一种应用于生物催化转化的组合固定化方法.pdf

本发明涉及一种应用于生物催化转化的组合固定化方法，采用单一或混合凝胶(卡拉胶、海藻酸钙等)包埋的游离酶或微生物细胞，或者采用絮凝剂絮凝菌体或者酶形成絮凝团与改性动物肠衣形成组合固定化体系，运用于生物催化转化过程中。该方法操作简单、成本低廉、机械强度好、酶活回收率高。

1、  一种应用于生物催化转化的组合固定化方法，其具体步骤如下：
A)固定化颗粒的制备：将凝胶加入水加热溶解后，冷却37～45℃，以湿细胞或者酶为生物催化剂，与酶保护剂制成菌悬液或者酶悬浮液，与凝胶混匀，倒入培养皿中，冷却、硬化及活化处理，再于冰箱中静置，切成颗粒，即得凝胶颗粒；或者量取一定量的以湿细胞或者酶为生物催化剂的发酵液，移入容器中，在电磁搅拌器搅拌下缓慢加入絮凝剂，加入完毕后，继续搅拌10～15min，静置分层，抽滤得到絮凝团；
B)将上述所得的凝胶颗粒或絮凝团包埋于改性的动物肠衣中；
C)将步骤B)中所制得的装有凝胶颗粒或絮凝团的改性动物肠衣浸没于生物反应的底物溶液中反应。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A)中的凝胶为卡拉胶、明胶、琼脂、海藻酸钙、聚乙烯醇或丙烯酰胺的一种或两种的混合；生物催化剂为天冬氨酸转氨酶产生菌E.coliEP8-10、天冬氨酸酶产生菌E.coliATCC 11303、产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3或猪胰脂肪酶；絮凝剂为壳聚糖、CaCl₂或聚丙烯酰胺。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶保护剂为海藻糖溶液和/或Mg²⁺溶液。

4、  根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于酶保护剂的加入量以整体固化溶液为基准，海藻糖溶液为50mmol/L～250mmol/L，Mg²⁺溶液为2mmol/L～5mmol/L。

5、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于絮凝剂的加入量以整体固化溶液为基准为50～80mg/L。

6、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中生物催化剂的加入量同凝胶的质量比为3～5∶1。

7、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于生物反应的底物溶液分别为苯丙酮酸与天冬氨酸溶液、烯丙醇酮与醋酸乙烯酯溶液、富马酸铵或富马酸钠溶液。

8、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤B)中改性的胶动物肠衣是在动物肠衣的基础上，通过铁离子改性法、络合物改性法或甲醛改性法得到的。

