用于检测癌症的寡糖分布法.pdf

本发明提供了用于在个体中鉴别癌症特异性寡糖的方法，以及用于在个体中确定癌症株的方法。本发明还提供了通过检测在个体中是否存在特异性的癌症标记来诊断癌症或癌症的阶段的方法，以及通过给予抗此类标记的抗体治疗癌症的方法。此外，本发明提供了含O－连接寡糖的癌症标记，以及用于诊断或治疗癌症的试剂盒。

1.  一种鉴别癌症特异性寡糖的方法，所述方法包括：
(a)从测试样品中选择性释放所述寡糖，其中所述测试样品是获自癌细胞系或患有癌症的个体的样品；
(b)采用矩阵辅助激光解吸电离(MALDI)-傅里叶变换质谱法(FTMS)，从所述测试样品中获得所述寡糖的质谱；以及
(c)比较所述测试样品的质谱和对照样品的质谱，其中通过所述测试样品的质谱中独特的寡糖的存在鉴别所述癌症特异性寡糖。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述独特的寡糖选自：O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离寡糖、或它们的组合。

3.  如权利要求1所述的方法，其还包括对所述独特的寡糖进行红外多光子解离(IRMPD)的步骤。

4.  如权利要求3所述的方法，其还包括用糖苷外切酶消化所述独特的寡糖的步骤。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是腺癌。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试样品是条件培养基或血清。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照样品是获自正常细胞系或未患癌症的个体的样品。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述对照样品是条件培养基或血清。

10.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述独特的寡糖是选自下组的O-连接寡糖：硫酸化寡糖、含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神经氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它们的组合。

11.  一种抗体，所述抗体特异性结合于用权利要求1所述方法鉴别的独特的寡糖。 

12.  如权利要求11所述的抗体，其还包含与其连接的可检测标记。

13.  一种在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：
给予所述个体治疗有效量的权利要求11所述的抗体。

14.  一种在个体中确定癌症株的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与至少一种已知癌症株的质谱分布进行比较，其中，通过所述样品的质谱与一种已知癌症株的质谱分布的相似性来确定所述癌症株。

15.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌症株是卵巢癌株或乳腺癌株。

16.  一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
检测获自所述个体的样品中是否存在独特的寡糖，其中所述独特寡糖的存在指示所述个体患有癌症。

17.  如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述独特的寡糖选自：O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离寡糖、或它们的组合。

18.  如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述检测包括：
(a)采用MALDI-FTMS，获得所述样品的寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)确定所述质谱中所述独特的寡糖的存在。

19.  如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述检测包括：使所述样品与特异性结合所述独特寡糖的抗体接触。

20.  一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，其中，所述样品中含NeuGc的O-连接寡糖与含NeuAc的O-连接寡糖的比值高于所述对照样品指示所述个体患有癌症。

21.  如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌症是腺癌。

22.  如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。

23.  如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述对照样品是获自正常细胞系或未患癌症的个体的样品。

24.  如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。

25.  一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(a)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，其中，所述样品中硫酸化O-连接寡糖的百分比低于所述对照样品指示所述个体患有癌症。

26.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述癌症是腺癌。

27.  如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。

28.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述对照样品是获自正常细胞系或未患癌症的个体的样品。

29.  如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。

30.  一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)确定在所述质谱中是否存在选自下组的癌症标记：硫酸化寡糖、含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它们的组合，
其中，存在所述癌症标记指示所述个体患有癌症。

31.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述癌症是腺癌。

32.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。

33.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。

34.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述硫酸化寡糖具有选自下组的组成：1 HexNAc：1 Hex：1 SO₃H；1 HexNAc：3 Hex：1 Fuc：1 SO₃H；2 HexNAc：1Hex：2 Fuc：1 SO₃H；2 HexNAc：3Hex：1 SO₃H；4 HexNAc：1 Hex：1 SO₃H；2HexNAc：2 Hex：2 Fuc：1 SO₃H；5 HexNAc：1 Hex：1 Fuc：1 SO₃H；或它们的组合。

35.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述含NeuAc的寡糖具有选自下组的组成：1 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc；1 HexNAc：2 Hex：1 NeuAc；2HexNAc：1 NeuAc：1 Fuc；2 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc；1 HexNAc：3 Hex：1NeuAc；3 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc：3 Fuc；或它们的组合。

36.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述含NeuGc的寡糖具有选自下组的组成：1 HexNAc：1 Hex：1 NeuGc：1 Fuc；1 HexNAc：2 Hex：1 NeuGc；2 HexNAc：1 NeuGc：1 Fuc；3 HexNAc：1 NeuGc；1 HexNAc：2 Hex：1 NeuGc：1Fuc；3 HexNAc：4 Hex：1 NeuGc；或它们的组合。

37.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述中性寡糖具有选自下组的组成：1 HexNAc：2 Fuc；2 HexNAc：2 Fuc；2 HexNAc：1 Hex：1 Fuc；4 HexNAc；1 HexNAc：2 Hex：2 Fuc；4 HexNAc：1 Hex；1 HexNAc：3 Hex：2 Fuc；1 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；3 HexNAc：1 Hex：2 Fuc；2 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；6 HexNAc；3HexNAc：3 Hex：2 Fuc；4 HexNAc：3 Hex：1 Fuc；或它们的组合。

38.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述含Hex的寡糖具有选自下组的组成：2 Hex；1 HexNAc：1 Hex；3 Hex；1 HexNAc：2 Hex；3 Hex：1HexNAc；1 Hex^*U：2Hex：1 HexNAc；4 Hex：1 HexNAc；3 Hex：2 HexNAc；1 Hex^*：2Hex：2 HexNAc；4 Hex：2 HexNAc；1 Hex^*：3 Hex：2 HexNAc；5 Hex：2 HexNAc；4 Hex：3 HexNAc；5 Hex：3 HexNAc；1 Hex^*：4 Hex：3 HexNAc；2 Hex^*：3 Hex：1 HexNAc；或它们的组合。

39.  如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述含HexA的寡糖具有选自下组的组成：m/z221+[HexA]₁；m/z221+[HexA]₂；m/z221+[HexA]₃；m/z221+[HexA]₄；m/z221+[HexA]₅；m/z221+[HexA]₆；m/z221+[HexA]₇；m/z361+[HexA]₁；m/z361+[HexA]₂；m/z361+[HexA]₃；m/z361+[HexA]₄；m/z361+[HexA]₅；m/z361+[HexA]₆；m/z551+[HexA]₁；m/z551+[HexA]₂；m/z551+[HexA]₃；m/z551+[HexA]₄；m/z551+[HexA]₅；m/z555+[HexA]₁；m/z555+[HexA]₂；m/z555+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₁；m/z604+[HexA]₂；m/z604+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₄；或它们的组合。

40.  一种在个体中诊断癌症的阶段的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)测定在所述质谱中是否存在第一癌症标记，其中所述第一癌症标记选自：1 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc；2HexNAc：1 NeuAc：1 Fuc；1HexNAc：3Hex：1 NeuAc；1 HexNAc：2 Hex：1NeuGc；3 HexNAc：1NeuGc；1 HexNAc：2 Hex：1 NeuGc：1Fuc；1 HexNAc：3 Hex：1 Fuc：1SO₃H；2 HexNAc：1 Hex：2 Fuc：1 SO₃H；2 HexNAc：3Hex；1 SO₃H；4HexNAc：1 Hex：1 SO₃H；5 HexNAc：1 Hex：1 Fuc：1 SO₃H；2HexNAc：2 Fuc；2 HexNAc：1 Hex：1 Fuc；4 HexNAc；4 HexNAc：1Hex；1 HexNAc：3 Hex：2 Fuc；1 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；3 HexNAc：1Hex：2 Fuc；2 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；或它们的组合；以及
(c)测定在所述质谱中是否存在第二癌症标记，其中所述第二癌症标记选自下组：1 HexNAc：2 Hex：1 NeuAc；2 HexNAc：1 Hex：1NeuAc；3 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc：3 Fuc；1 HexNAc：1 Hex：1NeuGc：1 Fuc；  2 HexNAc：1 NeuGc：1 Fuc；3 HexNAc：4 Hex：1NeuGc；1 HexNAc：1 Hex：1 SO₃H；2 HexNAc：2 Hex：2 Fuc：1 SO₃H；1 HexNAc：2 Fuc；1 HexNAc：2 Hex：2 Fuc；6 HexNAc；3 HexNAc：3Hex：2 Fuc；4 HexNAc：3 Hex：1 Fuc；或它们的组合，
其中，存在所述第一癌症标记而不存在所述第二癌症标记指示所述个体患有早期癌症，存在第二癌症标记指示所述个体患有晚期癌症。

