核酸分析的探针 本发明属于与核酸杂交的探针类。这种探针用于特异基因、基因节段、RNA分子和其它核酸的鉴定方法中。这些方法主要用于临床例如检测组织、血样和尿样，食品工程，农业和生物学研究。
【发明背景】
与核酸(NA)，我们指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，杂交的探针用于确定混合物中特异靶序列(TS)的存在。Gillespie和Spiegelman(分子生物学杂志，12,829,1956)首次描述了传统的杂交方法，其使用的探针基于报告基团(RG)(通常为放射性同位素)与寡脱氧核糖核苷酸组装，通常包括以下步骤：待测核酸固定在纸上、玻璃珠或塑料表面；添加过量与靶序列互补的探针；探针杂交；除去未杂交探针；检测保留的与固定靶序列结合的探针。
未杂交探针通过彻底清洗除去。这通常是这一程序最耗时间和最关键的步骤。因为不能分辨未杂交探针和杂交探针的性质，所以必须实质上除去所有未杂交探针。因为杂交探针只通过与靶序列的相互作用与其附着，所以杂交探针也可能在清洗中除去，以及清洗除去一些与未充分固定的TS结合的杂交探针的杂交体。另外，一些探针可以直接与载体表面粘附而升高了背景信号。最后，必须除去未杂交探针的需要使得体内检测和实时检测不可能。
曾报道过一些称为同源探针技术的方法不必除去未杂交探针即可确定杂交。
Bannwarth等(Helvetica Chimica Acta,71,2085,1988)研究了一种使用钌复合物与寡脱氧核苷酸组装形成探针的方法，通过测定探针地荧光衰期确定杂交。虽然方案很好，但它的应用限于装备精良的专业实验室并且仅能由受过专业训练的人使用。而且，该方法分辨杂交和未杂交探针的能力不是特别好，特别是在可能包含影响探针荧光衰期的成分的生物样品中。
Barton J.等(美国专利，5.157.032)描述了一种探针包括用金属配基复合物修饰的DNA链，其荧光强度杂交后增强。这些探针在杂交后仅获得中度荧光(报道的荧光量为0.007,Jenkins和Barton，美国化学学会杂志，114,8736,1992)，其灵敏度较低。而且，探针是二价阳离子(带+2价电荷)，导致形成显著的非特异相互作用从而降低了分辨不同序列的能力。
Yamana等(核苷酸和核酸，11(2-4),383,1992)描述了一种由用芘修饰的的寡核苷酸构成的探针，其在优化条件下杂交后荧光强度增加20倍。该方法由几个不利之处。芘具有复杂的光物理性质，其吸收性质和荧光性质依赖于其周围环境；例如，它有很高倾向形成受激准分子(MichlJ.和Erik W.,Thulstrup in Spectroscopy with polarized light，第一版，VCH,1986,ISBN 0-89573-346-3)。而且，芘释放紫外光(450nm以下)不能用裸眼看到。另外，芘还有毒(Yoshikawa等，Vet.Hum.Toxicol.29,25,1987)。
Linn等(EP 0710668 A2,US 5597696)和Ishiguro等(核酸研究，24,4992,1996)描述的探针包括寡核苷酸和不对称花青染料。这些探针的荧光性质例如荧光偏振，荧光衰期和荧光强度在杂交后改变。这种探针有几个缺点和限制。荧光偏振和荧光衰期的测定需要精密和昂贵的设备，且必须由受专业训练的人操作。荧光强度的改变中等(报道优选条件下增加4倍)，使得探针对背景信号非常敏感，特别在需要过量探针情况下。
Heller等(EPA 070685)和Cardullo等(美国自然科学院进展，85,8790-8794,1988)描述了一种探针基于两个DNA探针与连续(close-lying)序列同时杂交。一个探针在DNA链的3’末端连接供体荧光团，另一个探针在5’末端连接受体荧光团。当它们接近时荧光能量由供体荧光团转移给受体荧光团，这可以检测出来。荧光团在溶液中分开很远，但是当探针与TS杂交一个探针的3’末端紧靠另一个探针的5’末端结合使这两个荧光团接近。该方法有几个不利。必须区别不同波长的荧光强度，因为杂交不会明显升高总荧光强度，而仅改变荧光波长。该系统不适于TS的定量测定，因为荧光转移效能依赖以下因素例如荧光团之间的距离和它们的相对取向(Forster,物理分析，2:55-75,1948)，其也可能依赖于探针序列。该方法存在背景荧光的基本问题，因为激发供体的光某种程度也激发受体，导致非特异背景信号。最后，两个探针同时与靶序列结合的需要导致缓慢杂交动力学，使得该方法不适于实时检测。
Morrison(EPA87300195.2；US.Pat.4822733；生物化学分析，183,231-244,1989；生物化学，32,3095-3104,1993)描述了另一种基于一对寡核苷酸的方法。这些寡核苷酸彼此互补，也与靶序列双链互补。双链3’末端均有荧光团，5’末端均有猝灭剂。当它们彼此成对5’末端的猝灭剂立即与3’末端的荧光团靠近猝灭荧光团的荧光。然而，如果探针与TS结合就能观察到荧光。这一方法存在两个对立的设计问题：需要较高的探针浓度获得较快的杂交动力学，但同时需要较低的探针浓度以减小不与TS结合或也不与互补探针结合的游离探针的背景发光。使用探针时首先加热样品以分离探针分子和双链核苷酸，然后降低温度使探针与TS杂交。然而未杂交探针必须找到互补探针实现猝灭，直到完全升高到与TS杂交探针的信号。既然探针常过量使用，所以必须考虑背景落入可接受水平前的时间，使得该方法不适于实时检测。最后，这些探针仅用于双链TS。
Tyagi S.(PCT-WO 9513399；自然生物工程，14,303-307,1989)描述了基于一种两端分别有一个发色团的探针的分子信标(molecularbeacons)。选择这样两个发色团当它们靠近时一个发色团能够猝灭另一个发色团的荧光。探针设计为溶液中能形成二级结构使探针的两个末端靠近，产生荧光猝灭。这种结构的需要是该探针的第一个限制，因为它必须包含产生特别二级结构的序列。因为探针不仅与预先设计去识别的序列互补，还与其它序列互补，那就是说，探针对一种TS永远不是唯一的。进一步的不利是探针的应用限于狭窄的温度范围，因为探针与TS的杂交以及游离探针的二级结构都需要稳定的温度。例如TS不与互补NA杂交的温度不能使用。而且，室温下已经明显的热运动降低了猝灭效能，故常须使用甚至更低的探针操作温度，这又降低了探针反应特异性。
本发明的一个目的是克服上述传统方法以及目前同类方法的缺点。
本发明进一步的目的在于：
不需要预处理样品，例如降解成较小的片段；
探针与靶序列杂交产生信号测定靶序列，而未杂交状态产生的信号非常小，优选可忽略；
探测可以在均相溶液中；
可以迅速测定杂交，不需延迟；
NA的量可以实时定量测定；
可以确定含活性酶例如核酸酶和蛋白酶样品中的特异NA序列；
可以确定体内特异NA的存在；
可以用简易设备确定特异NA的存在；
可以有选择地确定任意序列的存在；
可以在较宽的范围内探测；
使用本发明的人不需要接触有害化学品；
使用探针的人不需要特别训练或有特殊经验。
为在诊断和研究中充分利用杂交方法的所有潜力，必须有方法检测使用探针溶液中的杂交，该探针自身产生较低或可忽略的信号，但在与靶序列杂交后能产生可观察到的反应。探针也需要能体内使用而不会对组织和细胞产生有害作用。还需要实时检测。当然，也应该可以在传统杂交中使用该探针。还需要探针产生的信号可以由裸眼观察到。本发明在合理的程度上实现了这些需要。
【附图说明】
图1．本发明的图示。SRE：与靶序列(TS)特异结合的序列识别单元；RG：杂交后产生信号的报告基团；接头：连接SRE和RG。
图2．RG的后结合。如果SRE与天然核酸太相似，RG会折回与它相互作用从而产生信号。探针“捷径(short cut)”。
