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1、(10)申请公布号 CN 103509182 A (43)申请公布日 2014.01.15 CN 103509182 A (21)申请号 201210206856.5 (22)申请日 2012.06.21 C08G 73/04(2006.01) C12N 15/87(2006.01) A61K 48/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿 生研究所 地址 215123 江苏省苏州市工业园区若水路 398 号 (72)发明人 张智军 刘敏 沈贺 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 范晴 (54) 发明名称 具有高缓冲能力基于。
2、聚乙烯亚胺的基因载体 及其制备方法 (57) 摘要 本发明所要解决的问题在于提供一种具有高 缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方 法 ： 通过迈克尔加成的方法， 一步制备聚乙烯亚 胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载 体。本发明的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的 基因载体通过静电相互作用与带负电荷的 DNA 分 子形成聚电解质复合物， 复合物中的阳离子聚合 物一方面包裹 DNA 使之不被核酸酶降解 ； 另一方 面其 “质子海绵作用” 可有效帮助复合物实现内涵 体逃逸， 释放的 DNA 进入细胞核表达相关蛋白质， 实现基因治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6。
3、 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103509182 A CN 103509182 A 1/1 页 2 1. 具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤， （1） 取聚乙烯亚胺溶于无水甲醇， 加入 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺 , 聚乙烯亚胺 ： N,N- 亚 甲基双丙烯酰胺的质量比为 4 ： 0.77， 通往氩气保护， 反应过夜 ； （2） 将反应液置于 RC 膜透析袋中， 其截留分子量为 3500， 超纯水透析 5-8 天， 冻干得到 黄色油状固体，。
4、 即为制备的聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子， 保存在干燥 器中， 反应式如下。 2. 根据权利要求 1 所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法， 其 特征在于， 所述聚乙烯亚胺分子量为 423Da-1800Da。 3. 根据权利要求 1 所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法， 其 特征在于， 所述聚乙烯亚胺分子量为 800Da。 4. 根据权利要求 1 所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法， 其 特征在于， 所述步骤 （1） 中反应温度为 25-100 C 5. 根据权利要求 1 所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的。
5、制备方法， 其 特征在于， 所述步骤 （1） 中反应温度为 50。 6. 一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体， 其化学式 I 为 7. 如权利要求 6 所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体用于基因治疗。 权 利 要 求 书 CN 103509182 A 2 1/6 页 3 具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及基因治疗技术领域 , 特别涉及一种具有高缓 冲能力基于聚乙烯亚胺阳离子高分子的基因载体及其制备方法,阳离子高分子与DNA结合 后， 有效实现内涵体逃逸， 递送 DNA 进入细胞表达相关蛋白质， 实现基因治。
6、疗。 背景技术 0002 随着基因治疗研究的不断深入， 尤其是基因治疗临床实验的广泛开展， 人们越来 越认识到选择恰当的载体， 使目的基因靶向、 可控并有效地表达， 是基因治疗成功的关键。 目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体 （viral vector） 和非病毒载体 （non-viral vector） 两种。 病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性， 转染效率 高且对大多数细胞都有靶向作用， 已被广泛而有效地得到了应用。但是其携带的 DNA 大小 有限， 而且病毒载体能引起免疫原性反应、 致癌性以及能任意地整合到主体的基因组当中， 存在着很大的安全隐患。 而非病毒载体。
