋白标准化命名后(Kaestner et al.,2000)，对于人，使用所有都大写的字母（如FOXO），而对于小鼠，仅第一个字母大写（如Foxo1）。在基因库(NM_002015.3)中识别的FOXO1基因（以前也为FOXO1、FKH1、FKHR、和FOXO1A）是胰岛素应答组织中最多的FOXO同种型，所述胰岛素应答组织如肝脏细胞、脂肪细胞和胰腺细胞。FOXO4(aka AFX、AFX1、MLLT7、MGC120490、FOXO4)列于基因库NM_005938.3中；FOXO3(aka、FOXO2、AF6q21、FKHRL1、FOXO3A、FKHRL1P2；MGC12739、MGC31925、DKFZp781A0677)列于基因库NM_001455.3中。所有内容都通过引用的方式纳入本文。本领域技术人员根据这个序列并使用本领域已知的方法将能够构建合适的反义核酸和siRNA。
编码各种FOXO蛋白的基因和动物自身蛋白的基因之间的明显同源是指靶向于FOXO1mRNA的shRNA、SiRNA和反义RNA或DNA，或所述基因也可以与FOXO3和FOXO4充分互补，以减少它们的表达，所述动物包括人和小鼠。类似地，旨在靶向于FOXO4或FOXO3的siRNA和反义可以与FOXO1充分互补，以减少其表达。因为实验是对小鼠进行的，所有的命名都使用的小写字母，然而，本文中使用的“Foxo”是指来自任何物种的任意Foxo蛋白、基因或mRNA。为了本发明的方法和组合物的目的，“Foxo蛋白”包括同源序列（不同物种的类似物），如Foxo1和其生物活性片段。在某些实施方式中，目的消化道Ins+表型源于降低的一种或多种Foxo蛋白的表达或活性。因此，也希望减少包括FOXO2、FOXO4和FOXO3的其他叉头蛋白而将不产生胰岛素的细胞变成产生胰岛素的细胞，或单独或伴随FOXO1减少。
由于序列同源性，不利于小鼠Foxo1的反义或siRNA可以在其他动物包括人中使用，反之亦然。因此，所有的基因IDs和序列号以及编码Foxo蛋白的相应核酸、基因、mRNA和cDNA都以引用的方式将其全部明确地纳 入本文。
表1用于FOXO基因和mRNA的基因ID号
人叉头框O1(FOXO1),mRNA
NCBI参考序列:NM_002015.3
小鼠叉头框O1(Foxo1)，mRNA
NCBI参考序列：NM_019739.3
大鼠叉头框O1(Foxo1),mRNA
NCBI参考序列:NM_001191846.1
人叉头框O3(FOXO3)，转录变体1，mRNA
NCBI参考序列：NM_001455.3
人叉头框O3(FOXO3),转录变体2,mRNA
NCBI参考序列:NM_201559.2
小鼠叉头框O3(Foxo3)，mRNA
NCBI参考序列：NM_019740.2
大鼠叉头框O3(Foxo3),mRNA
NCBI参考序列:NM_001106395.1
人叉头框O4(FOXO4),转录变体2,mRNA
NCBI参考序列：NM_001170931.1
人叉头框O4(FOXO4),转录变体1,mRNA
NCBI参考序列:NM_005938.3
大鼠叉头框O4(Foxo4)，mRNA
NCBI参考序列：NM_001106943
小鼠叉头框O4(Foxo4)，mRNA
NCBI参考序列：NM_018789.2
基因组RefSeqGene，FOXO1人，NG_023244.1
Foxo1小鼠菌株C57BL/6J染色体3，MGSCv37C57BL/6J，NC000069.5。
Foxo1大鼠，NC_005101.2，NW_047625.2。
FOXO3人，NC_000006.11。
Foxo3小鼠，NC_000076.5。
Foxo3大鼠，NC_005119.2。
FOXO4人，NC_000023.10。
Foxo4小鼠，NC_000086.6。
Foxo4大鼠，NC_005120.2。
叉头框O1[小鼠]
基因库：EDL35224.1
叉头蛋白FKHR1[小鼠]
Swiss-Prot：Q9WVH5
叉头框蛋白O1[人]
NCBI参考序列:NP_002006.2
叉头框蛋白O1[大鼠]
NCBI参考序列：NP_001178775.1
叉头框蛋白O3[人]
NCBI参考序列:NP_963853.1
叉头框蛋白O3[人]
NCBI参考序列：NP_001446.1
叉头框蛋白O3[大鼠]
NCBI参考序列:NP_001099865.1
叉头框蛋白O3[小鼠]
NCBI参考序列：NP_062714.1
叉头框蛋白O4[大鼠]
NCBI参考序列:NP_001100413.1
叉头框蛋白O4同种型2[人]
NCBI参考序列：NP_001164402.1
叉头框蛋白O4同种型1[人]
NCBI参考序列:NP_005929.2
叉头框蛋白O4[小鼠]
NCBI参考序列：NP_061259.1
用于减少Foxo蛋白表达的反义和小干扰RNA可以分别与编码Foxo蛋白的基因和/或mRNA特异性杂交和与其充分互补，以通过阻止转录或翻译来阻止蛋白的表达。降低Foxo1表达将会使消化道Ins-细胞分化为消化道Ins+细胞，而且与处理前胰岛素水平相比，将会使胰岛素水平提高。
虽然如此，但在消化道和胰腺的内分泌细胞中Foxo基因关闭的NKO小鼠表现健康且没有明显的疾病，所述疾病包括癌症。同样，肝脏中缺少所有Foxo基因（1、3和4）的小鼠是健康的且对胰岛素极其敏感，并且没有出现肝功能试验或肝病理学上的任何异常，这表明Foxo抑制是安全的且不具有不想要的副作用。因此，为了产生分泌肠内分泌细胞的胰腺激素来治疗或预防糖尿病和与胰腺障碍有关的其它病症，减少特别是以瞬间的方式降低人受试者中FOXO1、3和/或4的表达或生物活性将可能几乎不产生副作用。即使所有FOXO蛋白的表达或生物活性显著降低，这也是合理的。
在我们以前的工作中，Matsumoto et al The Journal of Clinical Investigation,Volume116Number9September2006，shRNA通过靶向于Foxo1的序列GCACCGACTTTATGAGCAACC SEQ ID NO:1被用来降低Foxo1的表达，使用短发夹RNA（来自BD Biosciences）作为对照siRNA靶标序列。由于序列的同源性，人FOXO1中的这个序列或基本上同源的序列可以为很好的靶标。Liu et al.,Cancer Gene Therapy14,945-952December2007中也记载了在小鼠中使用RNA抑制剂以降低骨骼肌中Foxo1的表达。实施例10中鉴别了本文所述实验中使用的siRNA。Labied,S,et al.Molecular Endocrinology20(1):35–44中记载了使各种人FOXO蛋白失去活性的反义分子，包括：FOXO1反义(TTG GGT CAG GCG GTT CA SEQ ID NO:2)； FOXO3a-正义(CCC AGC CTA ACC AGG GAA GT SEQ ID NO:3)和FOXO3a-反义(AGC GCC CTG GGT TTG G SEQ ID NO:4)；FOXO4-正义(CCT GCA CAG CAA GTT CAT CAA SEQ ID NO:5)和FOXO4-反义(TTC AGC ATC CAC CAA GAG CTT SEQ ID NO:6)。S.Stephen,et al.,Cancer Research70,367,January1,2010中记载了使用microRNA（miR）靶标预测算法，以鉴别多个结合在人子宫内膜癌细胞系中FOXO1转录的3’-未翻译区（UTR）的miR，从而抑制FOXO1表达。
反义核酸和siRNA
本发明的其他实施方式涉及反义核酸或小干扰RNA(siRNA)或shRNA的用途，以降低或抑制靶标Foxo蛋白的表达，从而降低或抑制靶标Foxo蛋白的生物活性。根据这些编码它们的靶标Foxo蛋白和基因的已知序列，使用本领域已知的方法可以很容易设计和指导与各自的基因或mRNA充分互补以终止或减少表达的反义DNA或RNA。在本发明的具体实施方式中，本发明中使用的反义或siRNA分子是在严格条件下与编码一种或多种通过基因库编号鉴别的Foxo蛋白的靶标mRNA或靶标基因结合的分子，或与编码一种或多种Foxo蛋白的mRNA或基因基本同源的变体或片段结合。本发明的反义化合物在体外合成，而且不包括生物来源的反义组合物。
制备反义核酸的方法是本领域中熟知的方法。还提供了降低不产生胰岛素的消化道祖细胞中一种或多种Foxo基因和mRNA表达的方法，所述方法通过在原位上使细胞接触或接触分离的浓缩细胞群或培养物中的组织外植体，所述培养物中的组织外植体包括具有一个或多个本发明的反义化合物或组合物的细胞。本文中使用的术语“靶标核酸”包括编码一种或多种Foxo蛋白的DNA和从该DNA中转录的RNA（包括前mRNA和mRNA）。核酸寡聚化合物与其靶标核酸的特异性杂交干扰了靶标核酸的正常功能。通过与靶 标核酸特异性杂交的化合物调节靶标化合物的功能通常称作“反义”。被干扰的DNA的功能包括复制和转录。被干扰的RNA的功能包括所有的生命机能，如RNA到蛋白翻译位点的易位、RNA中蛋白的翻译和可由RNA参与或促进的催化活性。靶标核酸功能的这种干扰的整体效果是调节或降低由DNA或RNA编码的蛋白的表达。在本发明的内容中，“调节”是指降低或抑制一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA的表达。
靶标过程包括测定编码反义交互发生的Foxo蛋白的靶标DNA或RNA内的一种或多种位点，以便达到预期的抑制效果。在本发明的内容中，优选的基因位点是包括靶标蛋白的mRNA的开放读码框架(ORF)的翻译起始或终止密码子的区域。正如本领域公知的，由于翻译起始密码子通常为5'-AUG(在转录mRNA分子中；相应的DNA分子中的5'-ATG)，翻译起始密码子也称作"AUG密码子"、"起始密码子"或"AUG起始密码子"。少数基因存在具有RNA序列5'-GUG，5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子，而且已经证明5'-AUA,5'-ACG和5'-CUG在体内发挥作用。因此，虽然真核生物中每种情况的起始氨基酸通常为蛋氨酸，但是术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包括许多密码子序列。本领域中还公知真核生物基因可以具有两个或多个可互换的起始密码子，其中任何一个都可以优先用于特定的细胞类型或组织中的翻译起始，或者优先用于特定的病症。在本发明的内容中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内使用以开始翻译从基因中转录的mRNA分子的密码子。常规实验将能够确定反义或siRNA的最优序列。
本领域中还公知基因的翻译终止密码子（“终止密码子”）可以具有三个序列中的一个序列，即5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA(相应的DNA序列分别为5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)。术语“起始密码子区域”和“翻译起始密码子区域”是指包括在翻译起始密码子的任一方向(即5'或3')上含有约25至约50个连续核苷酸的mRNA或基因的部分。类似地，术语“终止密码子区域”和“翻 译终止密码子区域”是指包括在翻译终止密码子的任一方向(即5'或3')上含有约25至约50个连续核苷酸的mRNA或基因的部分。
本领域中已知所述开放读码框架（ORF）或“编码区域”是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可被有效靶标的区域。其他靶标区域包括5'非翻译区（5'UTR）和3'非翻译区（3'UTR），本领域中已知5'非翻译区（5'UTR）是指翻译起始密码子5'方向上的部分mRNA，且包括mRNA的5'帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸，本领域中已知3'非翻译区（3'UTR）是指翻译终止密码子3'方向上的部分mRNA，并包括mRNA的翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸。
