丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症药物中的应用.pdf

本发明涉及天然药物技术领域，尤其涉及丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症药物中的应用。丹参酮IIA可抑制APE1的氧化还原功能，并通过抑制APE1氧化还原功能直接杀伤肿瘤细胞；丹参酮IIA还可逆转肿瘤细胞中因APE1的高表达而造成的氧化还原功能过度活化，抑制肿瘤细胞的增殖、浸润，逆转肿瘤细胞的抗凋亡并预防肿瘤细胞的转移；丹参酮IIA还可以逆转肿瘤细胞中由于APE1高表达而导致的肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。并且，丹参酮IIA在具有较强抗癌和化疗增敏性的同时，具有较小的毒副作用的使用开发前途。

权利要求书丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用。
丹参酮IIA在制备治疗癌症的辅助剂和/或化疗增敏剂中的应用。
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗癌症的辅助剂为化学药物或生物制剂。
一种治疗癌症的辅助剂，其特征在于，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。
根据权利要求4所述的治疗癌症的辅助剂，其特征在于，所述辅助剂为口服剂或注射剂。
根据权利要求5所述的治疗癌症的辅助剂，其特征在于，所述口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化疗增敏剂为化学药物或生物制剂。
一种化疗增敏剂，其特征在于，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。
根据权利要求8所述的化疗增敏剂，其特征在于，所述增敏剂为口服剂或注射剂。
根据权利要求9所述的化疗增敏剂，其特征在于，所述口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。

说明书丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症药物中的应用
技术领域
本发明涉及天然药物技术领域，尤其涉及丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症药物中的应用。 
背景技术
随着生活水平的提高及环境污染的加重，恶性肿瘤的发病率有逐年上升的趋势，目前已被临床界定为常见病、多发病，严重威胁了人类的健康。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子（Apurinic aprimidinic endonuclease1/Redox factor‑1，APE1/Ref‑1）是生物大分子功能复合体的范例，一方面APE1具有DNA修复活性，它作为AP核酸内切酶是DNA碱基切除修复（base excision repair，BER）途径的主要限速酶之一；另一方面APE1还可通过其独有的氧化还原功能调控关键转录因子的DNA结合活性，所述关键转录因子包括NF‑κB，AP‑1，HIF‑1α，Egr‑1，p53，PEBP2，Myb及Pax5、8等。这些转录因子的激活需要其DNA结合结构域——关键半胱氨酸残基维持还原状态，而APE1则通过改变这些活性位点的氧化还原状态，发挥“基因开关”的作用。因此，APE1是连接DNA碱基切除修复、转录因子的氧化还原调控和氧化应激等重要生物学效应的桥梁，对细胞的存活有着至关重要的意义。 
目前，研究发现APE1在多种肿瘤中的表达均高于正常组织，利用免疫组织化学和Western blot等方法进行定量研究，结果表明：在多种恶性肿瘤组织中APE1的表达水平明显升高（其高表达率在72%~90%），其中恶性肿瘤组织包括肝癌、骨肉瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、大肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、脑胶质瘤和宫颈癌等。经证实，APE1的高表达可能是肿瘤发生的早期事件，其表达强度的改变与肿瘤的发生和进展密切相关，而且，APE1高表达与骨肉瘤、脑胶质瘤和非小细胞肺癌患者预后不良密切相关。此外，越来越多的研究结果表明用siRNA敲除肿瘤细胞内源性的APE1能增加细胞对DNA损伤剂的敏感性，所述DNA损伤剂包括：甲磺酸甲酯（MMS），替莫唑胺（TMZ）， 依托泊苷，博来霉素、顺铂及电离辐射。相反，肿瘤细胞内过表达APE1则可促进肿瘤细胞对放化疗的抵抗。 
近年来，围绕APE1氧化还原功能的研究日渐增多，突显出氧化还原功能的重要性。Gianluca Tell课题组通过分析APE1蛋白相互作用组学，为APE1功能的多元化提供了实验依据。实验表明：蛋白与APE1发生互作依赖于位于APE1氨基酸链N端的氧化还原功能域的完整结构，这些可与APE1发生互作的蛋白包括：1）BER或其他DNA修复途径的酶；2）识别DNA损伤的酶或蛋白；3）抗氧化酶；4）转录因子；5）涉及APE1转录后修饰的酶；6）参与RNA代谢的酶。由此证明，氧化还原功能作为APE1蛋白在进化过程中获得的新功能，参与了广泛的生物调控过程，包括：线粒体功能，抗氧化体系激活以及细胞周期、凋亡，甚至对APE1的DNA修复功能也有重要的影响。 
大量植物提取物和天然产物及其衍生物中存在大量具有清热解毒和抗氧化的成分，采用生物传感器测定和虚拟分子对接的方法发现，中药中确实存在一些与APE1氧化还原功能域药物活性位点具有较强亲和力的组分。这也可能是很多中药和保健食物发挥抗癌效用的重要原因。因此，从天然产物中寻取APE1氧化还原功能的抑制剂，逐渐成为抗癌手段的一个新的重要途径。 
丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza）的干燥根及根茎，在中国使用已有几百年历史，广泛地用于心血管疾病的治疗。其药理学研究表明，丹参对心脑血管系统、消化系统、呼吸系统、中枢神经系统、免疫系统等均有保护作用。 
自20世纪30年代以来，国内外学者对丹参的活性成分和药理作用进行了大量研究，并纯化得到了许多化学成分。在丹参的乙醚或乙醇提取物中，均含有一类具有邻醌或对醌的结构的化合物，这些化合物总称为丹参酮类化合物，被认为是丹参中的主要活性成分之一。其中丹参酮IIA（tanshinone IIA）的结构如式I所示，具有抗肿瘤、抗炎、心肌保护等多种生物活性。但是对其选择性地抑制APE1的氧化还原功能尚无研究报道。 