一种应用于生物催化转化的组合固定化方法
技术领域：
本发明涉及生物化工及酶工程技术领域。具体涉及组合固定化方法的开发及在不同生物催化反应体系中的应用。
背景技术：
生物催化剂(酶与细胞)的固定化是将具有化学催化活性的蛋白质固定，即定位于一定的空间范围内，实现催化反应。由于它具有反应后易于与底物、产物分开，活性蛋白质的稳定性提高，可反复使用、连续化操作和反应所需空间小等显著优点，因此与游离酶及细胞相比可大大降低生产成本，增强对苛刻反应条件的适应能力，提高生物反应器单位体积的生产能力。目前，固定化技术的应用已涉及食品、化工、医药、化学分析、环境保护和能源开发等诸多领域。
多年来，国内外皆投入了大量人力、物力、财力对固定化技术进行研究，固定化技术也因此成为当今生物工程中的关键技术之一。目前发展的固定化方法主要包括：吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、微囊化法、絮凝法等，现有的各种固定化方法各有其优缺点，上述方法不是存在固定化后生物催化活性损失大、再生困难等缺点，就是存在生物催化剂易泄漏、脱落、制备困难、稳定性差、固定化费用高的不足，从中还不能找出一种既经济高效又较为普适的固定化方法。需要十分强调的是现有的各种固定化方法在实际应用中属于随机固定化，即生物催化剂(酶和细胞)与固定化载体的结合位点及方向是随机的，因此，很难预测这种随机固定化酶与细胞的性质，也很容易被邻近生物催化剂分子(酶分子或细胞)接触的空间位阻屏障，从而大大降低生物催化剂(酶分子或细胞)催化活性。还应指出的是，尽管固定化方法是一条十分有效地保持或增加生物催化剂稳定性的途径，但是由于对生物催化剂的复杂失活因素及失活机理的基础研究还不够深入，往往导致固定化载体介质、固定化过程中及固定化后反应微环境所引起的生物催化剂的失活。
目前，如何解决这些问题已经成为固定化技术的研究热点，研究者不断对固定化载体进行改良并提出新的载体和新的固定化方法，并在组合固定化方面进行了大量的研究。组合固定化技术就是将两种或者两种以上的固定化方法组合应用，及添加稳定因子和促进因子的固定化方法。它能够平衡传统单一固定化方法的优缺点，使酶在保持原有活性的基础上，稳定性也有所提高，还具有操作简单，成本低廉等优点。为传统的固定化方法注入了新的特点和活力，使固定化技术的应用前景更加广阔。凝胶包埋法是细胞固定化最常用的方法，即将细胞包裹于凝胶的微小格子内，该方法操作简单，对细胞活性影响较小，制作的固定化细胞球的强度较高。常用的凝胶包埋固定化载体有卡拉胶、海藻酸钙(SA)、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、明胶以及丙烯酰胺(ACRM)等。可以用于微生物(或酶)固定化的动物肠衣是一种胶原蛋白膜，具有化学稳定性好，安全无毒和生物体有较好的相容性的特点，且由于胶原是从牛筋中提取出来的具有蛋白质结构的天然生物材料，原料易得。但是动物肠衣存在耐水性差，易溶胀溶解的缺点，在水相反应体系中，由于长期与水接触，动物肠衣易溶于水中，动物肠衣的固定化体系无法长期使用，为了增加动物肠衣的耐水性能，需要进行改性，不同的改性方法，如热处理、缩醛化、等离子体改性，得到的改性动物肠衣的物理化学性质及动物肠衣的结构和性能不尽相同。因此，需要选取较为合适的改性方法应用于动物肠衣固定化技术，寻找一个合适的具有很好的稳定性及可反应性的固定化载体，最终将动物肠衣固定化技术应用于工业化生产。
发明内容：
本发明的目的是为了克服现有固定化技术生物催化活性损失大、再生困难、生物催化剂易泄漏、脱落、制备困难、稳定性差、固定化费用高的缺点而提供了一个操作简单、成本低廉、机械强度好、酶活回收率高的应用生物催化转化的组合固定化方法。
本发明的技术方案为：
一种应用于生物催化转化的组合固定化方法，其具体步骤如下：
A)固定化颗粒的制备：将凝胶加入水，加热溶解后，冷却37-45℃，以湿细胞或者酶为生物催化剂，与酶保护剂制成菌悬液或者酶悬浮液，与凝胶混匀，倒入培养皿中，冷却、硬化及活化处理，再于冰箱中静置，切成颗粒，即得凝胶颗粒；或者量取一定量的以湿细胞或者酶为生物催化剂发酵液，移置容器中，搅拌下缓慢加入絮凝剂，加入完毕后，继续搅拌10～15min，静置分层，抽滤得到絮凝团。
B)将上述所得的凝胶颗粒或絮凝团包埋于改性的动物肠衣中；
C)将步骤B)中所制得的装有凝胶颗粒或絮凝团的改性动物肠衣浸没于生物反应的底物溶液中反应。
其中步骤A)中的凝胶为卡拉胶、明胶、琼脂、海藻酸钙、聚乙烯醇或丙烯酰胺的一种或两种的混合；以湿细胞或者酶为生物催化剂为天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10、猪胰脂肪酶、天冬氨酸酶产生菌E.coli ATCC 11303、产氨短杆菌MA-2或黄色短杆菌MA-3；絮凝剂为壳聚糖、CaCl₂或聚丙烯酰胺。