41.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述早期癌症是早期卵巢癌。

42.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述早期卵巢癌与低CA 125水平相关。

43.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述晚期癌症是晚期卵巢癌。

44.  如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述晚期卵巢癌与高CA 125水平相关。

45.  一种癌症标记，其含有具有选自以下组成的O-连接寡糖：1 HexNAc：1Hex：1 SO₃H；1 HexNAc：3 Hex：1 Fuc：1 SO₃H；2 HexNAc：1 Hex：2 Fuc：1 SO₃H；2HexNAc：3 Hex：1 SO₃H；4 HexNAc：1 Hex：1 SO₃H；2 HexNAc：2 Hex：2 Fuc：1SO₃H；5 HexNAc：1 Hex：1 Fuc：1 SO₃H；1 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc；1 HexNAc：2Hex：1 NeuAc；2 HexNAc：1 NeuAc：1 Fuc；2 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc；1 HexNAc：3Hex：1 NeuAc；3 HexNAc：1 Hex：1 NeuAc：3 Fuc；1 HexNAc：1 Hex：1 NeuGc：1 Fuc；1 HexNAc：2 Hex：1 NeuGc；2 HexNAc：1 NeuGc：1 Fuc；3 HexNAc：1 NeuGc；1HexNAc：2 Hex：1 NeuGc：1 Fuc；3 HexNAc：4 Hex：1 NeuGc；1 HexNAc：2 Fuc；2HexNAc：2 Fuc；2 HexNAc：1 Hex：1 Fuc；4 HexNAc；1 HexNAc：2 Hex：2 Fuc；4HexNAc：1 Hex； 1 HexNAc：3 Hex：2 Fuc；1 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；3 HexNAc：1Hex：2 Fuc；2 HexNAc：4 Hex：1 Fuc；6 HexNAc；3 HexNAc：3 Hex：2 Fuc；4HexNAc：3 Hex：1 Fuc；2 Hex；1 HexNAc：1 Hex；3 Hex；1 HexNAc：2 Hex；3Hex：1HexNAc；1 Hex^*：2 Hex：1 HexNAc；4Hex：1 HexNAc；3 Hex：2 HexNAc；1 Hex^*：2Hex：2 HexNAc；4 Hex：2 HexNAc；1 Hex^*：3 Hex：2 HexNAc；5 Hex：2 HexNAc；4 Hex：3 HexNAc；5 Hex：3 HexNAc；1 Hex^*：4 Hex：3 HexNAc；2 Hex^*：3 Hex：1HexNAc；m/z 221+[HexA]₁；m/z 221+[HexA]₂；m/z 221+[HexA]₃；m/z221+[HexA]₄；m/z221+[HexA]₅；m/z221+[HexA]₆；m/z221+HexA]₇；m/z361+[HexA]₁；m/z361+[HexA]₂；m/z361+[HexA]₃；m/z361+[HexA]₄；m/z361+[HexA]₅；m/z361+[HexA]₆；m/z551+[HexA]₁；m/z551+[HexA]₂；m/z551+[HexA]₃；m/z551+[HexA]₄；m/z551+[HexA]₅；m/z555+[HexA]₁；m/z555+[HexA]₂；m/z555+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₁；m/z604+[HexA]₂；m/z604+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₄；或它们的组合。

46.  一种抗体，所述抗体特异性结合权利要求45所述O-连接寡糖。

47.  如权利要求46所述的抗体，其还包含与其结合的可检测标记。

48.  如权利要求47所述的抗体，其特征在于，所述可检测标记选自下组：荧光素、罗丹明、得克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

49.  一种在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：
给予所述个体治疗有效量的权利要求46所述的抗体。

50.  一种寡糖阵列，所述阵列包含固定于固相载体上的多种O-连接寡糖。

51.  如权利要求50所述的阵列，其特征在于，所述固相载体选自：纸、膜、滤器、芯片、针或玻璃。

52.  一种在个体中诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)权利要求50所述的阵列；
(b)与所述阵列上所述多种O-连接寡糖特异性结合的多种抗体；以及
(c)对获自所述个体的样品使用所述阵列和所述多种抗体的指导说明书。