7、具有合成简单、 可以携带大容量的遗传物质、 无免疫 原性等诸多优点， 因此非病毒载体的研究倍受人们的重视 （Mintzer MA,Simanek EE.Chem. Rev.2009,109,259-302;Morille M,Passirani C,Vonarbourg A,Clavreul A,Benoit JP.B iomaterials.2008,29,3477-3496） 。 0003 到目前为止， 研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒基因载体， 其中， 阳 离子高分子由于具有安全性高， 免疫原性低， 易于对 DNA 进行操作， 价格低， 特别是其结构 易于改造等优点， 因此人们。
8、对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越高， 基于阳离子聚 合物载体的基因传递方式已经被广泛应用于人类遗传病和其他疾病的基因治疗研究。 虽然 这些阳离子载体具有极低的免疫原性， 但是较低的转染效率和瞬时蛋白表达成为这类载体 用于基因治疗中的最大障碍。 因此如何提高阳离子聚合物基因传递体系的基因转染效率成 为当前非病毒基因传递体系研究的热点问题之一。 0004 众多的聚阳离子中， 聚乙烯亚胺 PEI 由于极高的正电荷密度， 可以和 DNA 形成紧 密的络合体， 因此引起了研究者极大的兴趣， 使其成为近年来体内外细胞转染中研究最 广、 转染效率最高的合成载体。PEI 较高的正电荷密度一方面赋予了其较。
9、高的转染效率， 但同时赋予了其较大的细胞毒性， 限制了其应用。为了降低 PEI 的细胞毒性， 一些研究组 从生物相容性考虑， 设计合成了多种低毒性的 PEI 衍生物 （Petersen H,Merdan T,Kunath K,Fischer D,Kissel T.Bioconjugate Chem.2002,13:812-821;Gosselin MA,Guo WJ,Lee RJ.Bioconjugate Chem.2001,12:989-994） 。 发明内容 0005 本发明所要解决的问题在于克服现有技术中聚乙烯亚胺的基因载体毒性较高的 缺陷， 提供一种具有高缓冲能力、 高转染效率的基于聚。
10、乙烯亚胺的基因载体的制备方法。 0006 本发明的所要解决的又一问题， 在于提供具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因 载体。 说 明 书 CN 103509182 A 3 2/6 页 4 0007 本发明的所要解决的又一问题， 在于提供上述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺 的基因载体的应用。 0008 为了解决现有技术中的这些问题， 本发明第一方面提供的技术方案是 ： 具有高缓 冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤， 0009 （1）取聚乙烯亚胺溶于无水甲醇， 加入 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺 , 聚乙烯亚胺 ： N,N- 亚甲基双丙烯酰胺的质量比为 4 ： 0.7。
11、7， 通往氩气保护， 反应过夜 ； 0010 （2）将反应液置于 RC 膜透析袋中， 其截留分子量为 3500， 超纯水透析 5-8 天， 冻干得到黄色油状固体， 即为制备的聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子 （MBA-PEI） ， 保存在干燥器中。 0011 0012 优选地， 所述聚乙烯亚胺分子量为 423Da-1800Da。 0013 优选地， 所述聚乙烯亚胺分子量为 800Da。 0014 优选地， 所述步骤 （1） 中反应温度为 25-100 C 0015 优选地， 所述步骤 （1） 中反应温度为 50。 0016 为了解决现有技术中的这些问题， 本发明第二方面提供的技术。
12、方案是 ： 提供上述 的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体， 如下化学式 I ： 0017 0018 其中， X 为 6-210 ； Y 为 6-210。 0019 为了解决现有技术中的这些问题， 本发明第三方面提供的技术方案是 ： 具有高缓 冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体在基因治疗中的应用。 0020 本发明中，“基因治疗” 是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导 入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用， 从而达到治疗疾病目的的生物医学新 技术。 通过基因传递， 能够将功能基因插入病人细胞， 使其产生校正或调节疾病的特异性蛋 白从而达到基因治疗的目的。通过基因治疗的方法。