图3．探针设计和探测方法。A)识别单链TS的NAA基探针。RG既可以与NAA/NA双重结合也可以与靠近TS的单链NA区结合。B)识别双链TS的NAA基探针，即可以与TS形成NAA：双链NA三链体，也可以经过链置换形成NAA2:NA三链体。C)识别单链TS的肽基探针。D)识别双链TS的肽基探针。
图4．在探针中具有合适性质用作RG的的化合物与NA和一些NAA:S相互作用的比较。加入到单链NAA:S、PNA、甲基磷酸盐和硫代磷酸、以及单链NA(DNA型)中BO的荧光。无电荷的NAA:S、PNA和甲基磷酸盐观察到非常低的荧光。NAA/NA有同样的碱基组成，它们的浓度为0.1mM。
图5．在使用PNA时一些不对称花青染料的发光比较。染料TO基本上完全不发光。来自分子探针公司的染料Picogreen(未提供结构分子式)和染料BO有同样低的发光。同样来自分子探针公司的染料Oligreen(未提供结构分子式)荧光最高。PNA序列为(H)-TTCTTCTTTT-(NH2)，染料浓度约为0.1mM(Oligreen和Picogreen的浓度仅是近似值，因为分子探针公司未提供)。
图6．用探测单链NA的替换方法。NAA-RG探针和寡核苷酸同时杂交到单链TS的连续部分，寡核苷酸形成RG可以结合的双重体。
图7．TO-5-S的合成。
图8．按照图3A的设计探针杂交后荧光强度的增加。探针PP10-CTT-TO与单链DNA的杂交。(a)荧光发散光谱，(b)游离探针，存在过量5倍非互补单链DNA时的探针，和存在TS时的探针的荧光强度。
图9．游离的和杂交的探针吸收光谱。游离染料区的吸收光谱和与TS杂交的探针PP10-CTT-TO染料区的吸收光谱(400-600nm)。杂交后染料光谱向长波方向移动并且总强度降低。这些改变可以用于监测均相溶液中的杂交。
图10．按照图6的设计与TS杂交后探针荧光的增加。
图11．按照图6设计的杂交复合物的特征。最上的实线(无标记)：260nm吸收值随温度的变化。有标记虚线(Dashed line)为杂交探针的荧光。有标记点线(Dotted line)为游离探针的背景荧光。有标记实线为杂交探针荧光和游离探针荧光的比例(正确比例显示)。
图12．不对称花青染料与各种NAs的相互作用。上：与各种双链和单链NA:s结合的TO的亲合常数对数值随离子强度对数值的变化。对多聚嘧啶的亲和力明显低于对其它所有多聚物的亲和力。数据显示染料对NA:s的亲和力随离子强度对数值对数减小。下：与各种NA:s结合的TO的性质概要表。可以认为有两种结合方式。Ⅰ：对所有双链NA和多聚嘌呤观察到有高度亲合力、高荧光和长波吸收的特征。Ⅱ：对多聚嘧啶观察到有低亲和力、低荧光和短波吸收的特征。
图13．杂交的直接观察。包含探针PP10-CTT-TO的样品照片，其中(左)存在非互补NS和包含TS的NS。样品用紫外发生灯从下照射，用标准相机拍照，未使用滤光镜。
图14．BO-2-O的合成。
图15．固相合成的探针PP15-TGT-TO的A)高效液相，B)质谱
图16．按照图3D的设计使用探针EcoRⅠ探测。A：游离探针的荧光(a)，包含EcoRⅠ识别序列的双链NA存在时探针的荧光(b)，存在非互补双链NA时探针的荧光(c)，使用的条件：(a)0.5μM探针；(b)0.5μM探针和0.5μM双链DNA分子；(c)0.5μM探针和0.5μM多聚(dAdT)：多聚(dAdT)。B：存在同样NA时不与SRE结合的同样染料的荧光。游离BO的荧光(a)，存在双链NA时BO的荧光(b)，存在多聚(dAdT)：多聚(dAdT)时BO的荧光(c)。条件：a)0.5μM BO；(b)0.5μM BO和0.5μM双链DNA；(c)0.5μM探针和0.5μM多聚(dAdT)：多聚(dAdT)。
图17．配位剂的作用。存在各种浓度杯芳烃(calixarene)时游离探针PP15-GAT-BO的荧光。在添加中等浓度(0.25g/L)杯芳烃时背景荧光几乎降低6倍。
图18．NAA探针和NA探针的比较。游离PNA-TO探针PP8-GCT-TO和NA-TO探针PD8-GCT-TO的荧光，以及温度为15、20和25℃，包含TS的NA存在时同样探针的荧光。实验条件为20mM,pH8.5的硼酸盐缓冲液和500mM氯化钠。
图19最末端碱基的影响。RG附着末端有不同碱基的NAA-RG探针(上)和NA-RG探针(下)的背景荧光。NAA-RG数据是PNA探针获得的测量均值。每一类型的探针以不同的序列(只限于最后两个碱基)、电荷、接头、RG(TO或BO)且在不同温度、pH和离子强度下进行测定。然而，在适当的范围内，这些指标对背景信号的影响与最末端碱基对背景信号的影响相比小得多。末端为..CT-RG和..TT-RG的NAA探针背景信号最小。待测NA探针一样，除了最后两个碱基(PD11-CXX-TO)并在同样条件下(25℃,10mM Tris缓冲液，pH7.5,1mM EDTA,10mM氯化钠)有同样特征。同样..CT-RT的背景信号最低。这两张图的数据无可比性，因为具有不同的比例并且使用了不同的条件。
图20选择TS的方法。最靠近RG的末端碱基在杂交状态应该与那些对RG亲和力最低和/或使RG产生最低信号的碱基互补(a)，并且它应该靠近位点(b)，或与探针产生位点(b’)，其在杂交状态靠近RG,RG对它亲和力较高，与它结合后RG产生强烈的信号。
图21对特异突变敏感的探针举例。可以设计为对特异突变敏感的各种长度和不同变化的重叠的TS。选择TS时，应该考虑作为游离探针(a)和杂交复合物(b)时RG可以与之相互作用的序列结构。这种方法可能设计出产生低背景发光，并且在杂交后产生最大信号的探针。
发明概述
本发明涉及一种探针，由通过接头连接的序列识别单元(SRE)和报告基团(RG)组成(图1)。RG是一种化合物，特征为与核酸(NA)结合后具有可观察的性质改变。例如，它游离在溶液中时有极小的发光，当与NA结合时产生强烈发光。SRE是一种与NA特异结合的序列分子，特征为具有使其与RG相互作用最小化的结构，或与RG产生最小地影响RG的信号特征的相互作用。它可以是NA，其与RG附着的末端的碱基为对RG有最低亲和力的碱基，或以最小影响RG信号特征的方式与RG相互作用的碱基。SRE结构也可以与NA:S不同。它可以是寡脱氧核苷酸类似物(NAA)，其具有修饰或替换的骨架，非天然糖倍分，不同的构型和/或不同的立体化学。它也可以是与核酸特异结合的肽或蛋白。最重要的是当RG与SRE连接时，彼此的相互作用和杂交后RG与靶序列的相互作用实质上不同。
本发明的探针在与TS结合后显示可观察到的性质(也称为信号特性)的不同并能用于均相分析，即不必除去未杂交探针即可检测特异NA的存在。本发明的探针还可用于探针固定的分析，例如，束缚在表面，本发明的探针具有清洗除去未杂交探针的步骤不再重要的优点。
本发明的探针可以识别单链(ss)NA和双链(ds)NA的TS。
本发明的探针与ssNA形成的复合物比与dsNA形成的复合物更稳定，也可以在时dsNA链分离的温度下用探测dsNA。
本发明的探针具有用作培养细胞以及整个器官的体内探针的潜能，这是比传统抗酶NA探针具有的优势。
本发明的探针可以按照TS的数量成比例地升高信号，可以用于样品中特异NA的定量。它可以用于确定，例如，复杂混合物中特异PCR产物的数量。它也可能确定特异RNA例如细胞提取物中的RNA数量或两种基因的相对浓度。例如，可以使用后者跟踪癌症发展。
本发明杂交后立即产生信号可以即时确定特异NA的数量。这就可能即时跟踪例如PCR反应，体外转录等。它也可能即时监测细胞内特异NA的数量变化，例如，跟踪染色体或质粒复制或特异RNA的产生。
本发明也能用于监测突变。可以构建对完全互补序列比对一个或一些碱基改变的序列更有效的探针。