53.  如权利要求52所述的试剂盒，其特征在于，所述多种抗体具有与其结合的可检测标记。

用于检测癌症的寡糖分布法
相关申请的交叉参考
本申请要求提交于2004年6月22日的美国临时申请60/582,250的优选权，将其全文纳入本文作为参考。
关于在联邦政府赞助的研究和开发中完成的发明的权属声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的第R01-GM049077号基金(或合同)的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
卵巢癌在美国是第五大致死性癌症，它是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤。根据美国癌症学会的报道(2002)，美国将约有23,300名妇女被诊断患有卵巢癌，而13,900名将死于该疾病。世界卫生组织(WHO)根据卵巢肿瘤细胞的类型对卵巢肿瘤进行了分类，其种类包括例如：上皮细胞瘤、生殖细胞瘤、间质细胞瘤和转移性肿瘤。上皮细胞瘤是最为常见的类型，在卵巢表面上典型地长有异常团块。间质细胞瘤和生殖细胞瘤通常较少见。
卵巢癌常被称为″无症状杀伤者″，这是因为它没有明显的早期症状。事实上，只有在卵巢癌已扩散到卵巢以外之后才会显现出卵巢癌的特异性症状。及早检测出的卵巢癌是很容易治疗的，因此早期诊断非常重要。例如，如果在扩散到卵巢以外之前检测出卵巢癌，则95％的妇女将能存活5年以上；然而，如果在晚期才诊断出的话，仅28％的妇女能存活5年以上。
鉴别生物标记以诊断和治疗癌症的最新进展主要集中在蛋白质组学的研究上。例如，已通过蛋白质组学或基因表达分析鉴别了诸如骨桥蛋白、periostin和HE7(WFDC2)的蛋白质，已表明它们是卵巢癌的潜在诊断标记(Kim等，JAMA，287：1671-1679(2002)；Hellstrom等，Cancer Res.，63：3695-3700(2003)；Gillan等，Cancer Res.，62：5358-5364(2002))。然而，它们作为癌症诊断标记的效用尚未知。
粘蛋白是由各种类型的上皮细胞表达和分泌的蛋白质(Van den Steen等，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33：151-208(1998))。上皮细胞在组织/器官的外壁上表达，并参与细胞-细胞或细胞-基质间的相互作用，它常作为组织与其环境间的界面。粘蛋白是由正常分泌型上皮细胞分泌的，其在保持内环境稳定和细胞存活中起着重要的作用(Hanisch，Biol.Chem.，382：143-149(2001))。粘蛋白的特征通常为具有高水平糖基化的大的糖蛋白。寡糖(主要是O-连接或粘蛋白型寡糖)构成了粘蛋白质量的大部分(Van den Steen等，id)。
长期以来一直认为粘蛋白与癌症的发病机理有联系(Hollingsworth等，Nat.Rev.Cancer，4：45-60(2004))。大多数类型的腺癌(即上皮细胞癌)常伴有高水平的粘蛋白产生(Hollingsworth等，同前)。例如，卵巢癌中的粘蛋白(如MUC1和CA 125(MUC 16))上升(Stimpfl等，Cancer Lett.，145：133-141(1999))。发现MUC 1通常与乳腺癌相关(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236；318-327(1996)；Lloyd等，J.Biol.Chem.，271：33325-33334(1996)；Croce等，Br.Cancer Res.Treatment，81：195-207(2003))。已将CA 125(MUC 16)常规作为卵巢癌症标记用于临床中，并被评价为有效用于卵巢癌患者监测和预后评价的生化工具(Bast等，N.Engl.J.Med.，309：883-887(1983)；Bast等，J.Clin.Invest.，68：1331-1337(1981))。然而，仅在50％的FIGO(妇产科国际联盟评分系统，International Federation of Gynecology and Obstetrics scoring system)I期卵巢癌患者中发现血清CA 125水平的提高(Jacobs等，Hum.Reprod.，4：1-12(1989))。另外，大部分患有诸如子宫内膜异位或盆腔炎的良性病症的妇女也会有CA 125水平的提高(Jacobs等，id；Mashasi等，Obstret.Gynecol.，72：328-331(1988))。因此，血清CA 125水平的提高不是检测早期发病的卵巢癌的适宜指示。
对粘蛋白(例如CA 125)水平的评估因几种因素而变得复杂。首先，粘蛋白是具有高分子量(例如，10⁷道尔顿)的高异质性糖蛋白。其次，目前用于检测粘蛋白的抗体方法不精确且不能定量。再次，通常检测的粘蛋白(例如CA 125)在不同的卵巢癌肿瘤类型中的表达不相同。
因此，本领域需要鉴别出用于腺癌(例如卵巢癌或乳腺癌)早期检测或诊断的生物标记。本发明满足了这一需求和其它需求。
发明概述
本发明提供了用于在个体中鉴别癌症特异性寡糖的方法，以及用于在个体中确定癌症株的方法。本发明还提供了通过检测是否存在特异性的癌症标记以在个体中诊断癌症或癌症阶段的方法，以及通过给予抗此类标记的抗体治疗癌症的方法。此外，本发明提供了含O-连接寡糖的癌症标记，以及用于诊断或治疗癌症的试剂盒。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于鉴别癌症特异性寡糖的方法，所述方法包括；
(a)从测试样品中选择性地释放所述寡糖，其中所述测试样品是获自癌细胞系或患有癌症的个体的样品；
(b)采用矩阵辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorptionionization，MALDI)-傅里叶变换质谱法(FTMS)获得所述寡糖的质谱；以及
(c)将所述测试样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，其中，通过所述测试样品的质谱中独特寡糖的存在来鉴别所述癌症特异性寡糖。
另一方面，本发明提供了一种用于在个体中确定癌症株的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述测试样品的质谱与至少一种已知癌症株的质谱分布进行比较，
其中，通过所述测试样品的质谱与一种已知癌症株的质谱分布的相似性来确定所述癌症株。
另一方面，本发明提供了一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
检测获自所述个体的样品中是否存在独特的寡糖，其中所述独特寡糖的存在指示所述个体患有癌症。
在还有另一方面，本发明提供了一种用于在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，其中，所述样品中含NeuGc O-连接寡糖与含NeuAc O-连接寡糖的比例高于所述对照样品指示所述个体患有癌症。
在还有一方面，本发明提供了一种用于在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，其中，所述样品中硫酸化O-连接寡糖的百分比低于所述对照样品指示所述个体患有癌症。
另一方面，本发明提供了一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)测定在所述质谱中是否存在选自下组的癌症标记：硫酸化寡糖、含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid)(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖或它们的组合，
其中，存在所述癌症标记指示所述个体患有癌症。
另一方面，本发明提供了一种用于在个体中诊断癌症的阶段的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)测定在所述质谱中是否存在第一癌症标记，其中所述第一癌症标记选自：1HexNAc:1Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO₃H；2HexNAc:3Hex:1SO₃H；4HexNAc:1Hex:1SO₃H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；或它们的组合；以及
(c)测定在所述质谱中是否存在第二癌症标记，其中所述第二癌症标记选自：1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1 1NeuGc:1Fuc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:1Hex:1SO₃H；2HexNAc:2Hex:2 Fuc:1SO₃H；1HexNAc:2Fuc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它们的组合，
其中存在所述第一癌症标记而不存在所述第二癌症标记指示所述个体患有早期癌症，而存在第二癌症标记指示所述个体患有晚期癌症。
在还有另一方面，本发明提供了一种癌症标记，其包含具有选自下组的组分的O-连接寡糖:1HexNAc:1Hex:1SO₃H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO₃H；2HexNAc:3Hex:1SO₃H；4HexNAc:1Hex:1SO₃H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO₃H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO₃H；1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1 NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex；1NeuGc；1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex；2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex^*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex^*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex^*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex^*:4Hex:3HexNAc；2Hex^*:3Hex:1HexNAc；m/z 221+[HexA]₁；m/z 221+[HexA]₂；m/z 221+[HexA]₃；m/z 221+[HexA]₄；m/z 221+[HexA]₅；m/z 221+[HexA]₆；m/z 221+[HeXA]₇；m/z 361+[HexA]₁；m/z 361+[HexA]₂；m/z 361+[HexA]₃；m/z 361+[HexA]₄；m/z 361+[HexA]₅；m/z 361+[HexA]₆；m/z 551+[HexA]₁；m/z 551+[HexA]₂；m/z 551+[HexA]₃；m/z 551+[HexA]₄；m/z 551+[HexA]₅；m/z 555+[HexA]₁；m/z 555+[HexA]₂；m/z 555+[HexA]₃；m/z 604+[HexA]₁；m/z 604+[HexA]₂；m/z 604+[HexA]₃；m/z 604+[HexA]₄；或它们的组合。
在还有一方面，本发明提供了一种在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：
给予所述个体治疗有效量的特异性结合于癌症标记的抗体。
另一方面，本发明提供了一种用于在个体中诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含多种癌症标记的阵列；
(b)特异性结合于所述阵列上的所述多种癌症标记的多种抗体；以及
(c)对获自所述个体的样品使用所述阵列和所述多种抗体的指导说明书。
另一方面，本发明提供了一种用于在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)特异性结合于癌症标记的抗体；以及
(b)使用所述抗体的指导说明书。
通过以下详细描述和附图，本发明的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员将会是很明确的。