其中酶保护剂为海藻糖溶液和/或Mg²⁺溶液。酶保护剂的加入量以整体固化溶液为基准，海藻糖溶液为50mmol/L～250mmol/L，Mg²⁺溶液为2mmol/L～5mmol/L；絮凝剂的加入量为50～80mg/L。生物催化剂的加入量同凝胶的质量比为3～5∶1。
其中生物反应的底物溶液分别为苯丙酮酸与天冬氨酸溶液、烯丙醇酮与醋酸乙烯酯溶液、富马酸铵或富马酸钠溶液，上述成组底物溶液的摩尔比为1∶1左右。底物溶液的加入量根据不同的反应体系及不同的反应条件而变化。
其中步骤B)中，不同的改性胶动物肠衣是在动物肠衣的基础上，通过常规的铁离子改性法、络合物改性法或甲醛改性法得到的改性动物肠衣。
其中步骤C)反应温度与反应时间为常规反应温度和时间，一般为37℃，4～5h。
本发明提供了一个操作简单、成本低廉、机械强度好、酶活回收率高的固定化体系，尤其应用于L-苹果酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸制备及烯丙醇酮等手性物质的拆分。
有益效果：
1、本发明采用单一或混合凝胶(卡拉胶、海藻酸钙等)包埋的游离酶或微生物细胞，或者采用絮凝剂絮凝菌体或者酶形成絮凝团与改性动物肠衣形成组合固定化体系，运用于生物催化转化过程中。若将动物肠衣与游离菌体直接包埋，势必会使菌体局限在一个非常狭小的空间里，不利于反应的进行，如果将菌体首先进行凝胶包埋，再将凝胶包埋得到的固定化颗粒包埋于动物肠衣中，包埋后固体颗粒的体积增加了，不仅可以增加菌体与底物溶液的接触机会，还可以增加动物肠衣的通透性。
2、在凝胶中添加镁离子和海藻糖等辅助因子，显著保护酶的催化活性，提高酶活回收率和生物转化体系的可反应性，能形成良好的组合固定化体系。
3、作为一种普适性的固定化方法，该方法成本低，制备工艺简单，具备普适性，可用于多个生化产品的酶催化转化中，具有很好的实际应用价值。
具体实施方式：
实例1
清水洗去动物肠衣表面杂质，将动物肠衣浸于50mL 2g/L的Fe₂(SO₄)₃改性剂中浸渍5h，清水洗涤至洗液呈中性待用。取10g卡拉胶，溶解于250mL水中，配制成4％的卡拉胶溶液；先将0.03mol海藻糖晶体加入100mL水配制成海藻糖溶液，取50mL海藻糖溶液加入到50g天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10湿细胞，制成菌悬液，45℃下与卡拉胶溶液混合，倒入培养皿中冷却，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再于冰箱中静置，切成3×3×3mm的颗粒，即得固定化颗粒。再与铁离子改性动物肠衣组合固定化应用于固定化天冬氨酸转氨酶产生菌E.coliEP8-10制备L-苯丙氨酸的反应体系中。
将采用10g湿细胞制得的装有凝胶颗粒的改性动物肠衣浸没于200mL以L-天冬氨酸为氨基供体，苯丙酮酸溶液浓度为0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸与苯丙酮酸摩尔比约为1.1∶1，pH值为8.5的底物溶液中37℃下反应5h。此时天冬氨酸转氨酶的酶活回收率高达95.6％。
实例2
清水洗去动物肠衣表面杂质，将动物肠衣于50mLCr₂O₃ 5g/L，NaCl 10g/L，Na₂SO₄·10H₂O 20g/L的改性剂中42℃下浸渍5h，维持pH3.4，最后清水洗涤至洗液呈中性待用。取10g卡拉胶，溶解于250mL水中，配制成4％的卡拉胶溶液；同时，取1.2mmol Mg²⁺加入100mL水配制成Mg²⁺溶液，取50mL Mg²⁺溶液加入到50g天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10湿细胞，制成菌悬液，在37℃下与卡拉胶溶液混合，倒入培养皿中冷却，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再于冰箱中静置，切成3×3×3mm的颗粒，即得固定化颗粒。再与铬络合物改性动物肠衣组合固定化应用于固定化天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10制备L-苯丙氨酸的反应体系中。
将采用10g湿细胞制得的装有凝胶颗粒的改性动物肠衣浸没于200mL以L-天冬氨酸为氨基供体，苯丙酮酸溶液浓度为0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸与苯丙酮酸摩尔比约为1.1∶1，pH值为8.5的底物溶液中37℃下反应5h。此时天冬氨酸转氨酶的酶活回收率为88.9％。
实例3