本发明推测可以用于通过荧光原位杂交(FISH)技术定位染色体中的特异序列。同样本发明探针比传统FISH探针的有利之处在于杂交后荧光增强。为获得足够信号的强度，需要几个探针与靶序列杂交和/或组装许多RG。
本发明可以用于，例如
通过检测对外源生物体的特异序列鉴定病人的感染原(病毒、细菌、寄生虫等)，
通过检测个体的遗传物质鉴定是否有形成疾病的倾向或增加的风险，
孕期诊断，发现胚胎期和胎儿成长期的遗传缺陷，并预告例如与分娩有关的并发症，
个体检测例如亲源检测，法医鉴定等，
检测基因工程实验结果，例如克隆、转染、基因剔除等。
发明详述和其优选实施例
如标题所示，本发明涉及鉴定和定量包含特异靶序列(TS)的核酸(NA)的探针。与传统方法相比，本发明可以用于均相探测，即不必除去未杂交探针即可检测TS的存在。与已知的均相探测方法相比，本发明至少有下述之一的优点：高灵敏度、高准确性、和快速检测。
本发明是由相连的序列识别单元(SRE)和报告基团(RG)构成的探针(图1)。
以前基于SRE-RG模式的探针存在高背景信号的问题。当RG为荧光原(fluorefore)，游离探针具有显著的背景发光，与TS杂交后荧光强度增加中等(不到4倍，EP0710 668 A2；Ishiguro等，核酸研究，24,4992,1996)。强的背景信号基本上由于RG折回到SRE并与之相互作用(图2)。以前探针存在这种问题的原因在于基于NA的SRE，其序列结构未经优化以最小化来自RG的信号。既然RG是对NA有亲合性的分子(必须如此，否则它不会杂交后与TS结合)，故任何NA探针有很大倾向回折与SRE相互作用，除非预先采取措施。对RG为阳离子的探针，这是一个特别重要的问题，事实上所有以前这类探针均如此(EP0710668；US 5157032；Ishiguro等，核酸研究，24,4992,1996)，因为RG与NA静电相吸。
上述问题对所有NA-RG探针普遍存在，无论它们的荧光性质如何。它可能是电磁辐射相互作用，当测量稳定状态或定时模式吸收或发光(荧光、磷光)变化，或NMR反应、氧化还原电位，电导率、反应性等的变化时。在所有情况下，未优化序列的NA探针都存在RG的回折结合，产生不必要的背景信号。
本发明描述了SRE-RG探针，其RG回折与SRE结合升高背景信号的问题被最小化了。本发明也描述了如何优化探针序列和探测方法以改进探针可观察的性质的变化。最后，还描述了一种与TS结合后显示比相应NA-RG探针更强信号的SRE-RG探针。
序列识别单元
本发明探针特征为SRE单元具有或者能最小化与RG相互作用，或者与RG相互作用后产生最小信号特征变化的结构(化学结构或序列结构或两者共有)。SRE可以为RG附着末端有特异碱基的NA，或者SRE与天然NA化学和/或结构不同。它可以是一种与天然NA不同的核酸类似物(NAA)(此处与寡核苷酸类似物等同)，但通过核苷酸碱基间专属配对识别它们。它也可以是与NA序列特异结合的肽(图3)，它可以是肽和NAA的组合，在合适设计中，它也可以是多肽和NA的组合。它还可以是与NA序列特异结合的有机合成分子。
在优选的实施方案中，SRE是NAA。对NAA，我们指线形高分子，由含核苷酸碱基单元构成，但由于具有修饰或替换的磷酸二酯骨架、或者具有修饰或替换的糖配基、或者具有不同立体化学而与天然NA不同，但是通过碱基对形成与NA序列特异性相互作用。NAA必须与NA足够不同以至它与RG相互作用本质上不同。因此，NA衍生物(即NA的一个或几个氢原子由其他基团取代)，例如那些今天可以用市售寡核苷酸合成器合成的NA衍生物，不能期望达到足够的不同。
当SRE完全由NAA构件构成，可以期望最小化回折结合。然而设计出的RG不能回折与NA段相互作用的NA/NAA混合聚合物也会有效。例如，在主要包含NA的混合多聚物中有策略地安排NAA位置以阻断RG的回折。事实上，如果合适选择NAA的位置即NAA安置在NAA/NA共聚物的末端可以有效地阻断RG的回折。以下的NAA探针我们也指具有基于至少有一个NAA段，且RG与NAA段附着的NAA-NA复合多聚物的SRE的探针。所有SRE中的NAA段必须不一样。SRE也可以是NAA:S、NAA:S和NA、以及NAA衍生物(NAA的一个或几个氢原子被取代)的混合聚合物。
一些可得的NAA已经得以应用，在反义治疗和反基固(antigene)治疗的非相关领域具有有用潜能的新的NAA正在得以发展(Nielsen，生物物理与生物分子结构年度综述，24,167,1995；De Mesmaeker等，结构生物学新观点，5,343,1995)。NAA的实例是那些具有改变的磷酸二酯键(硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硼酸磷酸酯、氨基磷酸酯、硒基磷酸酯、磷酸三酯等)，是那些具有非天然糖部份(均DNA、那些带有碳环环系统、二环-DNA等结构)，磷酸二酯类似物(烃类、醚类、硫醚、胺类、酮类、甲基乙缩醛、硫甲基乙缩醛、酰胺、氨基甲酸酯、脲、羟胺、氨基磺酸酯、硫酰胺、甘氨酰胺、砜等)，是那些具有完全替换骨架(二环核糖乙缩醛类似物、吗啉衍生物、肽核酸(PNA))，是那些具有2’,5’连接的寡核苷酸，和那些有α-核苷酸异头物的。
通常NAA是化学上与NA不同，以至于结构和静电引力(至少电荷分布)与NA不同，因此可能与感兴趣的用作RG的化合物不同地作用。图4中以化合物BO为例。BO自身基本上无发光，与NA结合后强烈发光。在SRE-RG探针中有用的RG应不与SRE产生以增强发光的方式相互作用。象在图4中看到的BO，在存在无电荷NAA、PNA和甲基磷酸盐时具有明显较低的发光。存在硫代磷酸酯时它具有与单链NA基本一样的发光。这说明用NAA取代NA的探针可以减小来自RG的信号。但也说明不是任何NAA都可以。最有效的NAA还依赖RG是什麽。例如，如果RG是阳离子，例如BO，无电荷和阳离子NAA最为有效。通常，由于RG不能对NA亲和力太低(它必须在杂交时结合)，总有RG对其亲和力较低的NAA。如果NAA用作探针的SRE，该探针将产生比相应NA-RG探针低的背景发光。
由于静电斥力，小分子阴离子通常不与NA结合，而正电荷分子对NA有较强的亲和力。因此用作RG的感兴趣的大多数分子是阳离子，偶尔为电中性，很少为阴离子。因此不带电荷的NAA，例如PNA、甲基磷酸酯、吗啉衍生物、和一些磷酸二酯类似物用作本发明的SRE引起特别关注，因为它们不会静电吸引阳离子RG，并应该显示比基于NA的SRE的更小的回折结合。关注的也是带一些正电荷的NAA，例如通过一些残基修饰，或添加正电荷取代基在中性NAA中引入正电荷的。无电荷NAA和阳离子NAA的共聚物也是感兴趣的。当然，由于与NA的非特异静电相互作用，所带的正电荷将减小探针的特异性。因此NAA中正电荷的数目不应太高。
性质最优的NAA之一是基于N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元的PNA。这就是在说到的特异PNA是，我们认为的PNA。它与核酸的复合物与双链NA非常不同(Erilksson和Nielsen，天然生物学结构，4,98-101,1997),PNA双链体也是如此(H.Rasmussen等，天然生物学结构，4,98-101,1997)。双链PNA形成右手螺旋和左手螺旋，而PNA:DNA和双链DNA仅形成右手螺旋，双链PNA每回转有18个碱基对，PNA:DNA和双链DNA分别有13个和10个，双链PNA碱基扭曲19.8°,PNA:DNA为28°，双链DNA为34°。因此与单链NA以特别方式相互作用的化合物可能与单链PNA的作用方式显著不同，同样，与双链NA以特别方式相互作用的化合物与PNA:NA杂交物作用也不同。因此，选择的对NA有高亲和力的化合物，期望对PNA有低亲和力，此种情况也适用于大多数其它NAA(图4)。如果化合物用作探针的RG，它应该显示低的回结合(back binding)，如果探针的SRE是由NAA代替NA，则显示较低的背景信号。