13、可以治疗多种严重疾病， 包括 ： 遗传病 （如囊性纤维病等） 、 心血管疾病、 恶性肿瘤、 白血病、 感染性疾病 （如 AIDS、 类风湿等） 。 0021 基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。与病毒载体相比， 非病毒载体由于 说 明 书 CN 103509182 A 4 3/6 页 5 其安全、 低毒、 低免疫原性等特点备受青睐 ； 同时， 能够有效利用内涵体和溶酶体中的酸性 环境避免降解的载体往往表现出较好的转染效率。因为其自身潜在的质子海绵效应。本发 明制备的基于聚乙烯亚胺的基因载体具有很高的缓冲能力， 当复合物被细胞摄取， 能够有 效的结合内涵体中的质子， 使得内涵体膨胀、 破裂，。
14、 将复合物释放到细胞质中。然后复合物 再克服其它屏障进入宿主细胞的细胞核表达。 0022 本发明的基于聚乙烯亚胺的高效低毒的水溶性阳离子高分子基因载体， 能够有效 地与 DNA 通过静电相互作用形成聚电解质复合物， 由于该类型的阳离子高分子中富含伯 胺、 仲胺和叔胺， 在 pH5-7 之间具有极强的缓冲能力， 能够有效质子化， 致使内涵体发生渗 透性膨胀而破裂， 释放聚电解质复合物， 而复合物中的阳离子聚合物一方面包裹 DNA 使之 不被溶酶体内的水解酶降解 ； 另一方面其 “质子海绵样吸附作用” 可抑制内涵体内的酸化， 可能从而抑制了水解酶， 而酶的抑制可能到聚合复合物在水解酶发生作用前被释。
15、放出来， 从而提高了转染效率。 0023 相对于现有技术中的方案， 本发明的优点是 ： 0024 1本发明的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的阳离子高分子基因载体， DNA 可以 通过静电相互作用与阳离子高分子形成聚电解质复合物， 聚合物结构中含有的大量叔胺基 团有助于提高聚合物的缓冲能力， 有利于复合物实现内涵体逃逸， 并表达相关蛋白。 该阳离 子具有良好的生物相容性， 同时具有高的转染效率， 在某些质量比条件下， 其转染效率要高 于枝化的聚乙烯亚胺 （Mw=25KDa） 。 0025 2. 本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法， 通过迈克尔加 成的方法， 一步反应制备阳离子高。
16、分子， 方法简便， 成本低， 利于量产。 附图说明 0026 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 ： 0027 图 1 是制备本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的化学反应式。 0028 图 2 是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的缓冲能力示意图。 0029 图 3 是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体在 293T 细胞中的细胞 毒性对比图。 0030 图4是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与DNA结合后的凝胶电 泳图。 0031 图 5 是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与 DNA 结合后的电势 图。 0032 图6是本发明具有高缓。
17、冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与DNA结合后的扫描电 镜图。 0033 图 7 是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体介导 pEGFP-N1 转染 293T 细胞的荧光图片。 0034 图 8 是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体介导 pEGFP-N1 转染 293T 细胞的流式细胞仪分析。 具体实施方式 说 明 书 CN 103509182 A 5 4/6 页 6 0035 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解， 这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。 实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中。