附图概述
图1显示了O-连接寡糖中的已知核心结构。
图2显示了N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-乙醇酰神经氨酸(NeuGc)的结构。
图3所示为选择性释放和分离用于MALDI-FTMS的O-连接寡糖的大致步骤的流程图。
图4所示为用10％乙腈洗脱的获自OVCAR-3的O-连接寡糖的阳离子(positive)(A)和阴离子(negative)(B)MALDI-FTMS质谱。
图5所示为用40％乙腈洗脱的获自OVCAR-3的O-连接寡糖的阳离子MALDI-FTMS质谱。
图6所示为具有对应于IHexNAc：1NeuGc(m/z 529.122)的组分的含NeuGc的离子种类的MALDI-FTMS质谱(插入图)和IRMPD图谱。
图7所示为含NeuAc的离子m/z 902.322的IRMPD图谱。
图8显示了4种卵巢癌细胞系中中性、硫酸化、NeuAc和NeuGc O-连接寡糖的分布。
图9所示为用20％乙腈洗脱的获自卵巢癌患者血清的O-连接寡糖的阴离子MALDI-FTMS质谱。
图10所示为用40％乙腈洗脱的获自卵巢癌患者血清的O-连接寡糖的阳离子MALDI-FTMS质谱。
图11显示了4种卵巢癌细胞系各自的蛋白质进行1-D凝胶分离的结果，其中采用Pro Q Emerald 300(A)或Sypro Ruby(B)染色。
图12所示为分离自CaOV-3的硫酸化O-连接寡糖的MALDI-FTMS质谱(A)和IRMPD图谱(B)。
图13所示为用20％乙腈洗脱的获自正常样品(A)、组III样品(B)和Lim 6样品(C)的O-连接寡糖的阳离子MALDI-FTMS质谱。
图14显示了在正常(A)、组I(B)、组II(C)、组III(D)和Lim 6(E)血清样品中鉴别的各类O-连接寡糖的百分比。
图15显示了4种硫酸化O-连接寡糖癌症标记的基本结构。
图16显示了4种含NeuAc的O-连接寡糖癌症标记的基本结构。
图17显示了4种含NeuGc的O-连接寡糖癌症标记的基本结构。
图18显示了3种中性O-连接寡糖癌症标记的基本结构。
图19所示为表13所列寡糖标记的质谱。
图20所示为表14所列寡糖标记的质谱。
发明详述
I.缩写
MALDI，矩阵辅助激光解吸电离；FTMS，傅里叶变换质谱法；IRMPD，红外多光子解离(infrared multiphoton dissociation)；Hex，己糖；Hex^*，乙酰己糖；HexA，己糖醛酸；HexNAc，N-乙酰氨基己糖；NeuAc，N-乙酰神经氨酸；NeuGc，N-乙醇酰神经氨酸；Fuc，海藻糖；SO₃H，硫酸根。
II.定义
除非另有说明，本文中所用的以下术语具有下述含义。
术语″癌症″是指各种恶性肿瘤中的任何一种，特征为倾向于侵入周围组织以及转移到新身体部位的间变(anaplastic)细胞的增殖。不同类型癌症的例子包括但不限于：卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、胸膜癌、胰腺癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、肛门癌、胆管癌、胃肠道良性肿瘤、食管癌、胆囊膀胱癌、直肠癌、盲肠癌、小肠癌、胃癌、肾癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌；以及骨肉瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病以及急性髓细胞性白血病。术语″腺癌″是指在腺性上皮中起源的各种恶性肿瘤中的任何一种，包括但不限于：卵巢癌和乳腺癌。
术语″样品″是指获自个体的任何生物试样。适用于本发明的样品包括但不限于：全血、血浆、血清、唾液、尿样、粪便、泪液以及任何其它体液或组织。在优选的实施方式中，所述样品是血清样品。该术语还包括获自细胞系的任何试样，包括但不限于：条件培养基和细胞提取物，例如膜提取物、细胞溶质提取物、核提取物等。本领域技术人员应理解在分析前可对样品例如血清和条件培养基进行稀释。
术语″标记″是指在生物样品中可检测并指示疾病、病症或者对疾病或病症的易感性的任何分子。所述标记优选为聚糖或糖分子(例如单糖、寡糖或多糖)。在本发明的优选实施方式中，所述标记是对具体类型的癌症具有特异性的独特的寡糖种类。作为非限制性的例子，所述独特的寡糖种类可为O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离(free)寡糖或它们的组合。
术语″癌症标记″是指可在个体中指示癌症的标记。该术语包括如下的分子：由癌细胞或正常细胞产生或存在于癌细胞或正常细胞上，但与正常细胞系或未患癌症个体的对照样品相比，该分子的水平在癌细胞系或患有癌症的患者的测试样品中受到调控。更具体而言，该术语包括但不限于：(1)由癌细胞特异性表达或特异性存在于癌细胞上、但在正常细胞中不表达或在正常细胞上不存在的分子；(2)在癌细胞中的表达较正常细胞中的表达提高的分子；(3)由正常细胞特异性表达或特异性存在于正常细胞上、但在癌细胞中不表达或在癌细胞上不存在的分子；以及(4)在癌细胞中的表达较正常细胞中的表达降低的分子。在本发明的优选实施方式中，所述癌症标记是O-连接寡糖。例如，所述O-连接寡糖可为硫酸化寡糖、含NeuAc的寡糖、含NeuGc的寡糖、含HexA的寡糖、含Hex的寡糖、中性寡糖或它们的组合。在其它实施方式中，所述癌症标记是N-连接寡糖或游离寡糖。
术语″游离寡糖″是指不与蛋白质结合的任何寡糖种类，包括但不限于：与脂质连接的寡糖。
术语″m/z″是指用离子的质量除以其电荷数得到的质核比。
术语″个体″是指任何动物，优选哺乳动物，更优选人。
术语″患有癌症的个体″是指在获取测试样品时已表现出一种或多种癌症相关症状的个体，或在获取样品时已预先诊断患有癌症的个体。
术语″未患癌症的个体″是指在获取测试样品时未表现出任何癌症相关症状的个体，在获取对照样品时已表现出癌症相关症状缓解的个体，或在获取对照样品时未表现出先前诊断癌症的任何复发。因此，未患癌症的个体与患有癌症的个体无需不同。例如，某一个体可在不同时间提供样品，例如一次在患有癌症之前取样(对照样品)和一次在患有癌症时取样(测试样品)，或从缓解或治疗后的个体中获得对照样品并与较早时(例如当该个体患有癌症时)获自相同个体的测试样品相比较。
术语″糖苷外切酶″是指选择性水解两个单糖间的连接键的酶。优选的，所述糖苷外切酶选择性地水解存在于寡糖(例如，O-连接或N-连接寡糖)中的两个单糖间的连接键。适宜的糖苷外切酶包括但不限于：岩藻糖苷酶，例如α1，2-岩藻糖苷酶、α1-3，4-岩藻糖苷酶和α1，6-岩藻糖苷酶；半乳糖苷酶，例如α1-3，6-半乳糖苷酶、β1，3-半乳糖苷酶、β1-3，6-半乳糖苷酶和β1，4-半乳糖苷酶；己糖胺酶，例如α-N-乙酰基-氨基半乳糖苷酶以及；β1-2，3，4，6-N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶：己糖酶，例如β-糖苷酶；甘露糖苷酶，例如α1-2，3-甘露糖苷酶、α1，6-甘露糖苷酶和β1，4-甘露糖苷酶；神经氨酸苷酶，例如α2-3，6-神经氨酸苷酶、β2-3，6，8-神经氨酸苷酶、α2-3，6，8，9-神经氨酸苷酶和α2，3-神经氨酸苷酶；木糖苷酶，例如β1，2-木糖苷酶；或它们的组合。
如本文所用，术语″阵列″是指固定在固相载体或基材上的不同核酸、肽、多肽、蛋白质或寡糖的阵列，所述固相载体或基材包括例如：纸、膜(如尼龙膜)、滤器、基片、针、珠、玻璃(如载玻片)或其它适宜的固相载体。优选地，所述阵列包含偶联在基材表面不同已知位置的多种不同寡糖种类(例如，O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离寡糖等)。
术语″治疗有效量″是指能在需要所述治疗的对象中获得治疗效果的抗体或其它治疗剂(例如，离子、小有机分子、肽、蛋白质、多肽、寡糖等)的量。例如抗体的治疗有效量可以是能预防或缓解一种或多种癌症相关症状的量。优选地，所述抗体结合于癌症特异性标记(例如，独特的寡糖种类)。
术语″癌症的阶段″是指本领域技术人员已知并广泛使用的癌症阶段分期体系，例如由美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer(AJCC))设计的分期体系。本领域技术人员理解具体癌症类型的分期取决于多种因素，这些因素包括但不限于：肿瘤大小、在器官中和向邻近器官的扩散程度、向淋巴结的扩散程度以及向远端器官的扩散程度(即转移)。用于具体癌症类型的AJCC分期体系通常将癌症划分为4个阶段(阶段I-IV)，各阶段任选地细分为亚阶段(例如，阶段IIIA、IIIB和IIIC)。如本文所用，术语″早期癌症″是指阶段I癌症，但也可指阶段II癌症或阶段II癌症的亚阶段(例如，阶段IIA)。术语″晚期癌症″在本文中是指阶段III或阶段IV癌症，但也可指阶段II癌症或阶段II癌症的亚阶段。本领域技术人员应理解根据癌症的具体类型，阶段II癌症可划分为早期癌症或晚期癌症。例如，术语″早期卵巢癌″是指阶段I或阶段IIA卵巢癌，而术语″晚期卵巢癌″是指阶段IIB-阶段IV的卵巢癌。
如本文所用，术语″给药(给予)″是指口服给药、作为栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下给药，或将缓释装置(例如小型渗透泵)植入对象。给药可通过任何途径进行，包括经胃肠道外和透粘膜(例如，经颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠粘膜或透皮)。胃肠道外给药包括例如：静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。其它递送模式包括但不限于：采用脂质体制剂、静脉灌注、透皮贴片等。本领域技术人员应知道用于给予治疗有效量的抗体或其它治疗剂以预防或缓解癌症相关的一种或多种症状的其它方法。
III.总体概况
本发明提供了用于鉴别癌症特异性寡糖的方法，以及用于在个体中确定癌症株的方法。本发明还提供了通过检测在个体中是否存在特异性的癌症标记来诊断癌症或癌症的阶段的方法，以及通过给予抗此类标记的抗体来治疗癌症的方法。此外，本发明提供了含O-连接寡糖的癌症标记，以及用于诊断或治疗癌症的试剂盒。
本发明基于以下发现，即从细胞系或血清中释放的O-连接寡糖是癌症的指示剂。虽然已尝试分析肿瘤、癌细胞系以及转染的上皮和类淋巴母细胞系(lyphoblastoid cell line)中的MUC1的差别糖基化，但它们有赖于使用单克隆抗体、凝集素或代谢性放射标记的碳水化合物。因此，这些研究严重受限于它们不能区分正常粘蛋白和癌症粘蛋白间糖基化的精确差别，这是因为获得用于详细结构信息的材料很有难度。然而，本发明通过采用质谱技术例如MALDI-傅里叶变换质谱法(FTMS)识别样品中的寡糖种类而克服了这些限制。具体而言，FTMS提供精确质量测定的能力(即，常规＜10ppm，有内校准时＜5ppm)对于获得基本寡糖组分是很重要的。另外，本发明的方法有利地采用了从样品中选择性地释放寡糖而无需进行分离步骤。此类寡糖尤其可用作在个体中检测癌症的标记。
IV.实施方式的描述
在一个方面，本发明提供了一种鉴别癌症特异性寡糖的方法，所述方法包括：
(a)从测试样品中选择性地释放所述寡糖，其中所述测试样品是获自癌细胞系或患有癌症的个体的样品；
(b)采用矩阵辅助激光解吸电离(MALDI)-傅里叶变换质谱法(FTMS)获得所述寡糖的质谱；以及
(c)将所述测试样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，
其中，通过所述测试样品的质谱中独特寡糖的存在来鉴别所述癌症特异性寡糖。
术语″选择性释放″是指本领域技术人员已知的、用于主要从样品中释放O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离寡糖、或它们的组合的方法。例如，采用硼氢化钠(NaBH₄)的方法(如Morelle等，Eur.J.Biochemistry，252：253-260(1998)中所述)和采用肼的方法(如Patel等，Biochemistry，32：679-693(1993)中所述)适于从样品中选择性释放O-连接寡糖。采用PNGase F的方法(如Fan等，J.Biol.Chem.，272：27058-27064(1997)；Tarentino等，MethodsEnzyMol.，230：44-57(1994)；和Trimble等，J.Biol.Chem.，266：1646-1651(1991)中所述)适于从样品中选择性释放N-连接寡糖。从样品中选择性释放游离寡糖的方法在，例如上文所述Morelle等的文献中有述。