清水洗去动物肠衣表面杂质，将动物肠衣于50mLNaCl 15g/L，Na₂CO₃4-5g/L，Na₂SO₄·10H₂O 20g/L，HCHO(40％)8g/L的改性剂中，清水洗涤至洗液呈中性待用。将卡拉胶与明胶以3.5∶0.5的质量比混合，溶解于250mL水中，配制成4％的卡拉胶与明胶混合凝胶溶液；同时，取0.15mol海藻糖晶体及3mmolMg²⁺加入100mL水配制成海藻糖与Mg²⁺混合溶液，取50mL混合溶液加入到50g天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10湿细胞，制成菌悬液；在37℃下与卡拉胶溶液混合，倒入培养皿中冷却，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再于冰箱中静置，切成3×3×3mm的颗粒，即得固定化颗粒。再与甲醛改性动物肠衣组合固定化应用于固定化天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10制备L-苯丙氨酸的反应体系中。
将采用10g湿细胞制得的装有凝胶颗粒的改性动物肠衣浸没于200mL以L-天冬氨酸为氨基供体，苯丙酮酸溶液浓度为0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸与苯丙酮酸摩尔比约为1.1∶1，pH值为8.5的底物溶液中，37℃下反应5h。此时天冬氨酸转氨酶的酶活回收率为91.3％。上述组合固定化体系连续反应操作两个月，天冬氨酸转氨酶活力仍然保持在88％以上，反复利用率高。
实例4
取10g海藻酸钠，不断搅拌加入到250mL水中，完全溶解后静置30min；同时，取0.09mol海藻糖晶体加入100mL水配制成海藻糖溶液，取50mL海藻糖溶液加入到50g猪胰脂肪酶(L3126-500G，SIGMA公司)中制成悬浮液，与海藻酸钠溶液均匀混合，用10mL移液管挤混合物于0.2M CaCl₂溶液中，将海藻酸钙凝胶球在CaCl₂溶液中固化20min，即得固定化颗粒，冻干除水。将凝胶颗粒和铬络合物改性动物肠衣的组合固定化应用于固定化猪胰脂肪酶拆分烯丙醇酮的反应体系中。
将装有凝胶颗粒的改性动物肠衣浸没于以1∶1.2摩尔比的烯丙醇酮与醋酸乙烯酯底物溶液中、置于锥形瓶中，于40℃，800r/min下反应48h。此时采用铬络合物改性动物肠衣固定化所得到的拆分转化率达到了75.3％，已接近工业化指标。
实例5
量取250mL天冬氨酸酶产生菌E.coli ATCC 11303发酵液(相当于10g湿细胞)，移置三角瓶中，在电磁搅拌器搅拌下缓慢加入15mg的壳聚糖，使发酵液中壳聚糖的浓度达到60mg/L，加入完毕后，继续搅拌10～15min，静置分层，抽滤得到絮凝团；将絮凝团载入改性动物肠衣中进行组合固定化。将该组合固定化体系应用于固定化天冬氨酸酶产生菌E.coli ATCC 11303制备L-天门冬氨酸的反应体系中。
1.8mol/L的富马酸铵溶液250mL，与载有天冬氨酸酶产生菌E.coli ATCC11303絮凝团的改性动物肠衣组合固定化体系混合，37℃下反应4h，此时，固定化大肠杆菌颗粒中天门冬氨酸酶的相对活力最高，富马酸铵的转化率达99.9％以上。将上述组合固定化体系连续反应操作三个月，天门冬氨酸酶活力仍然保持在96％以上，具有良好的操作稳定性。
实例6
量取250mL产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3发酵液(相当于10g湿细胞)，移置三角瓶中，在电磁搅拌器搅拌下缓慢加入17.5mg的聚丙烯酰胺，使发酵液中聚丙烯酰胺的浓度达到70mg/L，加入完毕后，继续搅拌15～20min，静置分层，抽滤抽滤得到絮凝团，并将絮凝团载入改性动物肠衣中进行组合固定化。将该组合固定化体系应用于固定化产氨短杆菌MA-2，黄色短杆菌MA-3制备L-苹果酸的反应体系中。
将1.8mol/L富马酸铵溶液250mL，与载有产氨短杆菌MA-2，黄色短杆菌MA-3絮凝团的改性动物肠衣组合固定化体系混合，37℃下反应4h，此时，两菌的延胡索酸酶活回收率达96％以上。将上述组合固定化体系连续反应操作三个月，延胡索酸酶活力仍然保持在92％以上，具有良好的操作稳定性。
注：本发明所提到的天冬氨酸转氨酶产生菌E.coli EP8-10、天冬氨酸酶产生菌E.coli ATCC 11303或产氨短杆菌MA-2，黄色短杆菌MA-3在下列文章中公开过：徐虹等《微生物学报》发表《大肠杆菌EP8-10转化苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸的研究》1999年6月39卷3期；胡永红等《生物工程学报》发表《固定化产氨短杆菌MA-2，黄色短杆菌MA-3反应动力学的研究》2002年3月18卷2期；胡永红等《工业微生物》发表《絮凝方法收集产氨短杆菌MA-2，黄色短杆菌MA-3条件的优化》2003年12月33卷4期；徐虹等《南京化工大学学报》发表《游离酶法生产L-天冬氨酸的工艺研究》1996年1月18卷1期。