当NAA用作探针的SRE时，还有其它优于NA的地方。因为NAA是非天然结构，故它们对酶有抗性，因此NAA探针可以用于细胞提取物和其它具有酶活性的样品。NAA探针还可以与TS形成比NA探针更稳定的杂交体，允许在较高温度下使用探针。
NAA探针杂交后也可以获得比NA探针更高的信号。与单链TS杂交后RG既可以和靠近TS的单链NA区结合，也可以与SRE和TS之间形成的双链区结合(图3A)。如果SRE为NAA，双链NA可以通过双杂交提供给RG(图6)。因此，NAA探针中RG通常可以和象NA探针一样的同种NA结构结合。然而，使用NAA探针，RG也可以与NAA/NA杂交体结合，这可能产生不同的结构，其中RG获得更强的信号。我们已经发现PNA即为此种情况(图18)。产生更强信号的原因尚不清楚，但这可以通过无电荷PNA与NA形成比双链NA更稳定的双链体实现，该双链体更有效地限制了结合的RG的内部移动，从而增强了荧光信号。如果这种假设是正确的，其它一些NAA可能有相似的作用。
本发明的另一个实施方案中，SRE为蛋白或肽。它们在化学上也与核酸非常不同，可以与NA序列特异结合。目前仅知道一些特异核酸结合蛋白序列，但是专属识别TS的多肽的设计方法正得以发展(Choo等，自然，372,642,1994)。RG可以容易地附着于蛋白和肽。(例10)。
本发明的又一个实施方案中SRE是结合肽的NAA,RG或者与肽或者与NAA连接。这种结构有两个优点：通过NAA识别任意序列的能力和RG与肽的最小的相互作用。肽和PNA的结合引起特别关注，因为可以通过同样的固相化学合成和基本上可以容易地合成任意一种共聚物。例如，为促进溶解性和/或排斥带电RG，可以使用带电氨基酸引入电荷(例2)。
本发明的再一个实施方案中，SRE为肽-NA缀合物，而RG附着到位肽。多肽必须设计为阻止RG与NA的相互作用。单一大体积的和带合适电荷的氨基酸(即象RG的电荷)可能足够，虽然通常需要较多的氨基酸残基。
另一个实施方案中，SRE为其在RG附着末端的碱基是那些对RG有单一大体积的最低亲和力和/或以最小影响其信号特征的方式相互作用的碱基的NA。
报告基团
RG是当与SRE连接并与TS结合时发送容易检测信号的分子。这个信号应比无TS存在时与SRE连接的RG的任何信号明显强烈。因为结构不同的NAA数量非常大，就有很多机会寻找到一个不会相互作用，或以不象天然NA一样增加RG可观察特征改变的方式相互作用的NAA。因此，与NA结合后可观察性质改变的所有化合物都可以用作RG并在按照本发明探针中与合适SRE结合。本发明通过与NA杂交后光谱性质改变的RG说明，光谱性质的改变通过总荧光强度的改变测量。在一些例子中，探针杂交后荧光信号增强。当然，这不是本发明的限制。带有与TS结合后信号特征减弱的RG的探针也有用。
用作RG的化合物应该对NA有亲和力，足使得它们在杂交状态结合，但不能太高，因为它可能导致探针与NA的非特异相互作用。大多数配基对NA的亲和力依赖于离子组成和溶液温度(Record等，分子生物学杂志，107,145,1976)，通过几步放大后可以被调整到中等(图12)。适用作本发明的RG，在室温和100mM离子强度下化合物对NA的亲和力应该在0.1到108M-1(-1＜logK＜8)之间。
因为发光检测灵敏度很高，故与NA结合后荧光增加的化合物适于用作RG。与NA结合后发光量应增加至少10倍，优选至少在50倍，更优选至少500倍。已经知道了许多这种化合物。有最大荧光增加的化合物之一是噻唑橙(thiazole orange)(超过5000倍，Rye等，核酸研究，11,2801,1992)。
化合物在溶液中应该游离，即无NA存在时有非常低的发光，否则会增加背景信号。游离化合物发光量应少于0.05，优选少于0.01，更优选少于0.001。
化合物应在UV/VIS区有效吸光。最大吸收时的摩尔吸光系数应至少为1000M-1cm-1，优选至少为10,000M-1cm-1，更优选至少为50,000M-1cm-1。
包括环或多环结构的化合物通常观察到上述性质，其中至少两个通常不超过5个为芳香环，并且可以被连接。环可以是碳环也可以是通常为1-2个N原子的杂环。这一系统中其它的常见杂原子为氧原子和硫原子。环可以用其它基团取代包括：通常有1-4个碳原子的烷基，通常有1-4个碳原子的含氧基团如羟基、烷氧基和羧酯基，通常有0-6个碳原子的氨基基团如单和双取代的氨基基团(通常为单和双烷基氨)，通常有1-4个碳原子烷基硫的含硫基团，氰基，通常有1-7个碳原子的无氧代羰基例如羧基及其衍生物(通常为羧酰胺和羧基烷基)，通常有1-4个碳原子的氧羰基和酰基，通常原子数为9-35的卤素等。
更感兴趣的化合物是那些包含由一个键连接的两个芳环系统，包含例如乙烯基、磷酸基、胺基、酰胺、羰基和羧酸酯，连接于芳香环系统因此具有一定刚性的化合物。这些化合物游离在溶液中通常有较低的发光，由于围绕该键旋转导致激发态无辐射失活。当与核酸结合(通常通过插入或结合于小沟)，由于被固定在结合区平面构型中而不能围绕连接键转动，它们获得增强的荧光。粘性溶液也限制转动，使得具有合适性质的化合物可以检测。(Carlsson等，物理化学杂志，98,10313,1994)。
更为感兴趣的是花青染料(F.M.Hamer,杂环化合物，18卷，‘花青染料和相关化合物’，1964,Wiley和Sons)，例如US4883867；US5312921；US5321130；US5401847；US5410030；US5436134；US5486616所描述的那样，和特别是那些有下列结构的：
其中R1为氢原子或至多6个碳原子的与氮原子非共轭的烷基，其可以由极性残基例如羟基、烷氧基、羰基和氨基取代。X为氧、硫(或硒)、N-R5其中R5是氢原子或小烷基，或CR6R7其中R6和R7是氢原子或烷基。这些例子中第一个环系统分别为苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑和二氢吲哚。另一个芳香环系统可以是单环或双环芳烃，通常为喹啉或吡啶。取代基R2、R3和R4可以同样为氢原子、小烃基、酰胺，或者R2和R4成对，或R3和R4成对，与两个环原子结合构成5元或6元芳环，它可以包含0-2个杂原子例如氧、硫和N-R8，其中R8为烷基。连接两个芳香环系统的次甲基键的n为0、1、或2。这会影响环系统之间的结合距离和程度，因此也影响了吸收波长和发射波长(Griffith，‘有机分子的颜色和组成’，科学出版社，1976)。Y为HC=CH，其位置由A和B的指数给出，A和B为0或1，如果A=0则B=1，反之亦然。当A=0和B=1时，我们指：当A=1以及B=0时和和
其中R1,R2和n同上所述，R9和R10为与氮原子连接的非共轭烷基，其可以由极性残基例如羟基、烷氧基、羧基和氨基取代。
染料的均或杂二聚体也可以用于本发明。
用已建立的方法可以合成这些化合物(Sprague,US2268234,1942；Brooker等，Houbenweyl methoden der organischen chemie,band V/1d,1972；Lee等，血细胞记数，7,508,1986；Lee和Mize,EP0410806,1989)。它们在与核酸结合后发光的大幅度增强是公知的(Lee和Chen,EP 0226272)，用于检测网状细胞(Lee和Chen,US专利4883867)，用于检测血液中的寄生虫(Lee和Mize,US专利4937198)，用于电泳中核酸染色(Quesada等，生物技术，10,616,1991；Methies和Huang，自然，359,167,1992)和用于毛细管电泳中核酸的紫外敏感检测(Schwartz和Uhlfelder，分析化学，64,1737,1992)。这些用多聚阳离子链取代的化合物(Glazer和Benson,US专利5312921；Yue等，US专利5321130)，和这些化合物的杂或均二聚体(Yue和Haugland,US专利5410030)是核酸染色的最常用染料。