本领域还公知通过使用起始或终止转录的交替信号可以产生变体，而且还公知前体mRNA和mRNA可以拥有一个以上的起始密码子或终止密码子。将源于使用交替起始密码子的前体mRNA或mRNA的变体称为所述前体mRNA或mRNA的“交替起始变体”。将使用交替终止密码子的这些转录称作所述前体mRNA或mRNA的“交替终止变体”。一种特定交替终止变体是“多聚A变体”，其中产生的多个转录都是通过转录机制交替选择其中的一个“多聚A终止信号”造成的，从而产生终止于唯一的多聚A位点的转录。
鉴别了一种或多种靶标位点，就可以选择出与靶标充分互补的核酸；这是指核酸能够很好的杂交或具有良好的特异性，以产生抑制基因表达和转录或mRNA翻译的预期效果。
在本发明的内容中，“杂交”是指互补核苷或核酸碱基之间Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形式配对的互补碱基。本文中使用的“互补”是指两个核酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸某位置处的核苷酸可以与DNA或RNA分子相同位置的核苷酸氢键结合时，那么就认为所述核酸和所述DNA或RNA在那个位置 彼此互补。当彼此可以氢键结合的核酸占有每个分子中足够数量的相应位置时，所述核酸和所述DNA或RNA彼此互补。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用来表示互补或精确配对的充分程度，以便稳定的且在所述核酸和所述DNA或RNA靶标之间发生特异性结合。本领域中应该理解的是，反义化合物序列不需要与其可特异性杂交的靶标核酸序列100%互补。当反义化合物与靶标DNA或RNA分子的结合能够干扰靶标DNA或RNA的正常功能使其丧失功能时，所述化合物可特异性杂交，而且其可在特异性结合所需的条件下充分互补以防止反义化合物与非靶标序列的非特异性结合，所述条件即在体内试验或治疗处理的生理条件下和体外试验条件下，所述试验在这些条件下进行。
虽然反义核酸是优选形式的反义化合物，但本发明包括其他寡聚反义化合物，包括但不局限于寡核苷酸类似物（oligonucleotide mimetics）。根据本发明所述的反义化合物优选含有约8至约50个碱基（即约8至约50个连接的核苷）。特别优选的反义化合物为包括约12至约30个碱基的反义核酸。反义化合物包括核酶、外部指导序列（EGS）核酸（寡聚酶）和其他与靶标核酸杂交并调节其表达的起催化作用的短RNA或核酸。本发明内容中的核酸包括“寡核苷酸”，所述核酸是指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）的寡聚体或多聚体或其类似物。这个术语包括由天然形成的碱基、糖和共价核苷内（主干）连接物组成的寡核苷酸和具有功能相似的非天然形成部分的寡核苷酸。这种被修饰或取代的寡核苷酸通常优选为原生形式，因为其具有所需的特性如细胞吸收增强、对核酸靶标的吸附力增强和在核酸酶存在下的稳定性增强。
反义核酸已经被当作治疗病态的动物和人的有疗效部分。已经将反义核酸药物（包括核酶）安全且有效的对人进行给药，并且目前还在进行许多临床试验。因此，可以确定的是核酸可以为有效的治疗形式，可以被配制为可 用在治疗细胞、组织和动物尤其是人的治疗方案中，如下调一种或多种Foxo蛋白的表达。
本发明的反义和siRNA化合物可用于诊断、治疗和预防，且可作为研究试剂和试剂盒。对于治疗，通过用根据本发明的反义化合物进行给药治疗疑似患有疾病或病症的动物，优选人，所述疾病或病症例如包括糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良和/或胰岛素水平较高的肥胖症，这些都可以通过降低一种或多种Foxo蛋白的表达来进行治疗。本发明的化合物可以通过将有效量的反义化合物加到合适的药学上可接受的稀释剂或载体中而在药物组合物中使用。本发明的反义化合物和方法对如预防或延迟糖尿病、葡萄糖耐受不良、代谢综合征或肥胖症的出现具有有效的预防作用。本发明的反义化合物和方法也可用来延缓代谢综合征、葡萄糖耐受不良、糖尿病、动脉硬化或肥胖症的进程。
本发明还包括包括本文所述的反义化合物的药物组合物和制剂。
siRNA
美国专利申请2004/0023390（其全部内容都以引用的方式纳入本文，就像本文已完整阐明）教导双链RNA（dsRNA）可以通过被称为RNA干扰（RNAi）的过程在许多组织中诱导序列特异性转录后基因沉默。然而，在哺乳动物细胞中，有30个或更长碱基对的dsRNA可以诱导序列非特异性应答，所述序列非特异性应答会引起蛋白合成终止甚至通过细胞凋亡引起细胞死亡。目前的研究表明RNA片段是RNAi序列(Elbashir et al.,2001)的特异性介导者。目前，认为通过这些小干扰RNA(siRNA)干扰基因表达是使秀丽隐杆线虫（C.elegans）、果蝇、植物和小鼠胚胎干细胞和卵母细胞和早期胚胎的基因沉默的一种天然形成方案(Cogoni et al.,1994;Baulcombe,1996;Kennerdell,1998;Timmons,1998;Waterhouse et al.,1998;Wianny and Zernicka-Goetz,2000;Yang et al.,2001;Svoboda et al.,2000)。
在哺乳动物细胞培养技术中，通过合成RNA核酸转染细胞已经完成了siRNA介导的基因表达的减少(Caplan et al.,2001;Elbashir et al.,2001)。2004/0023390申请的全部内容已经通过引用的方式纳入本文，就像本文已经完整阐明，该申请提供了示例性的方法，所述方法使用了含有表达框的病毒载体，所述表达框含有pol II启动子，所述启动子可操作地连接在编码靶标于目的基因的小干扰RNA分子的核酸序列上。
本文中使用的RNAi为RNA干扰过程。典型的mRNA产生的约5000个蛋白拷贝数。RNAi是干扰或显著减少由mRNA产生的蛋白拷贝数的过程。例如，将双链短干扰RNA（siRNA）分子设计为与被干扰的靶标mRNA的蛋白编码核酸序列互补和匹配。细胞内转运后，所述siRNA分子与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合。所述siRNA联合RISC通过碱基配对作用结合所述靶标并将其降解。所述RISC仍然能够降解靶标RNA的其他拷贝。也可以使用RNA的其他形式，如短发夹RNA和较长的RNA分子。较长的分子可通过如促进凋亡和诱导干扰素应答而使细胞死亡。细胞死亡是哺乳动物中完成RNAi的主要障碍，因为多于30个核苷酸的dsRNA激活了防御机制，所述防御机制能够导致RNA转录物非特异性降解和宿主细胞的整体关闭（general shutdown）。使用约20至约29个核苷酸的siRNA介导哺乳动物细胞的基因-特异性抑制已经明显克服了这个障碍。这些siRNA的长度足以引发基因抑制。
本发明的某些实施方式涉及shRNA、反义或siRNA在阻碍动物中FOXO1、3和/或4或同源序列、类似物和其变体的表达中的用途。可以使用本领域常规技术设计反义核酸，以靶标编码下文详细描述的FOXO蛋白的人DNA或mRNA。本发明的反义化合物在体外合成，且不包括生物性反义组合物，或在体内引导反义分子合成的遗传载体构建体。
许多实施方式都可将siRNA转运到消化道细胞中，所述消化道细胞与一种或多种Foxo蛋白充分互补以降低表达。有可实现体内转染的测试转运方法，如用脂质体或纳米粒子包覆siRNA。也有特异性靶标siRNA转运到消化道上皮细胞的新技术，称作“Transkingdom RNA interference”。该项技术的发明人已经从基因学上改造了非病原性大肠杆菌，所述大肠杆菌可以产生靶标哺乳动物基因的短发夹RNA（shRNA）(Xiang,S.,et al.,2009.In vitro and in vivo gene silencing by TransKingdom RNAi(tkRNAi).Methods Mol Biol487:147-160.)。两种因子可用于促进shRNA迁移：侵袭素（inv）和李斯特菌溶血素（listeriolysin O，HlyA）基因。他们已经证明可以口服重组大肠杆菌以递送抗连环蛋白b1(Ctnnb1)的shRNA，所述连环蛋白b1能够抑制该基因在肠上皮细胞中的表达，而不会因细菌渗漏到血液中而引发明显的全身性并发症。本发明的某些实施方式涉及使用适合于siRNA的转界（Transkingdom）RNA干扰方法，所述siRNA能够使一种或多种Foxo蛋白沉默。
已经有人使用这个技术来敲除Abcb1(Kruhn,A.,et al.,2009.Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.Cell Cycle8)。
编码Foxo1shRNA的细菌可以从Cequent Technologies购买，并且可以按推荐的浓度通过口服以外的方法进行给药。采用活检或如在试验动物肠细胞中Foxo1敲除的分析方法确定剂量。
在本发明的内容中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸（DNA）的寡聚物或聚合物或其类似物。这个术语包括由天然形成的碱基、糖和共价核苷内（骨架）连接物组成的寡核苷酸和具有功能相似的非天然形成部分的寡核苷酸。这种被修饰或取代的寡核苷酸通常优选为原生形式，因为其具有所需的特性如细胞吸收增强、对核酸靶标的吸附力增强和在核酸酶 存在下的稳定性增强。
本发明的嵌合反义化合物可以形成两个或多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或上述寡核苷酸类似物的复合结构。本领域中所述化合物是指杂交体或融合体（gapmers）。教导制备所述杂交结构的具有代表性的美国专利包括但不限于美国专利No.5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922。
本发明的反义核酸分子主要局部给药于受试者或在原位产生，以便充分与细胞mRNA和/或编码目的蛋白的基因组DNA杂交或结合，从而降低蛋白的表达，例如通过降低转录和/或翻译。通过传统的核苷酸互补杂交能够形成稳定的双螺旋，或例如在反义核酸分子和DNA双螺旋连接的情况下，通过在双螺旋大沟中特定的交互作用。本发明的反义核酸分子的给药途径的实例包括在组织部位直接注射。另外，可以修饰反义核酸分子来靶向筛选的细胞，然后系统地给药。例如，对于系统的给药，可以修饰反义分子以便它们与在筛选的细胞表面表达的受体或抗原发生特异性地连接，例如，通过将反义核酸分子和多肽或与细胞表面受体或抗原结合的抗体连接。反义核酸分子也能够被输送到使用上述载体的细胞中。为了获得足够的反义分子的细胞内浓度，反义核酸分子置于载体构建体中，优选受控于强固的pol II或pol III启动子。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。Α-异头核酸分子和互补的RNA形成了特殊的双链杂交体，与通常的β-单元相反，双链互相平行(Gaultier et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15:6625-6641)。反义核酸分子也可以含有2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215:327-330)。通过引用将上述所有文章中描述的关于反义技术的方法纳入 本文。
本发明还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切断具有互补区的单链核酸，例如mRNA。因此，核酶（例如锤头状核酶（参见Haselhoff and Gerlach(1988)Nature334:585-591））被用来催化切断靶向于mRNA转录，从而抑制翻译。具有特异性靶标编码核酸的核酶基于它的cDNA核苷酸序列而设计。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列和靶标mRNA中的被切断的核苷酸序列互补。例如参见Cech et al.U.S.Pat.No.4,987,071;和Cech et al.U.S.Pat.No.5,116,742。另外，靶标FOXO mRNA可以被用来筛选具有来自RNA分子混合物的特异性核酶活性的催化性RNA。例如参见Bartel and Szostak(1993)Science261:1411-1418,通过引用纳入本文。