18、的条件。 0036 以下将以举例形式进行说明， 如有未详尽之处， 可以参见常用的实验手册， 如 分 子克隆实验手册 以及所用试剂和仪器的厂商说明书。聚乙烯亚胺和 N,N- 亚甲基双丙烯酰 胺购自 Sigma-Aldrich ； 甲醇购自国药集团化学试剂有限公司， 细胞培养基、 胰酶、 胎牛血 清购于 GIBCO。293T 细胞购自中国典型培养物保藏中心 （武汉） 。1H NMR 用 Varian 400MHz 型核磁共振波谱仪测定， 以 D2O 为溶剂， TMS 为内标 ； WST 细胞增殖毒性分析试剂盒 （WST-1 cell proliferation assay kit） 购于中国碧云天。
19、生物技术有限公司， 用酶标仪 （Biotek Elx 800 Microplate Reader， Biotek）检测 ； 电势用马尔文粒度仪 （ZEN3600-nanoZS， Malvern） 检测 ； 扫描电镜 （SEM） 用 FEI Quanta400 检测 ； GFP 表达用激光共聚焦荧光显微镜 （Nikon A1） 和流式细胞仪 （BD FACSAriaTM ） 检测。 0037 本发明提供一种聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载体， 通过 静电相互作用与带负电荷的 DNA 分子形成聚电解质复合物， 复合物中的阳离子聚合物一方 面包裹 DNA 使之不被核酸酶降解 ； 。
20、另一方面其 “质子海绵作用” 可有效帮助复合物实现内涵 体逃逸， 释放的 DNA 进入细胞核表达相关蛋白质， 实现基因治疗。 0038 实施例 1 基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法 0039 通过迈克尔加成的方法， 一步制备聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分 子基因载体。 0040 称取 4g 聚乙烯亚胺 （Mw 800Da） 溶于 20mL 无水甲醇中， 然后加入 0.77g 的 N,N- 亚 甲基双丙烯酰胺， 通往氩气保护， 50反应过夜。 将反应液置于RC即用型透析袋 （Mw 3500） 中， 用超纯水透析五天， 冻干得到黄色油状固体， 即为制备的聚乙烯亚胺 - 亚甲基。
21、双丙烯酰 胺聚阳离子高分子 （MBA-PEI） ， 保存在干燥器中。其合成示意图如图 1 所示。 0041 实施例 2 制备的聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子具有高的缓冲 能力， 能够帮助 DNA 实现内涵体逃逸， 提高转染效率。 0042 分子量为 800Da 和 25KDa 的 PEI 和 MBA-PEI 的缓冲能力通过酸碱滴定来检测。依 据Benns报道的方法， 分别称取6mg的分子量为800Da和25KDa的PEI和MBA-PEI溶于30mL 150mM NaCl， 配制成 0.2mg/mL 溶液。首先将溶液用 NaOH 溶液 (0.1M) 调至 pH 为 10， 然后 。
22、用 0.1M 盐酸滴定到 pH 值为 3。以 pH 值对加入的盐酸的体积作图。如图 2 所示， 该聚合物 在 pH 5-7 之间出现了一个明显的缓冲平台， 缓冲性能与 PEI 25KDa 相当， 充分说明了他具 有与 PEI 25KDa 类似的质子海绵效应， 能够有效地帮助复合物实现内涵体逃逸。 0043 实施例 3 细胞毒性对比实验 0044 用WST法来测定PEI 800Da、 PEI 25KDa和MBA-PEI在293T细胞中的细胞毒性。 在 96 孔板中以每孔 8000 细胞的密度种入 293T 细胞悬液 100L， 将 96 孔板置于 CO2 培养箱 中， 在 37 C 中培养 24。
23、h。将 PEI 800Da、 PEI 25KDa 和 MBA-PEI 分别溶于完全培养基中， 过 滤除菌， 用完全培养基将聚合物溶液稀释成不同的浓度。然后再将不同浓度的聚合物溶液 加入到 96 孔板中， 每孔加 100L， 对照组加入 100L 完全培养基， 继续培养 24h。最后移 出培养基， 每孔加入 100L 新鲜培养基， 然后每孔加入 10L WST， 置于培养箱中培养 2h， 用酶标仪测定 450nm 处的吸收值 OD450nm。每个高分子浓度及对照组做 4 个平行样。根据 说 明 书 CN 103509182 A 6 5/6 页 7 吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及聚。
24、合物溶液， 对照组即不加聚合物溶 液。 0045 细胞相对存活率 (%)=100( 实验组 OD- 空白组 OD)/( 对照组 OD- 空白组 OD) 0046 如图 3 所示， 所合成的聚合物与 PEI 800Da 相比， 由于分子量的提高， 其细胞毒性 要明显高于 PEI 800Da， 但是要低于 PEI 25KDa。说明制备的聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰 胺聚阳离子高分子具有较低的细胞毒性。 0047 实施例4 聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子与DNA的相互作用能力 测试。 0048 聚合物能否有效的结合DNA， 是基因传递过程中的一个重要因素。 聚合物与DNA形 成较为紧密。