本发明特别感兴趣的是我们发明(例5)的不对称染料，它有一个不是非共轭体系的部分的单独羧酸基，可以由固相多肽合成领域公知的偶联剂激活。这种染料可以用固相多肽合成领域已知的方法，例如，‘新生物化学97/98类目和多肽合成手册’所描述的方法，附着于或插入肽和基于肽的NAA，例如PNA。
用来说明本发明的染料为TO和BO，它们由如下的化学结构：
它们已经被合成带有允许液相(例3)或固相(例5)与各种SRE化学附着的各种侧链(例1)。
我们注意到它们的氧类似物(即除了氧原子代替硫原子其余均一样的化合物)，最有可能也有硒类似物有非常类似的性质。
不对称花青染料的亲和力和发光特征依赖于与它们相互作用的NA碱基序列(图12)。它们以非常高的亲和力与双链DNA结合，更可能是插入(Jacobsen等，核酸研究，23,753,1995；Hansen等，核酸研究，24,859,1996)。它们与单链多聚嘌呤结合力较差(＜10倍)，对单链多聚嘧啶结合力更差(约100倍)。染料的荧光特征还依赖于碱基序列。当它们与双链DNA和多聚嘌呤结合时比它们与多聚嘧啶结合时荧光约增强10倍多。也观察到结合染料吸收性质的差异。很明显结合于NA的不对称花青染料的性质很大程度依赖于它们与之相互作用的碱基。
连接于双链NA的分子，因此也很可能与单链NA和NAA结合的分子，主要的相互作用发生于最外的1-3个碱基(Ciepek等，生物分子结构动力学杂志，5,361,1987)。因此可以通过选择最靠近RG附着末端的碱基以最小化NA和NAA探针的背景信号。这些碱基应该是那些对它们RG有最小的亲和力和/或RG与它们以最小影响其信号特征的方式相互作用。
当基于NA或NAA的SRE的末端碱基为..CT-RG或..TT-RG(图19)时，对于不对称花青染料可以获得非常低的背景发光。
其它RG的情况非常不同。例如，小沟粘合剂(minor groovebinder)4’-6，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)与至少三个连续A:T碱基对区域结合后有强烈发光，但与任何其它序列结合后发光明显较低(Jansen等，美国化学协会杂志，115,10527,1993)。因此基于DAPI作SRE的探针应设计为不含有容易和染料结合的一连串三个A:T碱基对。
SRE和RG的缀合
SRE和RG的连接必须有合适的反应基团。一些混合物是可能的。硫醇例如半胱氨酸，可以连接于其它硫醇和烷基化基团例如碘代乙酰胺，各种顺丁烯二酰亚胺，丙烯酸衍生物等。氨基，例如氨末端以及肽中和PNA中的碱性氨基酸残基，可以和异硫氰酸、酰亚胺酯例如琥珀酰亚胺酯、邻苯二甲酰亚胺酯、和磺酰卤化物、乙二醛、醛和酮反应。羧酸例如肽和酸性氨基酸残基的羧基末端可以和氨基，肼衍生物等反应。这些偶联反应本领域已经熟知，并被描述在，例如，‘新生物化学97/98目录和多肽合成手册’和‘荧光探针手册和化合物研究’(第六版，分子探针公司，Richard Haugland编辑)。
构建染料衍生物时重要的是共轭系统不被影响，因为这可能破坏它的光谱特征。通常这意味着反应基团应该被至少一个非共轭单键与芳环体系分开。对上述花青化合物，反应基团可以安排在任何有R基团处，只要它被至少一个sp3-杂化碳与芳环系统分开。当然，RG衍生物不具有干扰偶联反应的侧链或其它的取代基也很重要。
SRE和RG的缀合通过两个不同的方法说明；其一基于溶液化学，其二基于固相化学(例1)。
RG和SRE在水溶液中的用不对称花青染料的琥珀酰亚胺酯和有氨基基团的SRE作例子。例4中，TO的琥珀酰亚胺酯(例3中合成)附着于PNA，例10中BO的琥珀酰亚胺酯附着于蛋白。溶液方法非常普通，当使用合适衍生物可以用于基本上任何RG对任何SRE的附着。
RG和SRE的固相缀合用我们研究出的不对称花青染料的新的羧酸衍生物(例5)附着于有氨基基团的SRE作例子。例6中TO的羧酸衍生物被附着于PNA的固定化SRE，例7中另一个TO的羧酸衍生物被附着于固定化SRE接头缀合物。对SRE来说，固相方法尤感兴趣的是种类肽和PNA，因为染料可以通过与氨基酸残基和PNA碱基同样的程序附着，可以用市售多肽合成器合成完全探针。
接头
接头的主要功能是保持两单元结合在一起，这种结合不会阻碍杂交后RG和TS之间的相互作用。接头可以简单，例如化学单键，但是也可以复杂包含例如功能基团。它也可以设计为阻碍SRE和RG之间的相互作用。我们基于模型研究的结果显示这可以通过使用短和/或刚性接头，和含大基团的接头实现。如果RG带电荷，同种电荷应该引入链以便抑制回结合。
许多链可以通过合适的RG衍生物连接于SRE而构建(图1)。连接之前用附加单元附着于SRE或RG可以构建更复杂的接头(例7)。
可以通过设计接头适度调整探针对NA的亲和力。接头中的负电荷会降低对NA的亲和力，而正电荷会促进更稳定的杂交。如果探针将在较高温度下使用，则后者更为感兴趣。极性基团也可以引入接头以增加探针的溶解性。也可以构建有几个反应基团并且RG附着于其上的链。这种接头也可以有分支。
肽接头在与基于不对称花青染料的RG结合中引起特别关注，因为当附着于肽接头时它们有非常低的发光(图16)。因为PNA由肽化学合成，它能容易地扩展到任一端的氨基酸。事实上，我们使用的一些PNA具有一个或两个赖氨酸附着于RG的相反末端以增加探针的溶解性(例2)。氨基酸还可以引入PNA单元之间。基本上任何种类的肽接头都可以被构建。刚性接头可以做成α-螺旋形式，可以引入电荷，和官能度。当然，具有羧酸侧链的其它基团也可以用固相多肽合成而插入接头(例7)。
肽接头也可以用于RG附着于基于NA的SRE。如果设计适当，肽接头可以阻碍RG与NA碱基的相互作用。
探测方法和设计
单链NA可以使用具有结合单链TS的SRE的探测(图3A和C)。SRE通常为NAA(例2)，但也可以为肽、肽-NAA结合体、NA-NAA混合聚合物、或设计的NA-肽结合体。TS的大小可以改变，依赖于探针的使用系统。例如，为确定不含或仅含一些其它NA的样品(即，例如PCR反应产物)中特异NA的数量，探针可以短至5-6个碱基，使它形成稳定的杂交体和足够的序列特异性。另一方面，当在含过量其它NA，例如存在抗基因组DNA的外源NA的样品中使用探针确定特异NA的存在时，TS必须较长。识别15-40个碱基的探针在大多数情况下都有效，15-20个碱基的长度看起来对大多数人类样品有效。
当确定长链NA片段的存在，例如细菌或病毒基因组，或确定质粒的存在，特别插入的存在时，探针可以设计为对该NA唯一的序列。例如，500个碱基长的NA片段具有500-20+1=481个20个碱基长度的节段，其中所有的节段也许对该NA都是唯一的。从特异性的观点，探针可以设计为识别任何那些片段。当使用NAA和NA探针应该选择杂交状态最靠近RG末端的碱基具有RG对其有最低亲和力和/或在其存在下RG获得最低的信号的TS。对基于不对称花青染料的RG，例如TO和BO,TS应该以..AA或..GA结尾。如果TS靠近该区，或具有探针创造的区域，杂交状态靠近RG也是有利的，对其RG有较高的亲和力，与它结合获得较强的信号(图20)。同样的方法可以用于优化对特异突变敏感的探针的信号反应(图21)。