本文中使用的术语“核酸”指的是RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成（例如化学合成）的DNA。核酸可以是双链或单链（也就是正义或反义单链）的。本文中使用的“分离的核酸”指的是从其它存在于哺乳动物基因组中的核酸分子中分离的核酸，包括在哺乳动物基因组中通常位于核酸一侧或两侧的核酸（例如位于ARPKD基因侧翼的核酸）。本文中使用的术语“分离的”指的是关于核酸也包括任意非天然发生的核酸序列，因为这种非天然发生的序列不能在自然界中找到，且在天然发生的基因组中没有直接连续的序列。
分离的核酸可以是例如DNA分子，只要移除或缺失在天然发生的基因组中发现的通常直接位于DNA分子侧翼的其中一个核酸序列即可。因此，分离的核酸包括但不限于不依赖于其它序列的作为独立分子存在的DNA分子（例如化学合成的核酸，或cDNA或由PCR或限制性核酸内切酶处理产生的基因组DNA片段）以及引入到载体中的DNA、自主复制的质粒、病毒（例如逆转录酶病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒）或引入到原核细胞或真 核细胞的基因组DNA中的DNA。另外，分离的核酸包括经设计的核酸例如作为杂交或融合核酸一部分的DNA分子。存在于成百至上百万种其它核酸（例如cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制酶切消化的凝胶切片）中的核酸不被认为是分离的核酸。
小干扰RNA
RNA干扰（以下称为“RNAi”）是后转录基因调控的方法，它在许多真核生物中是保守的。RNAi由在细胞中存在的短的（也就是<30个核苷酸）双链RNA（dsRNA）分子诱导(Fire A et al.(1998),Nature391:806-811)。这些短的被称为“短干扰RNA”或“siRNA”的dsRNA分子破坏了信使RNA（“mRNA”），所述信使RNA在一个核苷酸分辨率（nucleotide resolution）内和siRNA具有序列同源性(Elbashir S M et al.(2001),Genes Dev,15:188-200)。认为siRNA和靶标mRNA与切断靶标mRNA的“RNA诱导的沉默复合物”或“RISC”连接。siRNA的循环似乎很像多重周转酶，1个siRNA分子能够诱导大约1000个mRNA分子的切割。因此，siRNA介导的RNAi的mRNA的降解比现有可用的抑制靶标基因表达的技术更有效。
本领域技术人员能够根据靶标蛋白的cDNA基因序列制备任意不同数量的siRNAs。专利申请20040023390（将其全部内容通过引用纳入本文，就像本文已完整阐明）教导了通过称为RNA干扰（RNAi）过程在许多生物体中双链RNA（dsRNA）能够诱导序列-特异性后转录基因的沉默。然而，在哺乳动物细胞中，具有30个或更长的碱基对的dsRNA能够诱导序列-非特异性响应，引发蛋白质合成的终止和甚至通过细胞凋亡引起细胞死亡。目前的研究表明RNA片段是RNAi的序列-特异性介导者（Elbashir et al.,2001）。在秀丽隐杆线虫、果蝇、植物、小鼠胚胎干细胞、卵母细胞和早期胚胎中，利用这些小干扰RNA（siRNA）干扰基因表达被认为是沉默基因的天然形成 策略(Cogoni et al.,1994;Baulcombe,1996;Kennerdell,1998;Timmons,1998;Waterhouse et al.,1998;Wianny and Zernicka-Goetz,2000;Yang et al.,2001;Svoboda et al.,2000)。
在哺乳动物细胞培养中，通过用合成的RNA核酸转染细胞，实现了siRNA-介导的基因表达的降低(Caplan et al.,2001;Elbashir et al.,2001)。20040023390申请（其全部内容以引用的方式纳入本文，就像本文已完整阐明）提供了使用含有表达盒的病毒载体的方法，所述表达盒具有与编码靶标目的基因的小干扰RNA分子（siRNA）的核酸序列可操作地连接的pol II启动子。
本文中RNAi指的是RNA干扰过程。典型的mRNA产生大约5000个蛋白拷贝数。RNAi是干扰或显著降低由mRNA产生的蛋白质拷贝数的过程。例如，双链短干扰RNA（siRNA）分子被设计成能够与被干扰的靶标mRNA的编码蛋白的核苷酸序列互补和匹配。随着细胞内传递，siRNA分子和RNA诱导的沉默复合物（RISC）连接。siRNA连接的RISC通过碱基配对与靶标mRNA（例如编码靶标FOXO蛋白的mRNA）结合并使其降解。RISC仍然能够降解另外的靶标mRNA的拷贝。也可以使用其它形式的RNA例如短发夹RNA和较长的RNA分子。较长的分子例如通过促进细胞凋亡和诱导干扰素应答来引起细胞死亡。细胞死亡是哺乳动物中完成RNAi的主要障碍，因为多于30个核苷酸的dsRNA活化了防御机制，所述防御机制能够导致RNA转录物的非特异性降解和宿主细胞的整体关闭。在哺乳动物细胞中使用约20至约29个核苷酸的siRNA介导基因-特异性抑制已经明显克服了这个障碍。这些siRNAs的长度足以引起基因抑制，但不足以诱导干扰素响应。
本文使用的siRNA的“治疗有效量”是足以引起RNAi介导的降低靶标mRNA的量，或足以抑制列举的疾病的发展的量或足以将胰岛素-N3Prog或Ins-肠内分泌细胞表型转化为Ins+细胞的量。
本文使用的“分离的”指的是通过人为干涉改变或解除天然状态。例如，天然存在于活动物中的siRNA不是“分离的”，但是合成的siRNA，或部分或完全与和它的天然状态共存的材料分开的siRNA是“分离的”。分离的siRNA基本上能够以纯化的形式存在，或能够存在于非天然环境中，例如被递送siRNA的细胞中。除非另有说明，本文中所有核酸序列都是按5’-3’方向给出的。核酸序列中的所有脱氧核苷酸用大写字母表示（例如脱氧胸腺嘧啶核苷用“T”表示），核酸序列中的核糖核苷酸用小写字母表示（例如尿嘧啶用“u表示”）。
抗体
降低Foxo蛋白生物活性的药剂包括对目的Foxo蛋白而言具有特异性结合亲和力的抗体（包括部分或片段或抗体片段的变体或抗体的变体），从而干扰它的生物活性。这些抗体能够鉴别在靶标蛋白或生物活性片段也就是Foxo1、2、3或4上的表位。在某些实施方式中，抗体降低Foxo的能力来增加N3的合成。
“抗体”指的是完整的免疫球蛋白或其能够与完整的特异性结合抗体相竞争的抗原结合部分（片段），包括生物活性抗体片段。在治疗上，如上所述的在治疗或预防列举的疾病或改变表型中有用的抗体包括任意FOXO蛋白或类似物、它的直接同源物或变体的任意抗体，优选能够降低消化道Ins-Prog细胞例如消化道N3Prog细胞中各自的Foxo蛋白的生物活性的FOXO1、2、3或4。
产生后，通过标准免疫分析法包括例如酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫分析法（RIA）来测试抗体或它的片段，以鉴别靶标多肽。参见Short Protocols in Molecular Biology eds.Ausubel et al.，Green Publishing Associates and John Wiley & Sons(1992)。
术语“表位”指的是与抗体相结合的抗原上的抗原决定簇。表位通常由化学活性表面分子组所组成，例如氨基酸或糖侧链构成，主要具有特定的三维结构特点，以及特定的电荷特性。表位通常具有至少5个连续的氨基酸。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab’).sub.2片段。多克隆抗体是对特定抗原具有特异性的异质群抗体分子，而单克隆抗体是含有抗原内的特定表位同质群抗体。单克隆抗体在本发明中尤为有用。
对目的多肽而言，具有特异性结合亲和力的抗体片段能够通过已知技术制备。这种抗体片段包括但不限于由抗体分子经胃蛋白酶降解产生的F(ab’).sub.2片段，和通过还原F(ab’).sub.2片段的二硫键产生的Fab片段。而且，可以构建Fab表达库。参见，例如Huse et al.(1989)Science246:1275-1281。单链Fv抗体片段通过连接经由氨基酸桥（例如15-18个氨基酸）的Fv区域的重链和轻链片段形成，产生了单链多肽。通过标准技术能够产生单链Fv抗体片段，例如美国专利No.4,946,778公开的那些技术。
“分离的抗体”是抗体（1）与天然相关的组分没有关系，包括其它天然相关的抗体，伴随着它的天然状态，（2）不含其它相同物种的蛋白质，（21）由不同物种的细胞表达，或（4）天然不存在。
术语“人抗体”包括所有具有来自人免疫球蛋白序列的一种或多种可变或恒定区域的抗体。在优选的实施方式中，所有可变和恒定的结构域来自人免疫球蛋白序列（人抗体的全长）。这些抗体可以通过如下所述的各种方法制备得到。
人源化抗体是来自非人物种的抗体，其中，骨架中的某些氨基酸和恒定的重链和轻链结构域发生了突变以避免或防止人的免疫反应。另外，可以通过将来自人抗体的恒定结构域和非人物种的可变结构域相融合来产生人源化抗体。如何制备人源化抗体的实例参见美国专利Nos.6,054,297、5,886,152 和5,877,293，通过引用纳入本文。
术语“嵌合抗体”指的是含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区域的抗体。
通过下面说明书中的教导，本领域普通技术人员能够很容易地制备抗体的片段、部分或类似物。优选氨基-和羧基-终点片段或在功能性结构域边缘附近出现的类似物。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据和公共或专有序列数据库进行比对，能够鉴别出结构性和功能性的结构域。优选使用电脑比对法鉴别序列基序或预测在其它已知结构和/或功能的蛋白质中出现的蛋白构型结构域。将蛋白序列折叠成已知的三维结构来鉴别蛋白序列的方法是公知的。Bowie et al.Science253:164(1991)。
不同的反-Foxo蛋白抗体已经被确认。这是鉴别那些阻遏Foxo蛋白的常规试验，使用如上所述的体外筛选试验。
筛选方法
某些实施方式包括肠上皮细胞体外培养物在用于高通量筛选分析以鉴定Foxo1消融的化学拟态（chemical mimetics）中的用途。提供了用于高通量筛选分析的方法，其中，测试了表达胰岛素的诱导哺乳动物消化道肠内分泌细胞(消化道Ins-Prog)的药剂的有效性，包括如上所述地分离消化道Ins-细胞，在适于产生和分泌胰岛素的条件下培养它们，提供分离的消化道Ins-细胞的对照和测试细胞群，将消化道Ins-细胞的测试细胞群和测试药剂接触；直接地或通过报告因子标记确定对照和测试细胞群（或可选的在培养基中存在的分泌胰岛素）中胰岛素表达的水平；如果测试细胞群的胰岛素的水平比对照群的水平高，筛选出该测试药剂。经鉴定的活性剂能够在如上所述的本发明的实施方式中使用。该分析能够通过其它方法例如通过单独研究消化道Ins-细胞来测定药剂对胰岛素表达水平的影响。因此，提供了用于筛选或分 析活性剂的基于细胞的方法，所述活性剂增加了胰岛素表达的水平。在本发明的具体实施方式中，在细胞群（例如消化道Ins-细胞）中测量胰岛素的表达水平包括：（a）去除不产生胰岛素的消化道Ins-Prog细胞群，包括哺乳动物胃肠道的神经元素3-阳性祖细胞和/或干细胞，（b）将细胞群和药剂接触以降低FOXO蛋白(FOXO1,FOXO4和/或FOXO3)的表达或生物活性，或细胞中它们的生物活性片段、直接同源物或变体的表达或生物活性，（c）测定胰岛素表达水平和（d）如果测试细胞群的胰岛素的表达水平比对照细胞群的水平高，鉴定出药剂。本领域的技术人员知道如何改变这些方法。在本发明各种实施方式范围内的活性剂包括那些增加细胞核外FOXO蛋白的磷酸化作用、降解或易位的活性剂。
在实施方式中，测试细胞群包括富含消化道Ins-N3Prog的肠隐窝、瞬时增殖的Prog和消化道干细胞，但也包括其它含有其它分泌腺的细胞类型（例如Paneth细胞）、肠内分泌细胞、干细胞和瞬时增殖祖细胞。
筛选能够将消化道上皮细胞转化为产生胰岛素的功能性细胞的小分子。Foxo1的敲除能够在消化道中生成产生胰岛素的功能性细胞，并在Pdx1-Foxo1lox/lox小鼠的十二指肠中生成消化道产生胰岛素的细胞，其中，Foxo1在所有类型的肠细胞中被消融，包括干细胞和瞬时增殖细胞。这些结果显示了许多类型的肠上皮细胞能够被诱导为具有胰腺表达特性的产生胰岛素的细胞，在消化道中生成产生胰岛素的细胞不限于有限的消化道Neurog3+Prog细胞的数量。而且，从快速发展的筛选试验的角度看，能够使用从隐窝分离的消化道上皮细胞是因为它们相对充足并容易获得。