对于O-连接寡糖，术语″选择性释放″包括从样品中释放至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的O-连接寡糖；以及从该样品中释放少于约30％，优选少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％所有的其它种类，例如非-O-连接寡糖(例如，N-连接寡糖)、蛋白质、肽和核酸。类似地，对于N-连接寡糖，该术语包括从样品中释放至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的N-连接寡糖；从该样品中释放少于约30％，优选少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％所有的其它种类，例如非-N-连接寡糖(例如，O-连接寡糖)、蛋白质、肽和核酸。同样，对于游离寡糖，该术语包括从样品中释放至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的游离寡糖；以及从该样品中释放少于约30％，优选少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％所有的其它种类，例如其它寡糖、蛋白质、肽和核酸。本领域技术人员应理解可从样品中选择性释放O-连接、N-连接和/或游离寡糖的组合。
术语″样品″是指获自个体的任何生物试样。适用于本发明的样品包括但不限于：全血、血浆、血清、唾液、尿样、粪便、泪液以及任何其它体液或组织。可通过本领域技术人员已知的任何方法从个体中获取样品。例如，可通过从个体抽血来获得全血样品。或者，可从血库或医师办公室获得全血样品。该术语还包括获自细胞系的任何试样，包括但不限于：条件培养基和细胞提取物，例如膜提取物、细胞溶质提取物、核提取物等。
如本文所用，术语″测试样品″是指获自癌细胞系或患有癌症的个体的样品。适宜的癌细胞系包括但不限于：卵巢癌细胞系，例如CaOV-3、OVCAR-3、ES-2、SK-OV-3、SW626、TOV-21G、TOV-112D、OV-90、MDA-H2774和PA-1；乳腺癌细胞系，例如MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、MDA-MD-453、BT-474、Hs578T、HCC1008、HCC1954、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1937、HCC2218、Hs574.T、Hs742.T、Hs605.T和Hs606；肺癌细胞系，例如NCI-H2126、NCI-H1395、NCI-H1437、NCI-H2009、NCI-H1672、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H1184、NCI-H209、NCI-H2107和NCI-H128；皮肤癌细胞系，例如COLO829、TE354.T、Hs925.T、WM-115和Hs688(A).T；骨癌细胞系，例如Hs919.T、Hs821.T、Hs820.T、Hs704.T、Hs707(A).T、Hs735.T、Hs860.T、Hs888.T、Hs889.T、Hs890.T和Hs709.T；结肠癌细胞系，例如Caco-2、DLD-1、HCT-116、HT-29和SW480；胃癌细胞系，例如RF-1；以及本领域技术人员已知的任何其它癌细胞系。用于本发明方法中的癌细胞系可获自，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)、国立癌症研究所或癌症中心或实验室，例如在戴维斯医疗中心的加利福尼亚州立大学(the University of California)。″患有癌症的个体″是指在获取测试样品时已表现出一种或多种癌症相关症状的个体，或在获取样品时已预先诊断患有癌症的个体。
如本文所用，术语″对照样品″是指获自正常细胞系或未患癌症的个体的样品。适宜的正常细胞系包括但不限于：卵巢细胞系，例如NOV-31；乳腺细胞系例如Hs578Bst；外周血细胞系，例如NCI-BL2126、NCI-BL1395、NCI-BL1437、NCI-BL2009、NCI-BL2122、NCI-BL2087、NCI-BL1672、NCI-BL2171、NCI-BL2195、NCI-BL1184、NCI-BL209、NCI-BL2107、NCI-BL128、NCI-BL2052、NCI-BL1770、HCC1007BL、HCC1954BL、HCC38BL、HCC1143BL、HCC1187BL、HCC1395BL、HCC1599BL、HCC1937BL、HCC2157BL、HCC2218BL和COLO829BL；肺细胞系，例如Hs888Lu；皮肤细胞系，例如Hs574.Sk、Hs742.Sk、Hs605.Sk、Hs606.Sk、TE353.Sk、Hs925.Sk、Hs919.Sk、Hs821.Sk、Hs820.Sk、Hs704.Sk、Hs707(B).Ep、Hs735.Sk、Hs889.Sk、Hs890.Sk、Hs709.Sk、Hs789.Sk和Hs814.Sk；结肠细胞系，例如CCD-18Co；以及本领域技术人员已知的任何其它正常细胞系。可从作为外科去除物获得的主要人体组织中分离和培养原代、未转化细胞，产生正常上皮细胞系(参见例如，Syed等，Cancer Res.，61：6768-6776(2001))。可从例如，ATCC(Manassas，VA)获得用于本发明的正常细胞系。″未患癌症的个体″是指在获取测试样品时未表现出任何癌症相关症状的个体，在获取对照样品时已表现出癌症相关症状缓解的个体，或在获取对照样品时未表现出先前诊断癌症的任何复发。
本领域技术人员应理解未患癌症的个体与患有癌症的个体无需不同。例如，某一个体可在不同时间提供样品，例如一次在患有癌症之前取样(对照样品)和一次在患有癌症时取样(测试样品)，或从缓解或治疗后的个体中获得对照样品并与较早时(例如当该个体患有癌症时)获自相同个体的测试样品相比较。
在本发明的方法中，获自测试样品和对照样品的寡糖(例如，O-连接、N-连接和/或游离寡糖)的质谱是采用质谱技术，例如矩阵辅助激光解吸电离(MALDI)-傅里叶变换质谱法(FTMS)获得的。MALDI尤为有利，因其有助于生物分子(例如碳水化合物、核酸和蛋白质)的解吸附和离子化而不会使其断裂。例如，Hillenkamp等，Anal.Chem.，63：1193A-1203A(1991)；Karas等，Anal.Chem.，60：2299-2301(1988)；和Stahl等，Anal.BioChem.，223：218-226(1994)中所描述的MALDI在生物分子中的应用。FTMS是一种分辨率很高的质谱技术，它基于以磁力捕集离子并激发/检测它们的回旋加速频率。因此，FTMS能提供精确的质谱测定结果，即通常为＜10ppm，有内校准时为＜5ppm。将MALDI-FTMS用于样品中的寡糖种类的鉴别在例如Tseng等，Anal.BioChem.，250：18-28(1997)和Tseng等，Anal.Chem.，71：3747-3754(1999)中有所描述。
如本文所用，术语″获得寡糖的质谱″是指对含有从样品中释放出的全部O-连接、N-连接和/或游离寡糖种类或其中部分的样品(即测试样品或对照样品)获得寡糖的分布。例如，当选择性释放出O-连接寡糖，并用诸如固相萃取法的技术在多孔石墨化碳(PGC)柱进行纯化时，根据所用溶剂的百分比(例如10％、20％、40％)和/或类型(例如，乙腈)，仅部分释放出的O-连接寡糖种类可从柱中洗脱出。对该部分获得的质谱可包含例如少于1％，至少1％，至少5％，至少10％，或至少20％释放的O-连接寡糖种类。本领域技术人员应理解，质谱中所存在的释放的O-连接、N-连接和/或游离寡糖种类部分也可取决于该质谱是在阳离子模式还是阴离子模式中获得的。
如本文所用，术语″比较测试样品的质谱与对照样品的质谱″是指比较或比对测试样品的质谱分布与对照样品的质谱分布，确定这两种质谱分布中的任何相似性和/或差异性。本领域技术人员应理解质谱分布可为一系列峰、一系列m/z比、一系列基本成分或适于比较获自测试样品的寡糖和对照样品的寡糖的任何其它形式。可在获得测试质谱分布的同时获得对照质谱分布，或可预先获得对照的质谱分布并存储于例如数据库中。本领域技术人员还应理解可用电脑(例如采用数据库)比较两种质谱分布。在某些例子中，采用例如峰匹配技术来用计算机软件程序比较和/或解释两种质谱分布。在某些其它例子中，采用互联网应用比较解释这两种质谱分布。
术语″通过所述测试样品的质谱中独特寡糖的存在鉴别癌症特异性寡糖″是指鉴别与对照样品相比在测试样品中的水平发生调控的O-连接、N-连接和/或游离寡糖。更具体而言，该术语包括：存在于测试样品中但不存在于对照样品中的任何O-连接、N-连接或游离寡糖种类；与对照样品相比在测试样品中的水平有所提高的任何O-连接、N-连接或游离寡糖；与对照样品相比在测试样品中的水平有所降低的任何O-连接、N-连接或游离寡糖；以及存在于对照样品中但不存在于测试样品中的任何O-连接、N-连接或游离寡糖种类。
在一个实施方式中，所述方法还包括对所述独特的一种或多种寡糖进行红外多光子解离(IRMPD)的步骤。使用IRMPD具有超出其它技术(例如碰撞诱导的解离(CID))的优点，这是因为IRMPD不会限制所观察产物离子的m/z范围、无需匹配共振频率和可获得更多序列信息(典型地可到达最后的残基)。因此，可在单次试验中对相当大的寡糖进行完全测序。在另一个实施方式中，所述方法还包括用糖苷外切酶消化所述独特的寡糖的步骤。优选地，所述糖苷外切酶选择性水解存在于所述寡糖中的两个单糖间的连接键。适用于本发明的糖苷外切酶包括以下的任何一种：上文所述的岩藻糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、己糖酶、甘露糖苷酶、神经氨酸苷酶和木糖苷酶，或本领域技术人员已知的任何其它糖苷外切酶。
在另一个实施方式中，所述独特的寡糖是选自下组的O-连接寡糖：硫酸化寡糖、含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神经氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它们的组合。
在另一实施方式中，所述寡糖在上述癌症中的任一种中具有特异性。优选地，所述癌症是卵巢癌或乳腺癌。在某些例子中，获自癌细胞系的测试样品和/或获自正常细胞系的对照样品是条件培养基。在某些其它例子中，获自患有癌症的个体的测试样品和/或获自未患癌症的个体的对照样品是血清。
在还有另一实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于用上述方法鉴别的独特寡糖的抗体。″抗体″是指包含能特异性结合和识别抗原(例如本发明的独特寡糖)的来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其片段。示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。各四聚体由两对不同的多肽链组成，各对链具有一条″轻″链(约25kDa)和一条″重″链(约50-70kDa)。轻链分为κ或λ轻链。重链分为γ、μ、α、δ或ε重链，它们分别定义了免疫球蛋白的类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。各链的N端定义了主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。各链的其余部分定义了在不同抗体中保守且具有低可变性的恒定区。各轻链含有一个恒定区(C_L)，而各重链含有三个恒定区(C_H1、C_H2、C_H3)。在抗体茎部中不同类型的恒定区根据其氨基酸序列产生具有不同特性的不同同种型。
抗体例如以完整免疫球蛋白形式存在，或是用各种肽酶消化产生的良好表征的片段形式，这些片段形式在本文中称为″抗体片段″。因此，例如，用胃蛋白酶消化抗体铰链区中二硫键的下方以产生F(ab)′₂即Fab二聚体(片段，抗原结合)，其本身是通过二硫键与VH-CHI结合的轻链。F(ab)′₂在温和条件下可还原以断裂铰链区的二硫键，由此将F(ab)′₂二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上由Fab组成，同时具有部分铰链区(参见《基础免疫学》“FundamentalImmunology”，Paul编，第3版，1993)。虽然用完整抗体的消化定义了各种抗体片段，本领域技术人员应理解可通过化学从头合成或使用重组DNA法从头合成这些片段。因此，如本文所用的术语抗体还包括通过对完整抗体的修饰产生的抗体片段或采用重组DNA法从头合成的那些抗体(例如，单链Fv)或采用噬菌体展示文库鉴别的那些抗体(参见例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。