双链NA可以在一定条件下探测，例如较高温度和较低离子强度，此条件下它的链可以分离，使用有SRE探针，其与NA形成比其与互补NA更稳定的杂交体。这种SRE为，例如，一些不带电荷和阳离子NAA。
天然双链NA可以用带NAA的探针测定，形成序列特异三链体或序列特异D-环作为SRE，或者蛋白或肽，其与双链NA结合作为SRE(例10)，或者蛋白/多肽-NAA/NA合物。
单链NA也可以用按照本发明探针(基于NAA、肽/蛋白、肽-NAA缀合物或肽缀合物)和使用与TS靠近区互补，以便寡核苷酸形成RG可以结合的双重体的寡核苷酸同时杂交而检测(例9)。
双链DNA也可以用识别两条TS链的两个互补探针测定。这一方法阻碍了复性，会产生较大的信号反应。
也可以在探针固定于固体支持物时探测，优选地通过在RG的相反末端链连于SRE。这一方法易于自动化，固定化探针甚至可以再生。
NA固定的样品也可以使用探针检测，象一些传统方法那样。本发明的探针具有清洗以除去非杂交探针的步骤不再关键的优点。
探针可以用两个可以是不同的RG构建，它们结合的可观察性质杂交后改变。探针可以设计为有两个芘的NA探针，象Yamana描述的那样(核酸研究，11(2-4),383,1992)，或者一个荧光团和一个猝灭剂构成，猝灭分子内(Morrison,EPA87300195.2)或分子间(Tyagi,WO 9513399)游离探针相互作用的荧光。本发明探针具有形成较稳定的复合物(允许在双链NA解链温度以上使用探针)和抗核酸酶的优点。特别感兴趣的探针是一个RG为与NA结合后荧光大幅度增加的荧光基团，例如不对称花青染料，另一个RG为猝灭剂。这种设计中，猝灭剂会猝灭游离探针的任何残存荧光，进一步促进了杂交后荧光增强。
也可以有第三种减小游离探针残存荧光的成分存在下进行探测，第三种成分可以是猝灭剂，即，猝灭游离探针RG荧光的分子。猝灭剂可以游离在溶液中，也可以如上所述附着于SRE，或者它也可以附着于与部分SRE互补的另一个NA或NAA。NA/NAA-猝灭剂与游离探针的结合方式应使猝灭剂靠近RG。如果仅部分互补，探针将对TS有过高的亲和力，TS存在时将破坏NA/NAA与猝灭剂的结合。第三种成分也可以为与RG结合的试剂，隔断其与SRE的后结合位置。看起来不同试剂用不同RG最为有效。例如，杯芳烃对TO有很高亲和力，可以用于减小SRE-TO探针的背景发光(例12)。
本发明的探针可以用于同步检测，定量同一样品中几种不同的NA，通过将它们与RG构建产生可分辨的光谱反应。例如，它们也发射不同波长的光。
本发明的探针还可以通过荧光原位杂交(FISH)定位染色体中的序列。本发明的探针优于传统探针之处在于来自非杂交探针的背景信号显著较低。特别关注的是用几个RG组装的探针，例如，附着于分支接头，和附着于其它SRE成分，例如主链，糖部分和NAA的核苷酸碱基。
杂交的检测
探针与TS的结合可以用结合后改变的探针任何可观察的性质监测。因为荧光强度的测量具有高灵敏性和设备相对不贵的优点，通常选择的方法是荧光检测。然而，其它可观察性质的改变也可以被检测。荧光衰期的改变、荧光偏振的改变，以及吸收、NMR反应、导电率等的改变也可以被测量。
基于NAA-RG探针与普通的基于NA-RG探针的比较
本发明的探针与普通探针比较具有优点是通过将按照将本发明的一个NAA-RG探针与具有同样序列和同样RG的NA-RG探针比较得到最好证明。应注意用这种方法我们比较结构特征而于序列无关。比较中我们用PNA作为NAA,TO作为RG。这意味着NA-RG探针基本上与Linn等描述的一致(EP 0710668 A2；US 5597696)，与Ishiguro等描述的非常相似(核酸研究，24,4992,1996)，后者使用的基团是所有基本方面与噻唑橙非常相同的染料噁唑黄，YO。
下列14个例子得以说明：
·PNA基探针比NA基探针背景信号低。
·PNA探针与TS杂交时比NA探针获得更高的信号。
·PNA探针比NA探针的信号反应增强明显更大。
另外，PNA探针比NA探针有下列优势：
·PNA探针可以比NA探针在较高温度下使用，因为它们与TS形成更稳定的复合物。例如，PP8-GCT-TO探针甚至在45℃下信号增加35倍(例11)，该温度下相应的NA探针不会形成双链体。
·PNA探针基本上可以用于任何离子强度，而NA探针的探测对离子强度非常敏感。事实上，例14的对比是在500mM NaCl条件下操作，以便稳定NA-RG探针与TS的结合。
·PNA探针抗核酸酶。
·PNA，而不是NA可以在一定条件下插入双链DNA，与DNA的一条链通过D-环构型形成三链体(Nielsen等，科学，254,1497,1991)。
实施例
例1．合成的RG。染料R1附着方式探针中的应用TO-1-O--(CH2)1-COOH固相-TO-2-O--(CH2)2-COOH固相PP16-GTC-Tob,PP16-GTC-TOcTO-5-O--(CH2)5-COOH固相PP11-TT-TO,PP8-GCT-TO,PP5-GCT-TO,PP15-TGT-TO,PP16-GTC-TOaTO-10-O--(CH2)10-COOH固相-TO-1-S--(CH2)1-CO-O-C4O2NH4溶液-TO-2-S--(CH2)2-CO-O-C4O2NH4溶液-TO-5-S--(CH2)5-CO-O-C4O2NH4溶液PP10-CTT-TO,PD8-GCT-TO,PD10-CTT-TOBO-1-O--(CH2)1-COOH固相-BO-2-O--(CH2)2-COOH固相-BO-10-O--(CH2)10-COOH固相PP15-TGT-BO BO-1-S--(CH2)1-CO-O-C4O2NH4溶液- BO-2-S--(CH2)2-CO-O-C4O2NH4溶液- BO-10-S--(CH2)10-CO-O-C4O2NH4溶液PP10-CTT-BO,PP15-GAT-BO,EcoRⅠR1是包含反应基团的侧链，通过该反应基团RG附着于SRE
实施例2．合成的探针。代号SRE RG接头序列NAA基探针1PP10-CTT-TO PNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-CO--(H)-TTCTTCTTTT-(NH2)PP10-CTT-BO PNA BO--(CH2)10-CO-NH-(CH2)5-CO--(H)-TTCTTCTTTT-(NH2)PP11-TT-TO PNA TO--(CH2)5-CO--(H)-TTCTCGTCGAT-Lys+-(NH2)PP8-GCT-TO PNA TO--(CH2)5-CO--(H)-TCGTCGAT-Lys+-(NH2)PP5-GCT-TO PNA TO--(CH2)5-CO--(H)-TCGAT-Lys+-(NH2)PP15-TGT-TO PNA TO--(CH2)5-CO--(H)-TGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2)PP15-TGT-BO PNA BO--(CH2)10-CO--(H)-TGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2)PP16-GTC-TOa PNA TO--(CH2)5-CO--(H)-CTGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2)PP16-GTC-TOb PNA TO--(CH2)2-CO--(H)-CTGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2)PP16-GTC-TOc PNA TO--(CH2)2-C4N2H8-CH2-CO--2(H)-CTGTACGTCACAACTA-Lys+-Lys+-(NH2) PP15-GAT-BO