胰岛素-GFP敲入等位基因对阳性胰岛素细胞的生成是敏感的和特异性读出的（specific readout）。各种筛选试验的实施方式涉及从产生胰岛素-GFP敲入等位基因的小鼠中分离消化道上皮细胞，使用例如小分子库建立经高通量筛选的原始培养物。
由绿色细胞的出现表示读出（readout），相应选择检测系统。实施方式使用了两个阳性读出。第一个读出将使用从Foxo1敲除NKO小鼠培养的自发荧光的细胞。这将能够提供阳性对照和校正试验的敏感性的双重目标，因为在阴性细胞背景中能够检测到荧光细胞。作为第二个阳性对照，将使用已经用Foxo1siRNA转换的细胞，以优化概括了在体外生成消化道产生胰岛素细胞的条件。当Foxo1被抑制时，细胞将会变成绿色。其它的实施方式使用了从晚期胚胎消化道分离的细胞，或将siRNA的混合物转换为3个Foxo亚型（1、3和4）的细胞。
起初筛选的一些变化方式是可能的。建立有利于为样细胞的Ins+细胞外观的条件，用Foxo1siRNA处理来自产生Ins2-Gfp敲入等位基因的小鼠的初级消化道上皮细胞，在胰腺分化介质中培养达到最佳数量的Ins-Gfp+细胞。然后，使用这些经证实的条件来筛选产生Ins-Gfp+细胞的小分子。其它实施方式还包括测试小分子引起的细胞转为不成熟（green），增强胰岛素分泌能力的试验。这可以通过在升高的葡萄糖、或在葡萄糖和磺酰脲中建立初级消化道细胞培养物来实现。在试验的第三个方面，对在小鼠中它们逆转STZ-诱导的糖尿病的能力进行阳性命中测试。
在另一个实施方式中，使用Neurog3-Gfp敲入小鼠针对其增加肠内分泌祖细胞数量的能力来筛选化学库。这个试验将根据如上所述的方法进行。
其它实施方式涉及测定候选药剂治疗或预防动物中任何列举的疾病或与胰腺功能损坏相关的病症的能力的方法，该方法包括：（a）准备由于胰腺功能障碍引发了糖尿病的测试小鼠，例如KO小鼠或经链脲霉素-处理的小鼠或db/db或ob/ob小鼠（两个2型糖尿病和肥胖症的动物模型）或ZDF大鼠（和db/db小鼠具有相似突变的大鼠）或NZO小鼠（瘦的2型糖尿病模型）或fa/fa大鼠（肥胖症和糖尿病模型）或GK大鼠（大鼠糖尿病模型）和对照动物，（b）用候选药剂对测试动物进行给药，（c）将测试动物的胰岛素 表达水平和对照动物的胰岛素表达水平进行比较，和（d）如果测试动物的胰岛素表达水平比对照动物的水平高，筛选出该候选药剂。可通过不同的手段例如通过测量血清胰岛素水平、葡萄糖耐受性的增加、胰岛素敏感性、或消化道Ins+细胞的显谱或检测来测量胰岛素表达水平。
本文使用的术语“药剂”或“外源化合物”包括任何能够直接或间接诱导消化道Ins-Prog分化为消化道Ins+细胞的分子，例如蛋白质、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸和脂质等，或它们的混合物。通常，具有不同药剂浓度的一系列试验混合物进行平行比较来获得对各种浓度的区别反应。典型地，其中一个浓度为阴性对照，也就是零浓度或在检测水平以下。
筛选中使用的测试药剂包括许多化学类别，尽管它们主要是有机分子，优选分子量大于100约小于2500道尔顿，优选小于500道尔顿的小有机化合物。一些测试药剂具有促使它们和蛋白质在结构上相互作用的官能团，特别是氢键，典型地，至少具有氨基、羰基、羟基或羧基基团，优选至少两个化学官能团。这种药剂通常具有周期性碳或杂环结构和/或被上述一种或多种官能团取代的芳香或芳香烃结构。在包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、它的结构类似物或结合物的生物分子中也发现了测试药剂。具有明显的药理学活性的高纯度小的有机配体和肽库存在许多来源。一个实例是NCI多样性系列（NCI diversity set），其包括1866中药物-样化合物（小的，中间疏水性）。其它的是化学研究所和细胞生物学（ICCB，由哈佛医学院维护）已知生物活性（467个化合物），包括许多延伸的、灵活的化合物。一些ICCB库的其它实例是：Chem Bridge DiverSet E(16320个化合物);Bionet1(4800个化合物);CEREP(4800个化合物);Maybridge1(8800个化合物);Maybridge2(704个化合物);Maybridge HitFinder(14379个化合物);Peakdale1(2816个化合物);Peakdale2(352个化合物);ChemDiv Combilab and International(28864个化合物);Mixed Commercial Plate1(352个化合物); Mixed Commercial Plate2(320个化合物);Mixed Commercial Plate3(251个化合物);Mixed Commercial Plate4(331个化合物);ChemBridge Microformat(50000个化合物);Commercial Diversity Set1(5056个化合物)。其它的NCI集合是:Structural Diversity Set,version2(1900个化合物);Mechanistic Diversity Set(879个化合物);Open Collection1(90000个化合物);Open Collection2(10240个化合物);已知的生物活性集合:NINDS Custom Collection(1040个化合物);ICCB Bioactives1(489个化合物);SpecPlus Collection(960个化合物);ICCB Discretes Collections。以下ICCB化合物分别从ICCB、Harvard的化学家处收集，其它合作机构:ICCB1(190个化合物);ICCB2(352个化合物);ICCB3(352个化合物);ICCB4(352个化合物)。天然提取产品:NCI海洋提取物（Marine Extracts）(352孔(well));有机提取物—NCI植物和真菌提取物（Plant and Fungal Extracts）(1408孔(well));菲律宾植物提取物（Philippines Plant Extracts）1(200孔(well));ICCB-ICG多样性导向合成收集物（Diversity Oriented Synthesis(DOS)Collections）;DDS1(DOS Diversity Set)(9600孔(well))。化合物库也可以从商业供应商例如ActiMol、Albany Molecular、Bachem、Sigma-Aldrich、TimTec以及其它供应商处获得。
当筛选、设计或修饰化合物时，考虑的其它因素包括Lipinski rule-of-five（不超过5个氢键供体（OH和NH基团）；不超过10个氢键受体（尤其是N和O）；分子量在500g/mol以下；分配系数logP小于5），在制药领域被认可的和涉及性能和结构特点的Veber标准使得分子具有或多或少的药物-样。
库是完全随机的，在任何位置没有序列优选项（preferences）或常量。库可以是有倾向性的。序列内的一些位置是保持恒定的或从数量有限的可能性中筛选的。例如，核苷酸或氨基酸残基在确定的类别中是随机的，例如疏 水氨基酸、亲水残基、空间倾向（小的或大的）残基、半胱氨酸的形成、用于交联、用于SH-3结构域的脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或用于磷酸化位点的组氨酸等，或嘌呤等类别。
在一些优选的实施方式中，有活性的是分离的核酸，优选反义、siRNA或cDNA，分别与编码目的蛋白的基因，或与它的具有充分互补性（如本文所述）来阻止基因表达或mRNA翻译的mRNA结合。本文中“核酸”或“寡核苷酸”或语法同等成分（grammatical equivalents）指的是至少两个核苷酸共价连接。这种核酸通常包括磷酸二酯键，尽管一些情况如下所示，包括具有交替骨架的核酸类似物，例如包括磷酰胺(Beaucage et al.,Tetrahedron 49)10):1925(1993)，引至本文；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970);Sprinzl et al.,Eur.J.Biochem.81:579(1977);Letsinger et al.,Nucl.Acids Res.14:3487(1986);Sawai et al,Chem.Lett.805(1984),Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);and Pauwels et al.,Chemica Scripta26:14191986)),pohsphorothioate(Mag et al.,Nucleic Acids Res.19:1437(1991);and U.S.Pat.No.5,644,048),phosphorodithioate(Briu et al.,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989),O-methylphophoroamidite linkages(see Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press),and peptide nucleic acid backbones and linkages(see Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992);Meier et al.,Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992);Nielsen,Nature,365:566(1993);Carlsson et al.,Nature380:207(1996),上述所有内容通过引用纳入本文)。
其它核酸类似物包括那些具有阳性骨架(Denpcy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097(1995)；非-离子性骨架(U.S.Pat.Nos.5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141and4,469,863;Kiedrowshi et al.,Angew.Chem.Intl.Ed.English30:423(1991);Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);Letsinger et al.,Nucleoside & Nucleoside13:1597(1994);第2和3章,ASC Symposium Series580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research",Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook;Mesmaeker et al.，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395(1994);Jeffs et al.,J.Biomolecular NMR34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非-核糖骨架，包括下述的那些美国专利No.5,235,033和5,034,506,以及第6和7章,ASC Symposium Series580,"Carbohydrate Modifications in antisense Research",Ed.Y.S.Sanghui and P.Can Cook。含有一种或多种碳环糖的核酸包括在定义的核酸内（参见Jenkins et al.,Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176）。Rawls,C & E News Jun.2,1997page35中描述了一些核酸类似物。所有这些参考文献清楚地被引入本文。核糖-磷酸盐骨架的修饰促进了附加部分例如标记的添加，或增强了这种分子在生理学环境下的稳定性和半衰期。另外，可以制得天然发生的酸和类似物的混合物。此外，可以制得不同核酸类似物的混合物，和天然发生的核酸和类似物的混合物。核酸可以是特异性的单链或双链，或包括双链或单链序列的部分。核酸可以是DNA，染色体的和cDNA，RNA或杂交体，其中核酸包括任意脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，和任意碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶（isocytosine）和异鸟嘌呤等。