对于抗体(例如重组、单克隆或多克隆抗体)的制备，可采用本领域已知的任何技术(参见例如，Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today，4：72(1983)；Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”第77-96页，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，《免疫学现有方法》，“Current Protocols in Immunology”(1991)；Harlow & Lane，《抗体，实验室指南》，“Antibodies，A LaboratoryManual”(1988)；以及Goding，《单克隆抗体：原理和实践》，“MonoclonalAntibodies：Principles and Practice”(第2版1986))。可从细胞中克隆编码感兴趣抗体的重链和轻链的基因，例如可从杂交瘤中克隆编码单克隆抗体的基因，并用于产生重组单克隆抗体。可从杂交瘤或浆细胞中制备编码单克隆抗体重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产生了大量具有不同抗原特异性的抗体(参见例如，Kuby，《免疫学》，“Immunology”(第3版1997))。可采纳用于产生单链抗体或重组抗体的技术(参见例如，美国专利4,816,567和4,946,778)来产生抗本发明寡糖的抗体。另外，可采用转基因小鼠或其它生物(例如其它哺乳动物)表达人化或人抗体(参见例如，美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等，Biotechnology，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14：845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology，14：826(1996)；和Lonberg & Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995))。或者，可采用噬菌体展示技术鉴别特异性结合于所选抗原的抗体和异聚Fab片段(参见例如，McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology，10：779-783(1992))。还可制备双特异性抗体，即能识别两种不同抗原的抗体(参见例如，WO 93/08829；Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)；和Suresh等，《酶学方法》，“Methods in Enzymology”，121：210(1986))。抗体还可为异源偶连物(heteroconjugate)，例如共价连接的两个抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利4,676,980；PCT申请WO 91/00360和WO 92/200373；以及EP 03089)。
″嵌合抗体″是具有如下特征的抗体分子，其中(a)使恒定区或其部分发生改变、取代或交换，从而使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变了类型、效应物功能和/或种类的恒定区连接，或与赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)连接；或(b)使可变区或其部分发生改变、取代、或与具有不同或改变的抗原特异性的可变区进行交换。例如，嵌合抗体在可变区中可包含小鼠蛋白质序列，在恒定区中可包含人蛋白质序列。″人化抗体″在可变区包含比嵌合抗体甚至更少的小鼠蛋白质序列。这些小鼠蛋白质序列已被然蛋白质序列取代。
在某些例子中，所述抗体还包括与其结合的可检测标记。可检测标记的例子包括但不限于：荧光素、罗丹明、得克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。本领域技术人员应知晓可检测标记的加入以及使具体的可检测标记与抗体偶联的适宜方法。
在另一实施方式中，本发明提供了一种在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：给予所述个体治疗有效量的特异性结合于独特寡糖的抗体。
在某些例子中，抗体的治疗有效量可为能预防或缓解一种或多种癌症相关症状的量。优选地，所述抗体结合于癌症特异性或对具体类型的癌症(例如卵巢癌或乳腺癌)具有特异性的独特寡糖。
另一方面，本发明提供了一种用于在个体中确定癌症株的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述测试样品的质谱与至少一种已知癌症株的质谱分布进行比较，
其中，通过所述测试样品的质谱与一种已知癌症株的质谱分布的相似性来确定所述癌症株。
术语″癌症株″是指相同种类的癌症组中(例如，卵巢癌)具有不同特性(例如，不同质谱分布)的成员。在一个实施方式中，所述癌症株是卵巢癌或乳腺癌株。本领域技术人员已知各种卵巢癌株，包括但不限于：CaOV-3、OVCAR-3、ES-2、SK-OV-3、SW626、TOV-21G、TOV-112D、OV-90、MDA-H2774和PA-1。本领域技术人员已知多种乳腺癌株，包括但不限于：MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、MDA-MD-453、BT-474、Hs578T、HCC1008、HCC1954、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1937、HCC2218、Hs574.T、Hs742.T、Hs605.T和Hs606。
如本文所用，术语″通过测定样品质谱和一种已知癌症株相似性来确定癌症株″是指测定样品的质谱与已知癌症株中的一种的质谱分布是否具有至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的相同性。优选地，样品的质谱最类似于已知癌症株中的一种。然而，本领域技术人员应理解样品的质谱可与多种已知癌症株的质谱分布相似。在这些例子中，可采用其它因素例如比较质谱分布中具体种类水平(例如，峰值强度)来确定个体中的癌症株。
另一方面，本发明提供了一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
检测获自所述个体的样品总是否存在独特的寡糖，其中所述独特寡糖的存在指示所述个体患有癌症。
在一个实施方式中，所述独特的寡糖选自下组：O-连接寡糖、N-连接寡糖、游离寡糖、或它们的组合。在某些例子中，检测所述独特的寡糖包括：(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及(b)确定所述质谱中所述独特寡糖的存在。在某些其它例子中，检测所述独特的寡糖包括使样品与特异性结合所述独特寡糖的抗体接触。
在还有另一方面，本发明提供了一种诊断个体中癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，
其中，所述样品中含NeuGc O-连接寡糖与含NeuAc O-连接寡糖的比例高于所述对照样品指示所述个体患有癌症。
在一个实施方式中，所述癌症是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。在另一个实施方式中，所述样品是血清。在某些例子中，比较样品的质谱和对照样品的质谱包括：计算样品质谱中含NeuGc O-连接寡糖与含NeuAc O-连接寡糖的比值，并将该计算所得的比值与对照样品中含NeuGc O-连接寡糖与含NeuAc O-连接寡糖的计算比值进行比较。如本文所用，术语″计算含NeuGc O-连接寡糖与含NeuAc O-连接寡糖的比值″是指测定质谱分布中存在的含NeuGc-和含NeuAcO-连接寡糖种类的数目，然后用含NeuGc O-连接寡糖种类的数目除以含NeuAcO-连接寡糖种类的数目。然而，本领域技术人员应知道其它计算NeuGc/NeuAc比值的方法，包括例如采用算法。可同时得到获自个体的对照样品和样品的NeuGc/NeuAc比，或者可先获得对照的NeuGc/NeuAc比并将其保存在例如数据库中。实施例8和图14说明了获自个体的对照(即正常)样品和一系列样品(即组I-III，Lim 6)的NeuGc/NeuAc比值的比较。
在还有一方面，本发明提供了一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)采用MALDI-FTMS，从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)将所述样品的质谱与对照样品的质谱进行比较，
其中，所述样品中硫酸化O-连接寡糖的百分比低于所述对照样品指示所述个体患有癌症。
在一个实施方式中，所述癌症是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。在另一个实施方式中，所述样品是血清。在某些例子中，比较样品的质谱与对照样品的质谱包括：计算样品质谱中的硫酸化O-连接寡糖的百分比，将该计算所得的百分比与由对照样品计算得到的硫酸化O-连接寡糖的百分比进行比较。如本文所用，术语″计算硫酸化O-连接寡糖的百分比″是指测定质谱分布中硫酸化O-连接寡糖种类的数目和O-连接寡糖种类的总数，然后用硫酸化O-连接寡糖种类的数目除以O-连接寡糖种类的总数。然后将比值乘以100使硫酸化/总O-连接寡糖的比值转化为百分比。然而，本领域技术人员应知道可采用其它方法计算O-连接寡糖的百分比，包括例如采用算法。优选地，质谱分布中存在的O-连接寡糖种类总数中包括：硫酸化O-连接寡糖、含NeuGc O-连接寡糖、含NeuAc O-连接寡糖、和/或中性O-连接寡糖。可同时得到获自个体的对照样品和样品的O-连接寡糖百分比，或者可先获得对照的硫酸化O-连接寡糖百分比并将其保存在例如数据库中。实施例8和图14说明了获自个体的对照(即正常)样品和一系列样品(即组I-III，Lim6)的硫酸化O-连接寡糖百分比的比较。
另一方面，本发明提供了一种在个体中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)测定在所述质谱中是否存在选自下组的癌症标记：硫酸化寡糖、含N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神经氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖或它们的组合，
其中，存在所述癌症标记指示所述个体患有癌症。
在某些例子中，所述癌症是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。优选地，所述样品是血清。在本发明的优选实施方式中，所述癌症标记是O-连接寡糖。在其它实施方式中，所述癌症标记是N-连接寡糖。在还有其它的实施方式中，所述癌症标记是游离寡糖。