PNA BO--(CH2)10-CO--(H)-TAGTTGTGACGTACA-(NH2) 肽基探针 EcoRⅠ肽BO--(CH2)10-CO--EcoRⅠ氨基酸序列 NA基探针3 PD8-GCT-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)TCGTCGAT(3’) PD10-CTT-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)TTCTTCTTTT(3’) PD11-CTT-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)TTCTCGTCGAT(3’) PD11-CAT-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)TACTCGTCGAT(3’) PD11-CTC-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)CTCTCGTCGAT(3’) PD11-CCT-TO DNA TO--(CH2)5-CO-NH-(CH2)5-C0--(5’)CTCTCGTCGAT(3’)
1(H)代表游离氨基和(NH2)代表末端羧酰胺。
2刚性接头。
3从Scandinavian基因合成公司购买的带有胺基接头的寡脱氧核苷酸。TO的琥珀酰亚胺酯附着其上，探针用例4中PNA探针一样的程序纯化，除了TFA用0.1M的TEAA(乙酸三乙基铵)代替，pH7.0。
实施例3．噻唑橙的琥珀酰亚胺酯的合成(TO-5-S)
合成包括四步。
N-甲基-2-甲基苯并噻唑鎓对-甲苯磺酸盐(Ⅰ，图7)
对甲苯甲磺酸盐(3.5g,18.8mole)缓慢地加入2.1g(14.0mole)2-甲基苯并噻唑的乙醇液(10ml)。混合物回流三小时，然后室温搅拌15小时。蒸发溶剂，产物在甲醇/丙酮中重结晶。
产率：4.2g,12.6mmol,91％。
溴化羧戊基喹啉(Ⅱ，图7)
喹啉(5.2g,40mmol)和6-溴-正己酸(hexanicacid)(7.8g,40mmol)中加入30ml乙腈。混合物在氮气流下回流三小时，然后室温搅拌15小时。加入50ml丙酮进一步搅拌1小时。过滤收集白色沉淀，用丙酮洗(2*10ml)并干燥。
产率：8.4g,26mmol,65％。
N-羧基戊基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并亚噻唑基)甲基]-碘化喹啉(Ⅲ，图7)
Ⅲ用浓缩(回流45分钟)的Ⅰ(1.6g,5mmol)和存在KOH(0.8g,15mmol)的Ⅱ的乙醇液(20ml)合成。冷却至室温产品用30％KI(水溶液)沉淀。过滤沉淀，丙酮洗，甲醇重结晶。
产率：1.0g,2mmol,40％。
Ⅲ的N-羟基琥珀酰亚胺酯(TO-5-S)(图7)
Ⅲ(0.5g,1mmol)和羟基琥珀酰亚胺酯(0.11g,1mmol)溶解于25ml(无水)二甲氧乙烷(dimetoxyethane)。二环己基碳二亚胺(0.23g,1.1mmol)加入该冷溶液。溶液在0℃搅拌20小时，过滤除去脲。滤液浓缩样品在甲醇中重结晶。
产率：0.4g,0.65mmol,65％。
实施例4.PNA探针(PP10-CTT-TO)溶液合成及其特征
38nmol连接有氨基基团的PNA(序列‘TTTTCTTCTT-CO-(CH2)5-NH2’)溶解于10μl H2O和31μl 500mM的Na3BO3缓冲液，并加入10μl二噁烷。加入两等份2μl的140nmol TO-5-S(在DMSO中)开始反应(中间搅拌5分钟)，反应混合物37℃放置4小时。冷却至25℃加入10μl的乙腈。产物用HPLC纯化，使用反相C-18柱(Waters，对称C18 3.9×150mm)，梯度洗脱程序洗脱(LKB2249),260nm监测吸收(LKB2151)。使用的梯度是用0.01-0.1％v/v三氟乙酸调整的乙腈和水的混合物。流速为1ml/min，梯度为95-60％H2O,20min,60-0％H2O,5min。探针和过量TO-5-S被很好地分离。含探针的组分液氮冷冻，冷冻干燥15小时除去溶剂和三氟乙酸。得到的疏松的红色物质溶解于去离子水。探针与TS杂交，导致显示其相互作用的RG的吸收大幅度改变(图9)。
实施例5．BO-2-0的合成(R1=CH2CH2COOH)
合成包括以下三步：
对甲苯甲磺酸盐(35g,18.8mmol)和2-甲基硫代苯并噻唑(2.5g,14.0mmol)回流5小时，产物(Ⅰ)在甲醇/丙酮中重结晶(图14a)。
产率：4.8g,13.1mmol,94％。
4-甲基吡啶(3.7g,40mmol)和3-溴丙酸(6.1g,40mmol)回流5小时。产物(Ⅱ)在醇/丙酮中重结晶(图14b)。
产率：6.9g,28mmol,70％。
N-羧乙基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并亚噻唑基)甲基]碘化吡啶在存在有溶解于CH2Cl2液(10ml)的Et3N(2.0g,20mmol)时缩合Ⅰ(1.8g,5mmol)和Ⅱ(1.2g,5mmol)(室温过夜)合成。产物用30％的KI(aq)(15ml)沉淀，过滤，甲醇/水中重结晶。
产率：0.70g,2.1mmol,43％。
实施例6．探针PP15-TGT-TO的固相合成、剪切和纯化。
PNA取代浓度为0.15mmol/g的20mg树脂溶涨于DCM中过夜。PNA序列为Re-Lys-Lys-ATCAACACTGCATG-NH-Boc，其中‘Re’为树脂，Boc为氨基末端保护基团t-丁氧基羧酸基。固相合成在充氮条件下玻璃漏斗中抽滤进行。清洗和反应步骤溶液体积为1ml，偶联步骤为0.3ml。Boc通过加5％m-甲醛在三氟乙酸(TFA)中搅拌4分钟除去。该程序重复三次，树脂用三体积DCM∶DMF(1∶1)洗三次后，在用吡啶洗两次。游离氨基用Kaiser检测法检测。PNA单体Boc-胸腺嘧啶(9.8mg,18*10-6mmol)溶解于0.3ml2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU,0.15mM,18*10-6mmol)的DFM液。一分钟后加入二异丙基乙酰胺，DIEA(6.3μl,3.4*10-5mmol)，混合物转移入树脂，偶联反应进行30分钟。反应结束时Kaiser检测无游离氨基。未反应单体过滤除去，树脂用DMF清洗两次。保留氨基的加冒用乙酐和colidin的DMF(1∶1∶8)液处理两分钟。然后用DMF清洗树脂三次，加5％的哌啶的DMF液搅拌四分钟。最后树脂用DCM∶DMF(1∶1)清洗三次，DCM清洗三次。
然后用和胸腺嘧啶一样的方法将TO-5-O(R1=CH2CH2CH2CH2CH2COOH,9.6mg,18*10-6mmol)偶联于Re-Lys-Lys ATCAACACTGCATGT-NH-Boc，除了偶联反应进行45分钟。反应过程中树脂珠变红，Kaiser检测显示无游离氨基。
干燥树脂置于Eppendorf过滤管，用TFA(0.25ml)洗。Lys-Lys-ATCAACACTGCATGT-TO从树脂上剪切下来，加入三氟甲基磺酸(TFMSA)∶TFA∶m-甲酚∶苯硫基甲烷(2∶6∶1∶1,0.25ml)脱保护一小时。然后离心(6000rpm)从树脂上除去混合物转移到检测管。重复剪切一次，最后树脂用TFA(0.25ml)清洗。氮气流蒸发除去混合剪切组分的一半溶剂。然后，冰二乙醚(5ml)加入检测管，得到白色结晶沉淀。试管在6000rpm离心，除去上清夜。探针(PP15-TGT-TO)用四体积乙醚清洗，最后溶解于0.2ml水。加水后探针变红。