药剂可以从组合化学库（combinatorial chemical libraries）中获得，库中有大量文献报道可用的药剂。本文中的“组合化学库”指的是以指定或随机方式生成的一些不同的化合物，通常通过化学合成。通过组合混合能够合成数百万的化合物。
筛选中经鉴别的已知和新的药理学药剂可以进一步经历直接的或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化和酸化（amidification）来产生结构类似物。所述药剂可以是蛋白质。本文中的“蛋白质”指的是至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白、肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然发生的氨基酸和 肽键，或合成的拟肽物结构组成。因此本文使用的“氨基酸”或“肽残基”指的是天然发生的和合成的氨基酸。例如，人苯丙氨酸、瓜氨酸和诺尔亮氨酸（noreleucine）是本发明目的考虑的氨基酸。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基例如脯氨酸和羟基脯氨酸。侧链可以是（R）或（S）构型。在优选的实施方式中，氨基酸是（S）或L-构型。如果使用非天然发生的侧链，例如可以使用非氨基酸取代基预防或防止体内退化。
药剂可以是天然发生的蛋白质或天然发生的蛋白质的片段或变体。因此，可以使用例如含有蛋白质的细胞提取物，或随机或直接的消化蛋白质的细胞提取物。以这种方式，可以制备原核和真核蛋白库从而对诱导消化道Ins-Prog细胞分化为Ins+细胞的能力进行筛选。细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白库，优选后者和人蛋白库被优选使用。药剂可以是具有约5-30个氨基酸的肽，优选具有约5至约20个氨基酸的肽，特别优选具有约7至约15个氨基酸的肽。肽可以是如上所述的天然发生的蛋白质、随机多肽或“倾向”随机肽的消化物。本文“随机的”或语法同等成分指的是每个核酸和肽基本上分别由随机核苷酸和氨基酸组成。因为这些随机肽（或下面讨论的核酸）通常是化学合成的，它们可以在任意位置含有任意的核苷酸或氨基酸。可以设计合成过程来产生随机的蛋白质或核酸，以形成整个序列长度上的所有或大多数可能的组合，从而形成了生物活性蛋白药剂的随机药剂库。Karsenty美国申请20100190697中描述了进一步的变体和细节。
药剂的生物活性片段或变体
治疗药剂的生物活性片段或变体也属于本发明的保护范围。本文所述的“生物活性”指的是至少增加下述其中一方面的效果，将哺乳动物消化道肠内分泌细胞（消化道Ins-细胞）诱导能够表达胰岛素、增加胰岛素的敏感性、增加葡萄糖耐受性、减少体重增加、减少脂肪量、增加具有受损的胰腺功能 障碍的动物的体重降低，也就是不产生或分泌正常水平的胰岛素。片段和变体如下所述。片段可以是分离的（不用和其它氨基酸或肽融合）或在较大的多肽内。而且，一些片段可以包括在单个较大的多肽内。
肽的其它变体包括那些给药剂提供有用的和新的特性的变体。例如，肽药剂的变体可以降低免疫原性、增加血清的半衰期和增加生物利用率和/或增加效能。“肽药剂的变体”指的是它们的氨基酸序列经过修饰的肽，例如一个或多个氨基酸替换、添加、缺失和/或插入，但它们仍然具有生物活性。在某些实例中，相对于相应的变体的来源肽，变体的抗原和/或产生免疫性的特点实质上没有改变。使用标准突变技术例如由Adelman et al.(DNA,2:183,1983)或化学合成方法教导的寡核苷酸定向特异性位点突变可以很容易引入这种修饰。突变和片段不是互相排斥的术语。片段也包括具有一个或多个氨基酸替换、添加、缺失和/插入的肽，以使这些片段仍然具有生物活性。完全功能性变体主要仅包括保守性变体或非关键残基的变体或非关键区域的变体。功能性变体也可以包括类似氨基酸的替换，这导致在功能上没有改变或仅发生微不足道的改变。另外，在一定程度上这种替换可以是正面或负面的功能性影响。使用例如上述所述的试验能够测定这种功能性药剂变体的活性。
一些变体也是药剂的衍生物。衍生是化学中使用的将化合物转换为具有类似化学结构产品（所谓衍生物）的技术。通常，化合物特定的官能团参与衍生反应，并将离析物转换为偏离反应性、溶解度、沸点、熔点、聚合状态、功能活性或化学组分的衍生物。新的化学性能可以被用于定量或分离离析物或可以被用来优化作为治疗剂的化合物。可以将已知的衍生技术用于药剂。因此，如上所述的肽药剂的衍生物将含有某种程度上已经被化学修饰的氨基酸，从而区别于天然氨基酸。
也提供了药剂类似物。“类似物”指的是基本上和天然或非天然发生的肽具有相同结构和功能性特征的合成化合物，例如包括具有经修饰的骨架、侧 链和/或碱基的肽-和多核苷酸-样聚合物。肽类似物一般用在制药工业中作为具有类似于那些模板肽的性能的非肽药物。通常，类似物在结构上和具有生物学或药理学活性的模式肽（paradigm peptide）相似，但一个或多个肽键被取代。类似物可以完全由合成的、非天然氨基酸类似物组成，或是部分是天然肽氨基酸和部分是非天然氨基酸类似物的嵌合分子。只要基本上没有改变类似物的结构和/或活性，类似物也可以包括任意量的天然氨基酸保守取代物。
属于本发明保护范围的对活性剂的各种蛋白质修饰的简要说明在Karsenty,美国申请20100190697中有所描述。
药物制剂
本发明的某些实施方式描述了含有本文定义的一种或多种活性剂的药物组合物和制剂，包括但不限于小分子、多肽、抗体、核酸（包括反义RNA、siRNA、microRNAs、Cop1（含有半胱天冬酶募集结构域（Caspase recruitment domain）的蛋白16）和核酶，所述核酶能够降低消化道Ins-Prog细胞，尤其是N3Prog中的一种或多种FOXO蛋白的表达和/或生物活性，因此促使它们分化为产生并分泌胰岛素的消化道Ins+细胞。药物组合物将具有一种或多种下述作用，增加胰岛素分泌和血清胰岛素、增加胰岛素敏感性、增加葡萄糖耐受性、减少增重、减少脂肪量和引起体重降低。
通常给药足够量的治疗剂来治疗或预防1和2型糖尿病、代谢综合征和肥胖症；或减少脂肪量。本发明的药物组合物提供了有效的活性剂的量来治疗或预防列举的疾病或病症。
治疗剂的生物活性片段或变体也在本发明保护的范围内。“生物活性”指的是降低Foxo蛋白的表达或生物活性的能力。候选药剂可以经化学修饰来促进消化道Ins-细胞的吸取。例如，它可以和胆汁酸或脂肪酸相融合来促 进消化道细胞的吸取；或它可以被包覆于脂质体或其它脂基乳化体系内来促进它的吸取；它可以由表达经修饰的细胞表面抗原的细菌编码来促进和消化道上皮细胞的结合，使用包括N3Prog细胞-渗透肽（N3Prog.cell-permeable peptides）来促进细胞的吸取(Gratton et al.,Nature Medicine9,357-362(2003))。
术语“给药”是从最宽泛的意义上来讲的，包括将本发明的组合物引入受试者的任何方法。
本发明的药物组合物可以通过许多手段进行给药，取决于是否需要局部或系统的治疗以及被治疗的部位。NKO小鼠中具有最高密度消化道Ins+细胞的消化道区域位于回肠末端，在STZ处理的NKO小鼠中位于结肠和十二指肠末端。因此在一些实施方式中，以口服或局部给药到结肠或以制剂的形式将它们靶向于十二指肠吸收的方式给药药物组合物，或通过优选在接近十二指肠、回肠末端或结肠的部位或皮下植入渗透泵来给药药物组合物。给药也可以是静脉给药、肠胃外的/动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药，或肌肉注射给药或输注给药；或颅内给药例如囊内或心室内给药。也可以使用栓剂。在一些实施方式中制备了含有活性剂的缓释剂。术语“缓释”指的是从聚合药物释放系统（polymeric drug delivery system）中历经一天以上的时间来释放药物，其中，在聚合药物释放系统中配制有活性剂，聚合药物释放系统能够释放药物的有效浓度。
某些药物例如阻止胆汁酸吸收的树脂或糖分解的抑制剂被用于治疗2型糖尿病，而这些药物在血浆中根本不会被吸收。这种制剂在本发明的药物制剂中是有用的。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物含有约0.1mg-5g，约0.5mg-约1g，约1mg-约750mg，约5mg-约500mg，或约10mg-约100mg的治疗剂。
除了使用渗透泵连续给药外，活性剂也可以作为单一治疗进行给药，或 优选可以包括一系列治疗，以一定的频率继续和持续一段时间，使得一种或多种列举的疾病得到减轻或改善，或实现了预期效果，包括增加胰岛素分泌和血清胰岛素、增加胰岛素敏感性、增加葡萄糖耐受性、减少增重、减少脂肪量和引起体重降低。
可以理解的是适当的活性剂剂量取决于许多因素，在普通的医师、兽医或研究员的理解范围内。例如，剂量是变化的，取决于经治疗的受试者或样品的同一性、大小和条件，进一步取决于给药组合物的途径，和从业者对活性剂效果的需求。此外，可以理解的是，适当的活性剂剂量取决于表达或经调节的活性的效能。可以使用本文所述的试验测定这种适当的剂量。当给动物（例如人）给药一种或多种这些活性剂来调节Foxo蛋白的表达或活性时，首先指定相对低的剂量，逐渐增加剂量直到获得适当的反应。另外，可以理解的是，用于任意特定受试者的特定剂量水平取决于包括所使用的特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、任意药物的组合、表达或活性的调节程度在内的各种因素。
通常儿童和任何年龄的青少年被诊断为1型糖尿病，是先前为人们所熟知的青少年糖尿病。在1型糖尿病中，身体不产生胰岛素。胰岛素是所需要的将糖（葡萄糖）、淀粉和其它食物转化为日常生活所需要的能量的激素。和1型糖尿病相关的病症包括高血糖症、低血糖症、酮酸中毒和乳糜病（celiac disease）。
2型糖尿病是最常见的糖尿病形式。在2型糖尿病中，身体产生的胰岛素不足或细胞不识别胰岛素。和2型糖尿病相关的病症包括高血糖症和低血糖症。
和能量代谢相关的疾病包括糖尿病、葡萄糖耐受不良、胰岛素敏感性降低、胰腺β-细胞增殖减少、胰岛素分泌降低、增重、脂肪量增加和血清脂联素降低。
使用本领域已知的方法可以制备具有可接受载体的治疗剂。治疗剂的实际用量必须根据特定的制剂、给药途径、药物组合物的剂量、待治疗病症的特性和可能的个体受试者而变化。本发明药物组合物的剂量可以在很宽的范围内变化，取决于所需求的效果、治疗适应症（therapeutic indication）、给药途径和组合物的状态、纯度和活性。
适当的受试者可以是疑似具有或被诊断具有或存在发展为列举疾病的风险，或具有根据本领域知识能够确定的症状的个体或动物。
在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(20.sup.th edition,Gennaro(ed.)and Gennaro,Lippincott,Williams & Wilkins,2000)中描述了制剂和给药技术，通过引用纳入本文。可以通过医疗设备例如但不限于导尿管、气囊、移植装置、生物可降解移植物、人工血管（prostheses）、移植（grafts）、缝合、修补（patches）、分流器或支架（stents）将本发明的药物组合物给药于受试者。美国专利No.7,563,884详细描述了寡核苷酸的药物制剂。
本发明的药物组合物可以通过许多手段进行给药，取决于是否需要局部或系统的治疗以及被治疗的区域。给药可以是局部的（包括眼睛的和黏膜的（包括阴道和直肠给药））、肺的例如包括通过喷雾器吸入或吹入粉剂或气雾剂；气管内的、鼻内的、表皮的和透皮的）、口服的或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药或肌肉注射给药或输注给药，例如囊内给药或心室内给药。认为具有至少一个2’-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸对口服给药特别有利。