在一个实施方式中，所述硫酸化寡糖是选自下组的组分：HexNAc:1Hex:1SO₃H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1 1SO₃H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO₃H；2HexNAc:3Hex:1SO₃H；4HexNAc:1Hex:1SO₃H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO₃H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO₃H；或它们的组合。在另一个实施方式中，所述含NeuAc的寡糖具有选自下组的组成：1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；或它们的组合。在另一实施方式中，所述含NeuGc的寡糖具有选自下组的组分：1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；或它们的组合。在还有另一实施方式中，所述中性寡糖具有选自下组的组分：1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它们的组合。在另一实施方式中，所述含Hex的寡糖具有选自下组的组分：2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex^*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex^*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex^*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex^*:4Hex:3HexNAc；2Hex^*:3Hex:1HexNAc；或它们的组合。在另一实施方式中，所述含HexA的寡糖具有选自下组的组分：m/z 221+[HexA]₁；m/z 221+[HexA]₂；m/z 221+[HexA]₃；m/z 221+[HexA]₄；m/z 221+[HexA]₅；m/z 221+[HexA]₆；m/z 221+[HexA]₇；m/z 361+[HexA]₁；m/z 361+[HexA]₂；m/z 361+[HexA]₃；m/z 361+[HexA]₄；m/z 361+[HexA]₅；m/z 361+[HexA]₆；m/z 551+[HexA]₁；m/z 551+[HexA]₂；m/z 551+[HexA]₃；m/z 551+[HexA]₄；m/z 551+[HexA]₅；m/z 555+[HexA]₁；m/z 555+[HexA]₂；m/z 555+[HexA]₃；m/z 604+[HexA]₁；m/z 604+[HexA]₂；m/z 604+[HexA]₃；m/z 604+[HexA]₄；或它们的组合。
另一方面，本发明提供了一种用于在个体中诊断癌症的阶段的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述个体的样品中获得寡糖的质谱，其中已从所述样品中选择性地释放出所述寡糖；以及
(b)测定在所述质谱中是否存在第一癌症标记，其中所述第一癌症标记选自：1HexNAc:1Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO₃H；2HexNAc:3Hex:1SO₃H；4HexNAc:1Hex:1SO₃H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；或它们的组合；以及
(c)测定在所述质谱中是否存在第二癌症标记，其中所述第二癌症标记选自：1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:1Hex:1SO₃H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO₃H；1HexNAc:2Fuc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它们的组合，
其中存在所述第一癌症标记而不存在所述第二癌症标记指示所述个体患有早期癌症，而存在第二癌症标记指示所述个体患有晚期癌症。
在一个实施方式中，所述早期癌症是早期卵巢癌。在某些例子中，所述早期卵巢癌与低CA 125水平相关。在另一个实施方式中，所述晚期癌症是晚期卵巢癌。在某些例子中，所述晚期卵巢癌与高CA 125水平相关。如本文所用，术语″早期卵巢癌″是指阶段I或阶段IIA卵巢癌，而术语″晚期卵巢癌″是指阶段IIB-阶段IV卵巢癌。实施例9说明了在早期卵巢癌和晚期卵巢癌是否存在上述各癌症标记。
在还有另一方面，本发明提供了一种癌症标记，其包含具有选自下组的组分的O-连接寡糖：1HexNAc:1Hex:1SO₃H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO₃H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO₃H；2HexNAc:3Hex:1SO₃H；4HexNAc:1Hex:1SO₃H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO₃H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO₃H；1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex；1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex^*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex^*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex^*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex^*:4Hex:3HexNAc；2Hex^*:3Hex：1HexNAc；m/z221+[HexA]₁；m/z221+[HexA]₂；m/z221+[HexA]₃；m/z221+[HexA]₄；m/z221+[HexA]₅；m/z221+[HexA]₆；m/z221+[HexA]₇；m/z361+[HexA]₁；m/z361+[HexA]₂；m/z361+[HexA]₃；m/z361+[HexA]₄；m/z361+[HexA]₅；m/z361+[HexA]₆；m/z551+[HexA]₁；m/z551+[HexA]₂；m/z551+[HexA]₃；m/z551+[HexA]₄；m/z551+[HexA]₅；m/z555+[HexA]₁；m/z555+[HexA]₂；m/z555+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₁；m/z604+[HexA]₂；m/z604+[HexA]₃；m/z604+[HexA]₄；或它们的组合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种特异性结合于O-连接寡糖的抗体。在某些例子中，所述抗体还包含与其结合的可检测标记。可检测标记的例子包括但不限于：荧光素、罗丹明、得克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
在还有一方面，本发明提供了一种在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：
给予所述个体治疗有效量的特异性结合于癌症标记的抗体。
在优选的实施方式中，抗体的治疗有效量为能够预防或缓解一种或多种癌症相关症状的量。
在另一实施方式中，本发明提供了一种寡糖阵列，该阵列包含固定于固相载体上的多种O-连接寡糖。适宜的固相载体的例子包括但不限于：纸、膜、滤器、芯片、针和玻璃。
另一方面，本发明提供了一种用于在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)含有多种癌症标记的阵列；
(b)特异性结合于所述阵列上的多种癌症标记的多种抗体；以及
(c)在获自所述个体的样品中使用所述阵列和所述多种抗体的指导说明书。
在某些例子中，所述多种抗体还可包含与其结合的可检测标记。可检测标记的例子如上所述。
另一方面，本发明提供了一种用于在需要癌症治疗的个体中治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)特异性结合于癌症标记的抗体；以及
(b)使用所述抗体的指导说明书。
V.癌症的糖生物学
糖基化作用对于生化环境高度敏感，其已涉及到发育和疾病(Dennis等，BioEssays，21：412-421(1999))。事实上，癌细胞产生与正常细胞明显不同的寡糖(Hollingsworth等，id；Dall′Olio等，GlyconJ.J：，18：841-850(2001)；Brockhausen，Biochim.Biophys.Acta，1473：67-95(1999)；Yogeeswaran，《癌症标记：诊断和发育中的重要性：，“Cancer Markers：Diagnostic andDevelopmental Significance”，Humana Press，Clifton，NJ，(1980)；Yamori等，Cancer Res.，47：2741-2747(1987)；Gorelik等，Cancer Metastasis Rev.，20：245-277(2001)》。另外，根据癌细胞的类型不同，可产生不同比例的特异性糖蛋白。
对粘蛋白及其寡糖的分析由于其大小和异质性而变得复杂。就其大小和异质性而言，CA 125是一种典型的粘蛋白糖蛋白，可将其作为粘蛋白复杂性以及对其进行分析的难度的有用例证。虽然已将CA 125广泛用作癌症标记且早在1983年就发现了CA 125，它的许多O-和N-聚糖结构是在最近才被表征的(Wong等，J.Biol.Chem.，278：28619-28634(2003))。CA 125的核心蛋白序列包含超过10,000个氨基酸，其分子量约为250万道尔顿(O′Brien等，Tumour Biol.，12：154-169(2002))。以该质量为基准计，CA 125的碳水化合物含量估计至少为25％，其中大部分是O-连接的聚糖。加合的质量表明CA125的平均分子量实际上约为350万道尔顿。
常发现腺癌中会产生高水平的粘蛋白。粘蛋白主要有两类：分泌型和细胞表面型。这两类具有许多相同的结构特征。由于糖基化对于生化环境的高度敏感，癌细胞产生与正常细胞明显不同的寡糖。因此，来自癌细胞的粘蛋白不仅过表达，而且还发生糖基化异常。虽然从分析的角度而言粘蛋白的重度O-糖基化使得它们更难处理，异常糖基化的粘蛋白却可作为细胞糖基化机构中分化依赖性波动的敏感指示剂。粘蛋白的过表达和粘蛋白的糖基化形式异常通常是继肿瘤细胞转化过程中粘蛋白核心蛋白及其修饰酶的异常表达之后发生的。
估计总蛋白中的50％是糖基化的，使其成为最常见的翻译后修饰形式。糖基化作用分为两类：O-和N-糖基化。N-糖基化是通过在蛋白质的天冬氨酰残基上加入N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)而起始的。然后通过起始的GlcNAc将第二个GlcNAc和三甘露糖基壳二糖基核心结构连接到该蛋白质上。
O-糖基化的结构复杂性远甚于N-糖基化。O-聚糖通常连接于蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基。O-糖基化起始发生的最常见形式是通过加入N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。例如，重度O-糖基化蛋白(例如粘蛋白)在重复的富含Ser-和Thr-肽基序中含有基于GalNAc的聚糖群。然而，与N-聚糖不同，至少已知有八种核心O-聚糖结构(图1)。核心1和核心2是最常见的。核心3和核心4与特异性组织相关，而其它核心结构则少量存在或存在于非常特定类型的癌细胞中。核心1和核心2的特征是Gal β1-3连接于起始的GalNAc。核心2是将GlcNAc通过β1-6连接进一步加到起始的GalNAc而形成的。
在正常细胞中，O-聚糖结构上的骨架区是如下形成的：加入重复二糖元件(例如Galβ1-4GlcNAc或Galβ1-3GlcNAc)以产生具有多达20个单糖残基的聚乳糖胺型(polylactosamine-type)结构。然后用其它类型的单糖残基截短这些重复单元，所述的单糖残基包括但不限于：海藻糖和唾液酸，(如N-乙酰神经氨酸(NeuAc)；图2)。糖基化事件序列在许多竞争性糖基转移酶的存在下发生，并产生寡糖间的精确连接。因为少数糖基化转移酶的缺失或过表达会极大地改变所得寡糖的结构，所以糖基化对于生化环境高度敏感。