25、的复合物， 能够保护 DNA 不被细胞中的酶消化。具体分为三部分 ： 包括凝胶电 泳， zeta 电位以及 MBA-PEI 与 DNA 形成复合物的扫描电镜检测。 0049 4.1 凝胶电泳检测 ： 0050 制备不同重量比的 MBA-PEI/DNA 复合物， w/w 为 0.5/1， 2/1， 5/1， 8/1， 12/1， 15/1。 涡旋5s后室温放置30min， 然后将制备好的复合物与Loading buffer以及SYB Green混合 后， 加入到 0.7%(w/v) 琼脂糖凝胶中进行电泳实验。电泳条件为 80V 下 80min， 然后在凝胶 成像系统中观察。如图 4 所示， 在实。
26、验条件下， 所有 DNA 均滞留在孔中， 说明聚合物能够很 好的结合 DNA。 0051 4.2 Zeta 电位检测 ： 0052 MBA-PEI/DNA 复合物的粒径和电位使用 Nano-ZS 在 25 C 时测定。1gDNA 和适 量的聚合物溶液制备不同w/w的MBA-PEI/pEGFP-N1复合物。 混匀后， 在室温放置30min， 然 后将复合物溶液用超纯水稀释到 1mL 来测定复合物的电势。如图 5 所示， MBA-PEI/DNA 复 合物在电位 33mV 左右达到平衡。 0053 4.3 MBA-PEI 与 DNA 形成复合物的扫描电镜检测 ： 0054 用扫描电镜 （FEI Qu。
27、anta 400） 来观察复合物的形态。1g DNA 和适量的聚合物 溶液制备 w/w=5 的 MBA-PEI/pEGFP-N1 复合物， 涡旋 5s 后室温静置 30min， 然后将溶液滴加 到玻璃片上， 放在干燥器中过夜， 使其干燥用于扫描电镜分析。 如图6所示， MBA-PEI/DNA复 合物的粒径大小为 20-30nm 左右 0055 实施例 5 聚乙烯亚胺 - 亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子介导 pEGFP-N1 转染 293T 细胞的能力检测。 0056 具体分为二部分检测， 包括共聚焦显微镜定性观察 MBA-PEI 介导 pEGFP-N1 转染 293T细胞表达的绿色荧光蛋白和流。
28、式细胞仪定量分析MBA-PEI介导pEGFP-N1转染293T细 胞的结果。 0057 用 293T 细胞来检测聚合物 MBA-PEI 介导 pEGFP-N1 转染细胞过程。293T 细胞使用 含有 10%FBS 的培养基在 5%CO2 培养箱中 37培养。将 293T 细胞以 80000 细胞 / 孔的密度 接种至 24 孔细胞培养板中， 当 24 孔板内细胞的覆盖率达到 80% 左右时即可开始转染实验。 将 1g pEGFP-N1 和聚合物溶液制备成不同 w/w 的复合物溶液 100L， 混匀并静置 30min。 实验时， 移去 24 孔板内的培养基， 加入 900L 的 OPTI-MEM。
29、 培养基， 再将 100L 复合物溶 液加入到 24 孔板中， 培养 4h 后移去培养基， 换成 1mL 完全培养基。继续培养 48h。用共聚 焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达。如图 7 所示， MBA-PEI 能够有效介导 pEGFP-N1 转染 293T 说 明 书 CN 103509182 A 7 6/6 页 8 细胞， 在视野范围内可以看到大量的绿色荧光蛋白表达。 0058 共聚焦观察结束后， 用流式细胞仪定量分析绿色荧光蛋白表达。首先， 移除 24 孔 板中的培养基， 加入 200L 0.25% 胰蛋白酶消化， 然后加入 500L 完全培养基中止消化， 用移液枪将细胞分散后转入Ep管中，。
30、 2500rpm离心5min,弃上清， 加入PBS重悬， 再2500rpm 离心 5min, 弃上清， 如此重复三次后， 加入 800L 0.5mM EDTA 的 PBS 溶液重悬， 准备上机 检测。细胞的转染实验均做两个平行样本， 且重复二次以上。如图 8 所示， PEI 25KDa 的转 染效率在 20% 左右， MBA-PEI 在 w/w=2 时， 具有最高的转染效率 （22%） ， 随着重量比的增加， 其细胞毒性也有所增加， 抑制了其转染。 0059 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103509182 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103509182 A 9 2/4 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103509182 A 10 3/4 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103509182 A 11 4/4 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103509182 A 12 。