活性剂可以与其它相关的分子、分子结构或化合物的混合物，例如脂质体、受体靶向分子、用于促进摄入、分散和/或吸收的口服的、直肠的、局部的或其它的制剂混合、包覆、缀合或联合使用。典型的教导制备这种摄入、分散和/或吸收的协助制剂的美国专利包括但不限于美国专利No.5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020; 5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575和5,595,756,上述各个专利都通过引用纳入本文。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可以由各种组分包括但不限于预制液体（preformed liquids）、自乳化固体和自乳化半固体制成。
根据制药工业已知的常规技术，可以方便地制备本发明的以单位剂型存在的药物制剂。这种技术包括将活性组分和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常通过将活性剂和液体载体或细微的分离的固体载体或它们两者结合在一起来制备制剂，然后如果需要的话使产品成形。
用于肠胃外、皮肤内或皮下施用的溶液或悬浮液包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌剂例如苄醇或尼泊金甲酯（methyl parabens）；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如醋酸或柠檬酸和用于调节弹性的药剂例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH值。肠胃外的制剂可密封在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量药水瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液（其中的治疗剂是水溶性的）或分散剂和用于无菌注射溶液或分散剂的临时配制的无菌粉剂。对于静脉内注射，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.RTM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲液（PBS）。在所有情况下，组合物必须是无菌的，在一定程度上应当是液体以便易于存在于注射器中。在生产和储存的条件下应该是稳定的，且应该能够避免微生物例如细菌和真菌的污染而保存。
载体是含有例如水、乙醇、多元醇（例如丙三醇、丙二醇和液态聚乙二 醇等）和它们适当的混合物的溶剂或分散介质。通过例如使用卵磷脂包覆，在分散的情况下维持所需的粒度和使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗菌剂和杀菌剂例如对羟基苯甲酸酯（parabens）、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫汞撒（thimerosal）等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包括等压剂（isotonic agent）例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇和氯化钠。组合物中包括延缓吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶能够引起给药组合物的吸收延长。
通过将所需量的活性剂加入到适当的具有一种或以上所列举的组分的组合的溶剂中，根据需要，再使用过滤器除菌来制备无菌注射溶液。通常，将活性剂加入到含有碱性分散介质和以上所列举的那些所需的其它组分的无菌工具中来制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，产生活性组分的粉末，加上来自前述无菌过滤的溶液的任何附加的所需组分。
通常，口服组合物包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以封闭为胶囊或压缩成片剂。取决于治疗的特定病症，本发明的用于治疗动脉粥样硬化或其它元件代谢综合征的药物组合物能够系统地或局部地制备和给药。"Remington:The Science and Practice of Pharmacy"(20.sup.th edition,Gennaro(ed.)and Gennaro,Lippincott,Williams & Wilkins,2000)中描述了制备和给药技术。对于口服给药，药剂可以以肠溶形式（enteric forms）存在而不溶于胃，或者通过已知的方法进一步被包覆或混合而能够在GI部位的特定区域释放。为了口服治疗给药的目的，活性剂可以与赋形剂组合，并以片剂、锭剂和胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用液体载体制备成漱口水，其中液体载体中的化合物可以口服和吸嗞（swished）、和咳出或吞咽进行施用。相容性药物结合药剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等包括以下任一组分或类似性质的化合物：胶黏剂例如微晶纤维 素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，分裂剂例如海藻酸、PRIMOGEL.RTM.或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或STEROTES.RTM.；助流剂例如胶质二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或增味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精（orange flavoring）。
对于吸入给药，以来自压力容器或分配器的气雾喷雾的形式递送化合物，压力容器或分配器包括适当的推进剂，例如二氧化碳气体或喷雾器。
通过转化粘液质或透皮的手段也可以系统的给药。对于转化粘液质或透皮给药，在制剂中使用充满障碍的适当的渗透液。这种渗透液通常是本领域已知的，对于转化粘液质给药，包括例如洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。使用鼻用喷雾剂或栓剂可以实现转化粘液质给药。对于透皮给药，活性剂被制备成通常本领域已知的软膏、药膏、凝胶或面霜。
如果恰当，化合物也可以以栓剂（如具有常规的栓剂基体例如可可油和其它甘油酯）或用于用于直肠输送的保留灌肠的形式进行制备。
在一个实施方式中，制备具有载体的活性剂来预防化合物从身体中迅速被清除，例如控释制剂，包括植入剂和微胶囊传输系统。可以使用生物降解的生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯（polyorthoesters）和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域的技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以从Alza公司和Nova Pharmaceuticals有限公司商购获得。也可以使用脂质体悬浮液（包括靶向于特定细胞的脂质体与例如单克隆抗体）作为药学上可接受的药物载体。可以根据本领域技术人员已知的方法制备这些载体，例如美国专利No.4,522,811中所描述的方法。
制备单位剂型的口服的或肠胃外的组合物是特别有利的，容易给药且剂量均匀。本文中“单位剂型”指的是待治疗受试者适于作为单位剂量的身体上的离散单元；含有预定活性剂量的各个单元估算产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。本发明单位剂型的说明由活性剂独特的特征和待实现的具体 治疗效果确定，并直接取决于活性剂独特的特征和待实现的具体治疗效果，本领域中混合这种用于治疗个体的活性剂具有固有的局限性。
如前所述，可以通过泵连续给药药剂或在一天的一段时间内频繁的给药药剂。在某些实施方式中，可以以约0.3-100ng/小时，优选约1-75ng/小时，更优选约5-50ng/小时，甚至更优选10-30ng/小时的速度给药药剂。可以以约0.1-100pg/hr，优选约1-75微克/hr，更优选约5-50微克/hr，甚至更优选约10-30微克/hr的速度给药药剂。应当理解的是，用于治疗的抗体、蛋白质或多肽的有效剂量可以在整个具体的治疗过程中增加或减少。从监测生物样品优选血液或血清中的胰岛素水平和/或监测血糖控制而言，剂量的改变可以产生并变得更加明显。
本发明的实施方式中，在要求的时间内，使用渗透泵灌输所需剂量的药剂，经皮下长期自动给药来输送药剂。胰岛素泵广泛存在，且被糖尿病患者使用进行长时间自动输送胰岛素。这种胰岛素泵可以适于输送药剂。药剂的输送速率控制葡萄糖耐受不良，可以很容易的大范围调整1或2型糖尿病来适应个体对变化的胰岛素的需求（例如基础速率和剂量）。新的泵能够允许周期剂量方式，也就是液体输送是以小的固定体积的周期离散剂量的方式进行的而不是连续流动的方式。通过控制和调整剂量周期来控制和调整装置的整个液体输送速率。泵可以与连续血糖监测装置和远程单元连接，例如美国专利No.6,560,471,名称为"Analyte Monitoring Device and Methods of Use"中所描述的系统。在这种装备中，可以无线连接控制连续血糖监测装置的手控式远程单元并控制血糖监测单元和输送本发明治疗剂的液体输送装置。
本发明的组合物可以被制成许多任意可能的剂型例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以制备成含水的、无水的或混合介质的悬浮液。含水悬浮液可以进一步包括增加悬浮液粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。悬浮液也可以包括 稳定剂。
实施例
实施例1.
方法
抗体和免疫组织化学
如（26）所述的进行组织固定和免疫组织化学处理。针对下列蛋白的兔一抗：Foxo1和葡糖激酶(Santa Cruz)、Pdx1(由C.Wright馈赠)、胰高血糖素(Sigma,Phoenix Peptide)、GFP(Invitrogen)、嗜铬粒蛋白A、Glut2(均来自Chemicon)、PC2(US Biologicals)；针对下列蛋白的豚鼠一抗：胰岛素（Dako）、胰腺多肽（Linco）、GFP(Rockland)；针对突触素(Millipore)的小鼠一抗和针对下列蛋白的山羊一抗：TLE5/Aes、Neurog3(Santa Cruz)Pdx1(来自C.Wright)。我们使用FITC-、Cy3-、Alexa-缀合的驴二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories和Molecular Probes有限公司)，或如（26）所述的过氧化物酶染色法。我们用DAPI染色细胞核。如（26）所述做了图像采集和分析。
动物
已经描述了Pdx1-Cre(9)、Neurog3-Cre(3)、Rosa26-eGfp、和Neurog3-Gfp(7)。用Foxolflox/+雄性小鼠（33）杂交这些动物来产生Neurog3-cre:Foxo1loxlox(NKO)和Pdx1-cre:Foxo1lox/lox(PKO)。为了产生Ins2-Gfp基因敲入小鼠，我们通过重组改进了BAC克隆RP22-342(CHORI,Oakland,CA)来取代具有Gfp的编码序列Ins2。我们在ES细胞中转染了重组克隆，并通过DNA印迹法筛选了同源重组体。如前面（34）所述产生了生殖细胞系嵌合体。
生理研究。给10-12个月大的小鼠于腹膜内注射链脲霉素（STZ）（250mg/kg）来诱发糖尿病。给对照小鼠注射日常的NPH-胰岛素（Eli Lilly） 2-4U，通过口服填喂法（使用带有延长尖端的针将葡萄糖直接送入胃中）或于腹膜内注射葡萄糖溶液（2mg/g体重）对禁食3-4个月的雄性小鼠进行一整晚的葡萄糖耐受性试验。