在癌症中，结合的O-聚糖结构与正常细胞相比发生惊人的改变。例如，常可观察到截短的O-聚糖(Van den Steen等，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33：151-208(1998))。对乳腺癌细胞的研究揭示在大多数癌细胞中，MUCI上不存在基于核心2的聚乳糖胺，这是由UDP-GIcNAc/核心1β6-N-十六烷基葡萄胺基转移酶(C2GnT)的活性降低和/或缺乏造成的，该酶负责通过将β GlcNAc加到起始GalNAc残基的6位以形成核心。(Hanisch等，Eur.J BioChem.，236：318-327(1996)；Lloyd等，J.Biol.Chem.，271：33325-33334(1996)；Brockhausen等，Eur.J.BioChem.，233：607-617(1995))。由此形成了前体结构(例如GalNAc-Ser/Thr和Gal β1-3GalNAc-Ser/Thr)，并成为唾液酸转移酶的底物。唾液酸的加入在正常细胞中是一种重要的功能。已克隆的不同唾液酸转移酶的数量大致达到了20种，这是对该反应重要性的一种证明(HarduiN-Lepers等，Biochemie，83：727-737(2001))。唾液酸作为生物合成终止物防止了聚糖链的进一步延伸。例如，α3-和α6-唾液酸转移酶的过表达造成产生具有短聚糖链和高度唾液酸化的粘蛋白。将此类短链寡糖作为临床重要的肿瘤抗原已引起了很大的兴趣，其中包括众所周知的唾液酸-Tn(sialyl-Tn，STn)抗原(Sia α2，6-GalNAc-O-Ser/Thr)(Dall′Olio等，GlyconJ.J，18：841-850(2001)；Yonezawa等，Am.J.Clin.Pathol.，98：167-174(1992)；Itzkowitz等，Cancer Res.，49：197-204(1989)；Thor等，Cancer Res.，46：3118-3124(1986)；Werther等，Br.J.Cancer，69：613-616(1994))。包括乳腺癌和卵巢癌在内的大多数腺癌表达STn。相反，在正常组织中极少存在STn。其它短链寡糖包括唾液酸-路易斯酸x(Si-Le^x，NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc)和唾液酸-路易斯酸a(Si-Lea，NeuAcα2-3Galβ1-3[Fucα1 -4]GlcNAc)，它们被用于检测胃肠道和胰腺癌(Fernandez-Rodriguez等，GlyconJ.J.，18：925-930(2001))。
癌细胞中蛋白质糖基化的另一变化是加入在人体中不常见的唾液酸类型，即N-乙醇酰神经氨酸(NeuGc)(图2)。NeuGc富含于其它哺乳动物(例如大型猿类)中，但在人体中仅以痕量存在(Varki，Biochimie，83：615-622(2001)；Malykh等，Biochimie，83：623-634(2001))。事实上，人体中NeuGc的量通常少于唾液酸总量的1％。确信NeuGc不是在人类中起源的，而是通过代谢加入的。虽然已报道了在获自肿瘤组织和癌症患者的细胞中NeuGc表达上调，癌组织中提高水平NeuGc的存在仍然是有争议的(Tangvoranuntakul等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，100：12045-12050(2003))。证实NeuGc存在的问题在于分析的方法，大部分研究仅采用抗体分析监测NeuGc水平。然而，已采用液相色谱-质谱(LC-MS)，从经唾液酸酶处理的获自子宫粘膜癌患者腹水的粘蛋白中检测到了NeuGc残基(Devine等，Cancer Res.，51：5826-5836(1991))，并通过气相色谱(GC)-MS从分离自乳腺管癌(ductal mammary carcinoma)的粘蛋白中检测到了NeuGc残基(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236：318-327(1996))。
正常细胞和癌细胞间硫酸化寡糖数量的差异代表了癌细胞中蛋白质糖基化的另一变化。硫酸化寡糖通常为糖蛋白(例如粘蛋白)加入净负电荷。寡糖上的硫酸根掩蔽了下方的抗原，并保护粘蛋白免遭细菌糖苷酶的降解。硫酸化寡糖还涉及到细胞粘附、生长因子递呈、细胞信号传导以及炎症(Delcommenne等，《糖生物学》，“Glycobiology”，12：613-622(2002))。在寡糖的生物合成中，硫酸化作用能阻断通道、使分枝转向并延长反应(Brockhausen，BioChem.Soc.Trans.，31：318-325(2003))。已报道癌性结肠粘膜中粘蛋白的硫酸根含量降低(Yamori等，Cancer Res.，47：2741-2747(1987)；Raouf等，Clin.Sci，83：623-626(1992))，在乳腺癌细胞中也是如此(Brockhausen等，Eur.J.BioChem.，233：607-617(1995))。也已分离出特异性粘蛋白降解硫酸酶，表明这些酶的机能亢进导致粘蛋白的低硫酸化(Corfield等，GlyconJ.J.，13：809-822(1996))。
VI.寡糖的质谱
[0113]可由9种人体中常见单糖组装而成且具有连接键、分枝和端基异构性变化的超过1500万种四糖中，寡糖的复杂性是显而易见的。另外，许多常见单糖是具有相同质量的立体异构体。已开发了运用核磁共振(NMR)和质谱对寡糖进行结构阐明的多种策略。NMR是可提供寡糖完整结构的仅有的一种光谱法；然而，灵敏度的限制妨碍了将NMR用于几乎全部最丰富种类的寡糖(Plancke等，Eur.J.BioChem.，231：434-439(1995)；Strecker等，《糖生物学》，“Glycobiology”，5：137-146(1995)；Dell等，Carbohydr.Res.，115：41-52(1983))。该分析也是复杂的，且需要漫长的测试和解读NMR谱。另外，由于寡糖样品常是高度异质并含有丰度可相差多个量级的多种成分，通常需要进行严格的分离以便用NMR进行清楚的说明。
结构异质性、复杂性和样品的限制使得寡糖分析极适于用质谱法(MS)进行。例如，已采用质谱法从粘蛋白中鉴别除了O-连接寡糖，例如MUC2(Alving等，J.Mass Spectrom.，34：395-407(1999))和MUC4(Alving等，J.MassSpectrom.，33：1124-1133(1998))。也已采用高速原子轰击(FAB)-MS和气相色谱(GC)-MS鉴别了与乳腺癌相关的O-连接寡糖MUC1(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236：318-327(1996))。另外，通过质谱表征了与CA 125相关的N-和O-聚糖(MUC16)(Wong等，J.Biol.Chem.，278：28619-28634(2003))。
矩阵辅助激光解吸电离(MALDI)(Karas等，Anal.Chem.，60：2299-2301(1988))和电喷射离子化(ESI)(Fenn等，Science，246：64-71(1989)；Yamashita等，J.Phys.Chem.，88：4451-4459(1984))的应用显著提高了寡糖质谱的灵敏度(Spengler等，Anal.Chem.，62：1731-1737(1990)；Stahl等，Anal.Chem.，63：1463-1466(1991)；Powell等，Rapid Commun.Mass Spectrom.，10：1027-1032(1996)；Harvey等，Org.Mass Spectrom.，29：753-766(1994)；Cancilla等，Anal.Chem.，70：663-672(1998))。碰撞诱导的解离(CID)提供了大量的结构信息。例如，碱金属配位种类(alkali metal-coordinated species)的CID提供了关于分枝和连接键的信息(Dell等，Carbohydr.Res.，115：41-52(1983)；Aubagnac等，Org.MassSpectrom.，18：361-364(1983)；Barofsky等，Int.J.MassSpectrom.Ion Phys.，53：319-322(1983)；Burlingame等，Anal.Chem.，56：417R-467R(1984)；Burlingame等，Anal.Chem.，58：165R-211R(1986)；Carroll等，Anal.Chem.，65：1582-1587(1993)；Dell等，Mass Spectrom.Rev.，3：357-394(1984)；Domon等，Glycoconjugate J.，5：397-409(1988)；Angel等，Carbohydrate Research，221：17-35(1991)；Dell等，Int.J.MassSpectrom.IonPhys。，46：415-420(1983)；Dell等，Carbohydr.Res.，120：95-111(1983)；Forsberg等，J.Biol.Chem.，257：3555-3563(1982)；Konig等，J.Am.Soc.MassSpectrom.，9：1125-1134(1998))。甚至可通过将寡糖与过渡金属配位，然后进行ESI和CID来获得立体化学信息(Konig等，同前)。然而，采用CID的结构测定需要进行多轮串联MS，以获得完整的寡糖序列。带有吡喃糖还原端的寡糖的CID还可产生海藻糖(一种常见的端末残基)的无差别缺失，因此掩蔽了其在链中的位置(Cancilla等，J.Am.Chem.Soc.，118：6736-6745(1996)；Penn等，Anal.Chem.，68：2331-2339(1996))。另外，CID中还遇到通过分子内重排造成的内部糖残基缺失的困难(Brull等，J.Am。Soc.Mass Spectrom.，8：43-49(1997))。
本发明通过采用IRMPD测定寡糖结构克服了这些缺陷。采用IRMPD有其优点，这是因为可获得直到最末残基的代表性寡糖片段。由此，可在单次试验中完成对甚至较大的寡糖的完全测序。在进行IRMPD分析之前，采用串联质谱技术(例如MALDI-傅里叶变换质谱法(FTMS))来鉴别样品中的寡糖种类(参见Tseng等，Anal.BioChem.，250：18-28(1997)；Tseng等，Anal.Chem.，71：3747-3754(1999))。具体而言，FTMS提供了精确的质量测定(即，常规＜10ppm，有内校准时＜5ppm)的能力对于获得基本的寡糖组成是很重要的。例如，在m/z 2201.819具有准分子离子的寡糖在±0.1质量单位的公差中具有三种可能的组分。仅具有0.01质量单位的公差的是所得的校正组合物：2个海藻糖(Fuc)、4个己糖(Hex)和6个N-乙酰氨基己糖(HexNAc)。根据本发明的方法使用MALDI-FTMS可从多种可能的组成中提供正确的组成。用MALDI产生的离子进行多阶段的串联MS的能力是本发明质谱方法的另一重要特征。
VII.实施例
提供以下实施例是为了说明，而不是为了限制所要求的发明。
实施例1.对卵巢癌细胞系上清液的分析
本实施例举例说明了获自4种卵巢癌细胞系上清液中的O-连接寡糖的提取和质谱分析。
图3所示为释放和分离O-连接寡糖的过程。其相对较快且无需HPLC分离。事实上，可在短于12小时的时间内完成从提取O-连接寡糖到质谱分析的整个过程。用固相萃取法对寡糖成分进行预浓缩，然后不经任何其它纯化，用质谱法分析整个混合物。该过程仅需使用1.0μl的细胞上清液(相当于22μg的冻干原料)来获得全面的O-连接寡糖分布。
对上清液进行透析以去除大部分盐类和小分子。所余的均为大的蛋白质，包括所有糖基化的蛋白质。在优化条件下，用硼氢化钠(NaBH₄)释放大部分O-连接寡糖(Morelle等，Eur.J.Biochemistry，252：253-260(1998))。同样地，通过选择仅适于O-连接寡糖的释放条件(例如温度和时间)使N-连接寡糖的释放最小化。其实，仔细检查根据上述方法制备的样品的质谱会发现不存在N-连接寡糖，该N-连接寡糖可很容易地由其较大的尺寸和特殊核心的存在鉴别出。用多孔石墨化碳(PGC)固相萃取装置进行寡糖成分的浓缩。这些柱体易于结合中性和阴离子性寡糖。盐类很容易通过，而保留了肽和蛋白质。通过采用适当的洗脱溶剂组合，可从阴离子性成分中单独分离出中性寡糖。
检测了对数期和死亡期(log and dead phase)的卵巢癌细胞系(表1)。在指定的细胞培养基中培养卵巢癌细胞系，该培养基中补充有：10％胎牛血清、100单位/ml的青霉素/链霉素和1％谷氨酰胺。在McCoy氏培养基中培养ES-2和SKOV-3细胞，在RPMI 1640培养基中培养OVCAR-3和CaOV-3细胞。从处于细胞生长对数期(非融合)或死亡期(融合)的细胞去除条件培养基，并冷冻到-70℃。使CM解冻，无菌过滤(0.2μm的滤器)，用Vivacell 70或Vivaspin 20浓缩器(VivaScience)进行浓缩。或者，用蒸馏水对滤过的CM进行透析，然后冷冻干燥。然后按照图3所示的过程对所得溶液进行处理。为了使分析时间最短，未尝试对寡糖成分进行分离。用纳米纯水透析细胞培养上清液(10k MW截留)以去除盐类和小分子。所得溶液仅含包括粘蛋白在内的大蛋白质。然后冷冻干燥该溶液，用NaBH₄和NaOH在42℃下处理6小时。在这些条件下，仅释放出O-连接寡糖。使样品通过带有PGC的固相萃取柱以释放硼酸盐和钠离子，并分离寡糖成分。用3种乙腈和水比例的洗脱液释放寡糖。用递增的乙腈水溶液百分比(即10％、20％和40％)获得三个部分。作为对照，根据图3所示的过程对空白培养基和纯胎牛血清(FBS)进行处理。从两种对照样品中得到了少于测试样品中寡糖数量两个数量级的少量寡糖(＜10)。另外，未在测试样品中观察到对照样品中的任何一种寡糖。
表1.卵巢癌细胞系