如例4所述用反相HPLC纯化探针，MALDI-TOF MS定性(图15)。
PP16-GTC-10c
实施例7．固相合成、剪切和纯化探针PP16-GTC-10C(带刚性接头的探针)。
PNA的取代浓度为0.15mmol/g的树脂20mg在THF中溶涨三小时，然后用DCM清洗。PNA序列为Re-Lys-ATCAACACTGCATGT-NH-Boc，首先如例6所述将胞嘧啶偶合其上，接着如下述偶合刚性接头。
Boc-保护的N-羧甲基哌嗪(3.3mg 13.5×10-6mol)溶解于DMF(0.5ml)然后加入HBTU(5.1mg,13.5×10-6mol)和DIEA(4.8μl,2.75×10-5mol)。混合物加入氨基末端保护序列。偶联进行30min，至Kaiser检测无游离氨基。未反应单体过滤除去，树脂用DMF洗两次。保留氨基的加帽通过用乙酸酐和colidin的DMF(1∶1∶8)液处理两分钟。树脂用DMF洗三次，加入5％的哌啶DMF液搅拌四分钟。树脂最后用DCM∶DMF(1∶1)洗三次及用DCM洗三次。Boc如例6所述从刚性链中除去，Kaiser检测法测定二级胺的存在。TO-2-O(R1=CH2CH2COOH,6.6mg,13.5×10-6mol)溶解于DMF(0.5ml)加入HBTU(5.1mg,13.5×10-6mol)和DIEA(4.8μl,2.75×10-5mol)。混合物中加入树脂。偶联反应进行45min，树脂变红。加冒和清洗如例6所述。
探针(PP16-GTC-Toc)如例4所述用反相HPLC纯化，MALDI-TOFMS定性。
实施例8．用图3A描述方案通过探针PP10-CTT-TO检测单链DNA。
首先测定探针PP10-CTT-TO的背景发光。然后加入过量不影响发光的非互补单链DNA(5’-TCCTTCATTCGCTTC-3’)，然后加入包含TS(5’-AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3’)的单链DNA。这导致发光即刻增强(图8)。样品包含1.4μM的探针，5mM硼酸缓冲液(pH8.5)和50mM NaCl。探测温度为50℃。
实施例9．用图6方案通过探针PP10-CTT-TO检测单链DNA。
具有序列5’-AGCGGTCGACAGAAGAAGAAAA-3’的单链DNA加入到含探针PP10-CTT-TO和与单链DNA的两个连续部分互补的寡聚物5’-GTCGACCGCT-3’的样品中。导致荧光增强45倍(图10)。实验在50℃，5mM硼酸缓冲液(pH8.5)，离子强度为500mM条件下操作。
图11进一步说明用探测混合物。测量260nm时吸收随温度的变化，表明在约65℃时寡聚物分解，这由第一个转折点反映，PNA探针在约85℃分解，这由第二个转折点反映。这种不同反映PNA:NA杂交体比双链NA稳定性较高。
游离探针和杂交探针的荧光都随温度降低。前者可能由于高温下残余后结合程度减小，而后者由于NA双重体中碱基的热振动增强，导致RG分子内活动性，从而降低荧光。杂交后荧光增强用这些信号的比例表示，最大值约为62℃。
杂交探针的荧光在约75℃时落入背景水平，这低于PNA:NA双链体的熔化温度，但该温度下基本上无寡聚物结合。这支持了这样一种假设，杂交状态染料与NA:NA双链体区结合(例6)。
实施例10．蛋白-RG探针的构建。
探针用限制性酶EcoRⅠ构建，其特异识别双链NA中的序列5’-GAATTC-3’/3’-CTTAAG-5’，和BO。200nmol的BO琥珀酰亚胺酯溶解于DMSO，加到1ml 100nmol EcoRⅠ(来自生命工程公司)的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中。搅拌下逐渐加入BO溶液避免蛋白被DMSO变性。混合物4℃暗处振荡15小时，最后4℃下用10K的微浓缩器从游离染料中分离探针。图16显示了游离EcoRⅠ探针、存在含EcoRⅠ识别区的双链DNA的探针、和缺乏该区的双链DNA，此处DNA多聚物为多聚(dAdT)：多聚(dAdT)的荧光光谱。可以看到EcoRⅠ探针特异识别含TS的双链DNA。作为参考还显示了同样DNA存在下游离染料的荧光光谱。
实施例11．SRE-RG探针的荧光增强。代码条件模式杂交后荧光增加 NAA基探针 PP10-CTT-TO 5mM硼酸缓冲液pH8.5,500mMNaCl,50℃6 45 PP10-CTT-TO 5mM硼酸缓冲液pH8.5,500mMNaCl,50℃3A 20 PP10-CTT-TO 5mM硼酸缓冲液pH8.5,500mMNaCl,50℃3A 20 PP10-CTT-BO 10mM硼酸缓冲液pH8.5,25℃3A 8 PP10-CTT-BO 10mM硼酸缓冲液pH8.5,45℃3A 9 PP5-GCT-TO 10mM硼酸缓冲液pH8.5,20℃3A 20 PP11-TT-TO 10mM硼酸缓冲液pH8.5,45℃3A 10 PP8-GCT-TO 10mM硼酸缓冲液pH8.5,45℃3A 35 PP8-GCT-TO 20mM硼酸缓冲液，500mMNaCl,pH8.5,20℃3A 30 PP8-GCT-TO 10mM磷酸缓冲液，pH7.5,25℃3A 27 蛋白基探针 EcoRⅠ 10mM磷酸缓冲液pH7.5,25℃3D 50
实施例12．量子产额确定。
游离或杂交探针PP8-GCT-TO的荧光量子产额相对荧光素确定。PP8-GCT-TO溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)，探针浓度0.8μM。Varian Cary 4测定吸收度，spex fluorolog t2测定荧光。所有测定都用1cm的比色杯。470nm激发样品，记录480-700nm之间的光谱，每nm记录五个数据点。荧光产量(ΦF)相对二价阴离子荧光素的0.1M NaOH溶液确定(假定量子产额为0.93)。量子产额用下公式计算： ΦF=∫-∞∞Fs(υ)dυ∫-∞∞Ff(υ)dV·0.93AfλEXASλEX---(1)]]>
其中F(ν)为波长ν时的荧光发射强度，Aλex为激发波长的吸收。用单链DNA 5’-ATC GAC GAG AGA ATA TCA以1∶1的比率杂交。结果概述如下。样品φFφF(H)/φF(F)*在25℃下，游离的PP8-GCT-TO0.0066 -在25℃下，PP8-GCT-TO和等量互补单链DNA混合0.16 24上述样品加热至80℃5分钟，然后冷却至25℃0.18 27
*杂交后荧光量子产额增加。注意量子产额的增加不必与荧光强度的增加相同，因为游离和杂交探针的吸收不同。
实施例13．背景信号的减弱。
探针PP15-GAT-BO的背景荧光信号在加入杯芳烃后减小(图17)，很可能是它使RG与SRE分离。探针PP15-GAT-BO的浓度为1μM，温度为15℃，使用10mM Tris缓冲液(pH7.5)。
实施例14．NAA-RG与NA-RG的比较。
探针PNA-TO(PP8-GCT-TO)和探针NA-TO(PP8-GCT-TO)用同样的序列和可比较的接头合成。测定了三个温度下游离探针和与含TS的NA杂交探针的荧光(图18)。所有实验中，游离PNA探针的荧光低于NA探针的荧光，杂交PNA探针的荧光高于杂交NA探针的荧光。
实施例15．可见检测。
探针和TS之间杂交的直接观察。图13显示了两个聚丙烯管用宽缝紫外灯照射，从侧面照相(用ASA 200胶片，无滤光)。两管均含3μ1样品和3.5×10-10mol探针。左边的样品还包含过量5倍的非互补NA，而右边发光的样品包含互补NA。使用如例12的同样寡聚物。条件为10mM硼酸缓冲液(pH8.5)，无盐离子，温度30℃。