胰岛素生物测定。从新的（P3）消化道、肝脏和胰腺（35）制备酸-乙醇提取物。将组织提取物或重组的人胰岛素(Humulin R,Eli Lilly)(10U/ml在酸-乙醇溶液中)和胰岛素中和抗体(Thermo Scientific)或同种型匹配的小鼠IgG1(Ebiosciences)混合并以50微升为单位体积进行皮下注射。注射前或注射后5分钟立即进行葡萄糖测试。
胰岛素分泌。使用含有0.12mM双硫腙（DTZ）（10）的培养基将成体肠染色，并从NKO小鼠或解剖学上匹配的对照小鼠上选择5英寸长的DTZ+片段。所述肠被切开并在补充有10%FBS和20mM的葡萄糖的不含葡萄糖的DMEM中培养30分钟。培养结束后，通过ELISA(Millipore)测量培养基中胰岛素和C肽2的含量。将来自14周大的WT小鼠的经胶原酶纯化的胰腺细胞作为对照（5）。
消化道上皮细胞的分离
正面将肠切开，用冰冷的PBS(Mg2+/Ca2+)洗涤，并将其切成5-10mm长的切片。肠片段在20mM的EDTA中于37度下培养，然后使用10ml移液管在冷的PBS中剧烈重悬。然后收集释放的上皮细胞用于分泌和RNA分析。
如上所述对用于FACS分析的消化道上皮的单一细胞进行分离，除了样品（36）中包括的的绒毛部分以外。
十二指肠的培养规则（Dog），Golaz et al.,In vitro Cell.Dev.Biol.2007培养基1：
FCM:OptiMEM GlutaMax
Anti-anti
mEGF(20ng/ml)(Sigma)
来自牛胰腺的胰岛素(10μg/ml)(Sigma)
氢化可的松21琥珀酸钠盐（hydrocortisone21hemisuccinate sodium salt）(150nM)(Sigma)
N2补充物(0.5×)(R&D体系)
B27(0.5×)(R&D体系)
10%FCS(Hyclone;Thermo Scientific)
Primocin(InVivoGen)
培养基2(遮光保存)=
培养基1加上
+m-Wnt3a(50ng/mL)(R&D体系)
+Chir990213uM(Stemgent)
+LDN-19318925uM(Stemgent)
培养基3
+m-Wnt3a(100ng/mL)(R&D体系)
+Chir990216uM(Stemgent)
+LDN-19318925uM(Stemgent)
+FGF450ng/ml
+2%FCS
培养基3b
+m-Wnt3a(100ng/mL)(R&D体系)
+Chir990216uM(Stemgent)
+LDN-19318925uM(Stemgent)
+FGF450ng/ml
+2%FCS
培养基4
=培养基3b+0%FCS
从肠和结肠分离隐窝的方法
1.从小鼠中取出6英寸的回肠末端和4英寸的结肠，将它们收集到冰冷的DPBS/10%FBS中，
2.切开片段，并用冰冷的强化培养基（FCM）洗涤五次，
3.在无菌培养皿中展开各个十二指肠片段，用无菌手术刀片轻轻刮腔表面来去除粘液和大多数的绒毛（丢掉刮下的碎屑），
4.将剩下的浆膜置于50ml的管中（FCM），
5.洗涤沉积的颗粒并抽出上清液，
6.在含有2mM EDTA的PBS中螯合30分钟，
7.与EDTA温育后使小碎片沉积下来，去除上清液，
8.添加10ml PBSO10%FBS，并用移液管吸取几次（3-5），然后将其通过70μM的过滤器收集上清液，使用新的过滤器重复3次（存在不同的隐窝洗脱碎片），
9.以800rpm旋转隐窝碎片5分钟形成颗粒，
10.用10ml冷的FCM再次悬浮颗粒，并以较低的速度离心小管（600rpm，2分钟），去除单一的细胞（主要是淋巴细胞），
11.使用显微镜检查每个碎片通过过滤器后的隐窝的大小，估计每个碎片隐窝的数量，于4℃下以600rpm将其旋转5分钟，
12.以600rpm再次旋转所需量的隐窝5分钟，去除大部分上清液，把 颗粒置于冰上（对于24孔板中的1个孔，需要100-1000个被50μl基质胶滴液稀释的隐窝），
13.对于20孔，向具有1000-10000个隐窝的颗粒中添加1ml的解冻的基质胶，并使用冷的1000μl尖端的移液管移取（基质胶应该置于冰上，像隐窝颗粒和尖端一样），
14.在培养基1（如上所述）中于37℃下培养3天，然后转移至培养基2中，每隔一天更换培养基并在培养基2中保持3天，
15.细胞被置于培养基3或培养基4中4-6天。培养基4被用于siRNA研究。
RNA过程。使用了mRNA分离和定量PCR的标准技术。RT-PCR进行35个循环。描述了Pc2、Gck、Kir6.1、Sur1神经元素3、Pdx1、MafA、Nkx6.1、NeuroD1、Nkx2.2、Arx、Pax4、微管蛋白2(37)、胰岛素1、胰岛素2(38)、Glp132、Math1和Hes138Hes1(38)的引物序列。
统计分析。使用学生T测试（Student’st‐test）分析数据。一个星号：P<0.05；两个星号：P<0.01。我们用平均值±SEM表示数据。
实施例2
Foxo1消融导致消化道内的Neurog3+细胞的数量增加了十倍
转录因子Foxo1多方面调控胰腺β细胞功能（4t），在Neurog3+胰腺内分泌祖细胞中广泛表达（5）。在分离的人胎儿胰腺上皮细胞中，Foxo1敲入增加了NEUROG3+细胞（6t）的数量。类似于胰腺，Foxo1也在大多数Neurog3+肠内分泌祖细胞（EEP）中表达，通过双重免疫组织化学（7t）进行鉴别（见图1a和5）。在成年小鼠中Foxo1表达（与人FOXO1直接同源的结构和功能，3和/或4）位于基于形态学和定位的穿过消化道的包括分泌细胞、内分泌细胞和干细胞的细胞亚群。肠内分泌细胞是分泌细胞亚群。有3种类型的 分泌细胞：杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞。杯状细胞和潘氏细胞通常不产生激素。产生FOXO1的神经元素3+肠内分泌祖细胞（N3Prog）在通常的条件下分化成不产生N3或胰岛素的肠阳性激素子细胞（它们是Ins-）。
为了研究Foxo1在肠内分泌细胞中的作用，在肠内分泌祖细胞（21）（NKO，或Neurog3-驱动的Foxo1敲除）中将小鼠的Foxo1的体细胞剔除。为了评估Neurog3+细胞中Cre-介导的重组，将NKO和Neurog3-Gfp转基因小鼠进行杂交。免疫组织化学显示Foxo1在Gfp-标记的细胞中不再被检测到，表明有效的发生了剔除（见图1b）。
Foxo1消融导致Neurog3+细胞的数量增加了十倍（见图6），由下面几点得到证明：
（ⅰ）具有抗-Neurog3抗体的免疫组织化学
（ⅱ）Neurog3mRNA在流式筛选Gfp+细胞中的测量值（见图6）
（ⅲ）对来自于NKO：Neurog3-Gfp两倍转基因小鼠(//2011年3月论文中补充的图2)的Gfp+细胞的流式细胞分析，使用Neurog3-Gfp转基因进行谱系（lineage）的追踪研究（7）。
通常的动物中，分析消化道中N3Prog细胞仅仅产生不产生胰岛素的肠内分泌细胞。发现在小鼠肠中敲除Foxo1导致消化道N3池细胞（pool cells）增加了10倍。很难估计转化为产生胰岛素细胞的来自消化道N3ProgFoxo1(-/-)池的细胞的%含量，这是因为它们似乎是特定区域的，也就是通常更为频繁地在NKO小鼠的回肠末端和结肠内发现Ins+细胞，但是后-STZ试验显示消化道Ins+细胞再次产生并可以在整个消化道中发现。这表明消化道N3Prog Foxo1(-/-)细胞在消化道的其它地方也有可能产生Ins+细胞，这是对其它线索例如炎症信号的响应。
Neurog3+细胞的增加和表达嗜铬粒蛋白A的细胞的类似的增加，在 Neurog3活化后肠内分泌细胞分化的标记的表达有关系，表明Foxo1消融扩增了消化道Neurog3+祖细胞和它们的子细胞（8）（见图6）。
实施例3
Foxo1消融导致消化道肠内分泌细胞分化成产生胰岛素和具有胰腺细胞表达谱特征的消化道Ins+细胞。
将正常的小鼠（Foxo1fl/fl）和具有Foxo1体细胞剔除基因的Foxo1敲除小鼠进行比较（指的是NKO、神经元素3-驱动的Foxo1敲除）。组织学研究显示在正常的小鼠中Foxo1位于消化道N3Prog（见图1b）和它们的N3-、阴性胰岛素（Ins-）子代（消化道Ins-细胞）上。
相反地，当通过针对肠和胰岛激素的免疫组织化学来研究新生的NKO（P1）小鼠的肠，发现和正常小鼠不同，新生的NKO小鼠具有许多阳性胰岛素（胰岛素-免疫反应）消化道Ins+细胞（见图1c）。
在新生的和成年小鼠中均较低频率的观察到了具有特定胰腺激素胰高血糖素（Gcg+）或胰腺多肽(Pp+)的细胞免疫反应（见图7）。Ins+细胞出现在包括结肠的整个消化道中（见图8）。另外，RT-PCR分析确定了从NKO小鼠消化道细胞中提取的RNA中Ins1和Ins2的转录的存在，但不控制肠（见图9）。
因此，NKO动物中的Foxo1消融激活了一些肠道肠内分泌细胞中的显著的胰腺内分泌表达进程，改变了它们的表型，从不产生胰岛素（消化道Ins-）变为产生胰岛素（消化道Ins+细胞）。
实施例4
来自阴性胰岛素祖细胞的消化道Ins+细胞
为了研究Ins+细胞的来源，为它们的同一性提供独立的证据，在小鼠中 产生了3个附加的遗传模型。NKO小鼠的数据表明神经元素3消化道内分泌祖细胞中Foxo1消融足以激活胰腺-样内分泌分化，但不能证明这是神经元素3+细胞特定的性能，与通常不受约束的肠祖细胞例如干细胞、瞬时增殖祖细胞或分泌祖细胞21相反。首先，Foxo1在十二指肠上皮细胞祖细胞中消融，它是Neurog3+细胞肠内分泌细胞祖细胞的前驱，使用Pdx-cre(9)(Pdx1-驱动Foxo1的敲除或PKO)。类似于NKO小鼠，PKO小鼠十二指肠中显示了Ins+细胞，和显著增加的Neurog3-Gfp+细胞（见图10）。将PKO小鼠和Neurog3-Gfp报告小鼠杂交，确定了Foxo1消融。这些试验证实了消化道中的Ins+细胞来自增大的神经元素3+前体（N3Prog）池。消化道Ins+细胞不受在肠干细胞中起作用的Foxo1或瞬时增殖祖细胞的影响。肠祖细胞中广泛的Foxo1敲除（所有肠上皮细胞将会出现的细胞，包括分泌细胞）表型模拟肠内分泌祖细胞中的Foxo1敲除（形成了肠内分泌细胞将会出现的细胞）。肠祖细胞产生了所有类型的肠细胞，包括干细胞和产生N3Prog的瞬时增殖祖细胞。这些试验突出了消化道干细胞中的敲除Foxo1和消化道N3Prog和它们的后代也会导致肠内分泌细胞Ins+细胞表型的形成。一些存在的消化道肠内分泌细胞Ins细胞通过还原FOXO蛋白可以获得Ins+表型也是有可能的。
通过基因靶向产生了具有胰岛素2-Gfp敲入等位基因的小鼠，来提供敏感的、特定读出的内生Ins2转录。当Ins2-Gfp等位基因被引入NKO小鼠（NKO-胰岛素2-Gfp），在突变的小鼠消化道中的Ins2-Gfp+细胞很容易被检测到，但在WT同窝出生仔畜中没有这种细胞。相反地，在两个基因型的胰岛中检测到了Ins2-Gfp表达。具有胰岛素和Gfp抗体的双重免疫组织化学证实了鉴别的Gfp+细胞是Ins+细胞（见图1e）。
最后，使用遗传谱系跟踪试验研究Ins+细胞是否出现细胞自体性或非细胞自体性机制。为了做这个试验，在成年肠中产生了导向Rosa26eGfp报告基因的标记Neurog3-Cre-活化细胞和它们的子细胞的NKO小鼠（NKO- Rosa26eGfp）。在胰腺中，NKO小鼠和参考的同窝出生仔畜中所有β细胞都是Gfp+（见图1f）。在NKO小鼠中仅仅消化道Ins+细胞是Gfp+，确认表明了在经Cre-介导的重组细胞中胰岛素表达的发生（见1f）。
实施例6
消化道Ins+细胞发生终末分化并与胰腺β细胞具有相同的谱系。
为了研究消化道Ins+细胞是否发生终末分化，进行了适当的免疫组织化学标记。检测到了激素原转化酶-2（Pc2）、葡糖激酶（Gck）、磺酰脲受体（Sur1）和葡萄糖转运子2（Glut2）的表达（见图2a-d）。这些标记在发生终末分化的胰腺β细胞中表达。Pc2主要是正常小鼠中特定的β细胞。消化道Ins+细胞也被pan-内分泌标记突触素抗体修饰（见图2e），表明它们是产生激素的细胞。总之，消化道Ins+细胞和胰腺β细胞共享关键的特征。免疫组织化学结果和分离的消化道上皮细胞中编码Pc2、Gck、Kir6.2和Sur1的mRNA的增加的水平有关系（见图11）。
使用Zn螯合剂双硫腙（DTZ），重要的胰岛（10）标记，富含Ins+细胞的消化道试样被定位用于进一步的分析。在来自富含DTZ的NKO消化道的经分离的上皮细胞中，检测到编码转录调控的β细胞分化Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2和Pax4的mRNA（见图12）。免疫组织化学证实了Pdx1和Nkx6.1的表达（见图13）。使用低密度PCR阵列，在NKO消化道上皮细胞中检测到大量（大于100倍）增加的编码groucho-相关基因Aes（剪接的氨基末端增强子，也被称为Tle5）（11）的转录（见图14）。Aes在正在发育的和成年胰腺（12）中表达，Aes异位表达和增加的Nkx2.2和Nkx6.1神经元结构域（13）有关系。通过免疫组织化学，Aes表达被定位在消化道Ins+细胞。而且，谱系跟踪实验表明NKO:Rosa26eGfp小鼠中的Gfp+细胞被Aes抗体修饰（见图14），证明Foxo1消融促进Aes表达以细胞自体性的方式进 行。这些结果给消化道Ins+细胞和胰腺β细胞共享谱系提供了额外的证据。
实施例7
NKO肠以葡萄糖剂量依赖的方式分泌胰岛素和C-肽。
经调控的胰岛素分泌是胰腺β细胞的主要特点，证明在ES细胞衍生的产生胰岛素的细胞（14）中进行复制很困难。为了确定消化道Ins+细胞是否起到分泌胰岛素的作用，我们进行体外胰岛素分泌试验来响应葡萄糖和KATP通道调节剂，使用DTZ染色来自NKO小鼠的富含Ins+细胞的筛选的消化道片段，自动和来自对照小鼠的片段进行匹配。NKO肠以葡萄糖剂量依赖的方式释放胰岛素和C-肽；因此，在11mM葡萄糖中的温育导致胰岛素分泌物增加了2.5倍，在22mM葡萄糖中的培养导致胰岛素分泌物增加了7倍以上。磺酰脲格列本脲（sulfonylurea glibenclamide，KATP通道阻断剂）增强了葡萄糖诱导的胰岛素的释放，而KATP通道激活剂二氮嗪使其钝化（见图3a-b）。
葡萄糖依赖性胰岛素和C-肽分泌试验
成年肠在含有0.12mM的双硫腙（DTZ）的培养基中是紧张的（strained）(Tuttle et al Nat Med,2001)，选择来自NKO小鼠的5英寸长的DTZ+片段或来自对照WT小鼠的自动匹配的片段。准备了肠的表面（en face preparation），将其在补充了不同浓度的葡萄糖、0.5mM二氮嗪（Sigma）或10mM格列本脲(Tocris)的HEPES-Krebs Ringer缓冲溶液中温育1小时。温育结束后，用ELISA(Millipore)测量了培养基中胰岛素和C-肽2的含量。来自14周大的WT小鼠的经纯化的胶原酶胰岛作为对照（Kitamura et al.,MCB2009）。使用成年肠进行试验（n=4）。
实施例8
由消化道Ins+细胞分泌的肠胰岛素具有生物活性
为了检测由消化道Ins+细胞分泌的肠胰岛素是否具有生物活性，制备了来自NKO消化道的酸-乙醇提取物，提取物也从WT小鼠的消化道、胰腺和肝脏中制备，并将其注入到新生的小鼠中。来自新生的NKO肠的提取物使血糖降低了20%，类似于来自年龄相仿的对照小鼠或重组人胰岛素的胰腺提取物（参见图3c）。相反地，来自对照肠或肝脏的提取物没有任何影响。NKO消化道提取物降低血糖的能力被增加的胰岛素中和抗体占有，和来自对照小鼠和重组胰岛素的胰腺提取物的情况一样。相反，培养具有同种型匹配的对照IgG的NKO消化道提取物对它们降低血糖过多的能力没有影响（见图3c），表明降血糖作用是由于胰岛素，不是由于NKO消化道提取物中的其它因素。这些结果显示了消化道Ins+细胞的胰岛素分泌能够被葡萄糖和KATP通道调节剂调控，消化道衍生的胰岛素具有生物活性。
实施例9
在体内经链脲霉素处理的NKO小鼠显示接近正常的口服葡萄糖耐受性
不同于胰腺内分泌细胞，消化道肠内分泌细胞由整个生命过程的Neurog3+祖细胞产生(21)。因此在毒素诱导的糖尿病模型中消化道Ins+细胞比胰腺β细胞具有较强的再生能力是有可能的。为了测试这个结论，对NKO和对照小鼠注射链脲霉素（STZ），引发了高血糖症（见图4a）。通过每天注射胰岛素使对照小鼠的葡萄糖水平保持在约500mg/dl，持续28天。相反地，NKO小鼠没有接收任何胰岛素，但9天STZ后它们的葡萄糖水平开始自发地降低，并在饲养状态稳定在约250mg/dl（见图4a）。
去除胰岛素后，60天时100%的对照小鼠死亡，而75%的NKO小鼠存活下来直到试验结束的第92天（见图4b）。经STZ处理的NKO小鼠显示接 近正常的口服葡萄糖耐受性（见图4c）。免疫组织学分析显示STZ消融了胰腺和肠的消化道Ins+细胞（见图4d）。消化道Ins+细胞对STZ消融的敏感性进一步为它们类似于胰腺β细胞提供了证据（15）。
在28天后-STZ获得的样品中，和STZ处理前相比，消化道Ins+细胞较频繁的出现在NKO消化道中，它们表达成熟β细胞、Pc2（见图4d）和Aes（见图14）的标记，表明了它们的功能特点仍是完整的。使用NKO：Ins2-Gfp敲入小鼠来谱系跟踪细胞，确定后-STZ、消化道Ins+细胞激活了内生的Pc2表达，这类似于经观察的前STZ消化道Ins+细胞（见图2b）。与消化道相反，免疫组织化学研究表明没有证据表明胰腺β细胞在NKO小鼠中能够再生（见图4d），与经处理的对照介质相比（0.1±0.08g/胰腺后-STZ对26±2.25/胰腺前-STZ），试验结束后几乎检测不到胰腺胰岛素的含量，因此排除胰腺β细胞再生对观察到的表型（16）的贡献。任何阶段消化道中都没有Ins+细胞或来自对照小鼠的胰腺（见4d）。与STZ处理前相比，PKO小鼠中的消化道Ins+细胞更加频繁的被观察到。
实施例10
和Foxo1杂交的siRNA引起消化道胰岛素-Prog分化为消化道Ins+细胞
为了确定siRNA是否能够降低Foxo蛋白的表达，使用隐窝的一系列试验，隐窝分离自对照WT小鼠和Neurog3-Foxo1敲除（NKO）小鼠的回肠末端和结肠，两者都是通过生物工程在Ins2基因座携带有GFP报告因子。首先细胞在培养基1中进行体外培养。培养3天后在正常或NKO-GFP小鼠中均没有GFP-Ins+细胞，见图16。第三天将细胞转移至培养基2中，第6天活的荧光显微图显示NKO小鼠中的一些胰岛素-Prog细胞分化为/转化为表达绿色荧光蛋白的胰岛素+细胞，见图17。当经上述分离的隐窝在培养基1中培养1天，在培养基2中培养2天，然后在培养基4b中培养3天时，胰岛 素+细胞的百分含量增加到甚至更高的水平，见图18。当分析这些隐窝时，可以确定绿色细胞是活细胞，蓝色细胞是死亡细胞，见图19。
最后进行了试验来确定正常的WTIns-Prog细胞是否对失活的Foxo1有反应，将其与siRNA接触将会使得它们分化为产生胰岛素的细胞。将分离的隐窝在培养基1中保持1天，在培养基2中保持2天。第3天将细胞转移至培养基4b中，培养基4b包括在脂质体转染中（由Mirus Trans-IT）递送的50nM siRNA//最终总浓度=50nM暴露的细胞，不加50nM siRNA//这足以补充Foxo1基因确定使它的表达失活。然后将隐窝和siRNA另外培养72小时，目前的剂量已经非常有毒//如图20所示，Foxo1表达（基因转录）的siRNA抑制导致出现了胰岛素+细胞。这显示针对Foxo1将正常的WT消化道Ins-Prog细胞和siRNA接触引起了细胞转化为胰岛素+肠内分泌细胞表型。
类似于非siRNA试验，分离细胞并在培养基1和2中生长3天。在1:5稀释基质胶中的96孔板的每孔中种下100个隐窝（BDbiosciences）。
siRNA被稀释的最终浓度为50nM，根据厂商(Trans-It,Mirus)，在4b培养基（主要Media2+0%FCS,100ng/ml mWnt3a,50ng/ml FGF4）中转染72小时。
使用Thermo Scientifc(Dharmacon Accell SMARTpool,Mouse FOXO1,E-041127-00-0010,3′-UTR)和阴性转染对照物（Dharmacon Accell Mouse Control siRNA Kit-Red,K-005000-R1-02，4个对照物）进行试验。
每种情况做四个平行。
siRNA用于96孔板中各孔的表型改变试验（#活的绿色细胞），Foxo1敲入通过qPCR确认。
Foxo1siRNA处理的细胞引起2%的绿色细胞/孔。
Accell SMARTpool siRNA A-041127-13,
目标序列:CUAUUAUUGUACAUGAUUG FOXO1 SEQ ID NO.7
Mol.Wt.13,501.1(g/mol)
xt.Coeff.372,198(L/mol·cm)
Accell SMARTpool siRNA A-041127-14,FOXO1
目标序列:CGAUGAUACCUGAUAAUG SEQ ID NO.8Mol.Wt.13,521.4(g/mol)
Ext.Coeff.365,968(L/mol·cm)
Accell SMARTpool siRNA A-041127-15,FOXO1
目标序列:UCGUAAACCAUUGUAAUUA SEQ ID NO.9Mol.Wt.13,489.3(g/mol)
Ext.Coeff.376,470(L/mol·cm)
Accell SMARTpool siRNA A-041127-16,FOXO1
目标序列:CCAGGAUAAUUGGUUUUAC SEQ ID NO.10Mol.Wt.13,519.3(g/mol)
Ext.Coeff.361,874(L/mol·cm)
商品目录编码（Catalog Item）
K-005000-R1-02
Accell Mouse Control siRNA Kit-Red
The
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-05,FOXO1
目标序列:GGUGUCAGGCUAAGAGUUA SEQ ID NO.11Mol.Wt.13,429.9(g/mol)
Ext.Coeff.371,219(L/mol·cm)
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-06,FOXO1
Mol.Wt.13,414.8(g/mol)
Ext.Coeff.377,004(L/mol·cm)
目标序列:GUAAUGAUGGGCCCUAAUU SEQ ID NO.12
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-07,FOXO1
Mol.Wt.13,459.8(g/mol)
Ext.Coeff.357,691(L/mol·cm)
目标序列:GCAAACGGCUUCGGUCAAC SEQ ID NO.13
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-08,FOXO1
Mol.Wt.13,384.9(g/mol)
Ext.Coeff.384,302(L/mol·cm)
目标序列:GGACAACAACAGUAAAUUU SEQ ID NO.14
总结
总之，在消化道肠内分泌祖细胞中，单个转录因子的体细胞消融（somatic ablation）、Foxo1能够引发具有谱系和产生胰岛素、葡萄糖响应细胞（见图15）的功能性特点的消化道Ins+细胞的生成，可与胰腺β细胞相媲美。和生产细胞的肠抑胃肽（GIP）不同，被设计来表达胰岛素原转基因（17），消化道Ins+细胞似乎遵循着和内生β细胞相同的发展路径，如Ins2-Gfp敲入等位基因所表明的。这个特点可能说明了在NKO小鼠中比在被移植了来自胚胎干细胞（14）的产生胰岛素的细胞的小鼠中具有更迅速逆转STZ糖尿病的特性。消化道Ins+细胞以葡萄糖依赖型和二氮嗪抑制型方式分泌胰岛素的能力减轻了对1型糖尿病细胞替代方法的不受调节的胰岛素分泌的担忧。在本文 中，消化道肠内分泌细胞祖细胞的适应性在消化道（18）的千变万化的代谢功能中起着重要的作用，包括根据肥胖外科手术（bariatric surgery）获得的令人惊讶的糖尿病逆转（19）。
根据上述试验和随后的实施例阐述了本发明，这不得理解为是对本发明的限制。本申请引用的参考文献、在审的专利申请和公开的专利的所有内容清楚的通过引用的方式引入。本领域的技术人员应该理解的是，本发明可能表现为许多不同的形式，不应该将本文中所述的实施方式作为对本发明的限制。当然，提供这些实施方式以便这些公开的内容完整地向本领域技术人员传达本发明的内容。在本发明前述说明的教导和暗示下，本领域技术人员能够想到本发明的许多修改和其它实施方式。尽管使用了专用术语，除了另有说明外，都是本领域所使用的。
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