式I 
发明内容
有鉴于此，本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症药物中的应用，丹参酮IIA可抑制APE1的氧化还原功能，并通过抑制APE1氧化还原功能直接杀伤肿瘤细胞。 
本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用。 
本发明还提供了丹参酮IIA在制备治疗癌症的辅助剂和/或化疗增敏剂中的应用。 
目前，癌症的治疗以手术及放/化疗为主，但由于放/化疗常见明显的副作用，因此，近年来不断有新的癌症辅助疗法出现，目的在于加强放/化疗效果而减轻副作用，以提高病患的生活品质，进而延长生命。治疗癌症的辅助剂是在治疗过程中为提高治疗效果采取的辅助性的抗癌药剂，化疗增敏剂是指通过逆转肿瘤组织耐药而提高化疗疗效的药剂。丹参酮IIA作为丹参中的活性物质，具有抗癌作用的同时还具有广泛的生物活性，因此非常适合用于制备治疗癌症的辅助剂和/或化疗增敏剂。 
优选地，本发明提供的治疗癌症的辅助剂为化学药物或生物制剂。 
丹参酮IIA通过抑制APE1的氧化还原功能可杀伤肿瘤细胞。并且，丹参酮IIA可逆转肿瘤细胞中APE1的高表达，从而抑制氧化还原功能过度活化，抑制肿瘤细胞的增殖和浸润，逆转肿瘤细胞的抗凋亡并预防肿瘤细胞转移。 
在此基础上，本发明提供了一种治疗癌症的辅助剂，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。 
优选地，本发明提供的治疗癌症的辅助剂为口服剂或注射剂。 
优选地，本发明提供的治疗癌症的辅助剂的口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。 
优选地，本发明提供的化疗增敏剂为化学药物或生物制剂。 
本发明还提供了一种化疗增敏剂，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。 
优选地，本发明提供的化疗增敏剂为口服剂或注射剂。 
优选地，本发明提供的化疗增敏剂的口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。 
与现有技术相比，本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症的辅助剂和/或抗癌增敏剂中的应用。丹参酮IIA可抑制APE1的氧化还原功能，并通过抑制APE1氧化还原功能直接杀伤肿瘤细胞。另外，丹参酮IIA可逆转肿瘤细胞中因APE1的高表达而造成的氧化还原功能过度活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖、浸润，逆转肿瘤细胞的抗凋亡并预防肿瘤细胞的转移。因此，丹参酮IIA可提高肿瘤细胞对依托泊苷化疗敏感性，可用于制备癌症治疗辅助剂。另外，丹参酮IIA还可以逆转肿瘤细胞中由于APE1高表达而导致的肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，因此可用于制备抗癌增敏剂。在人宫颈癌细胞（Hela）试验中，丹参酮IIA对肿瘤细胞的杀伤效应具有时间和剂量依赖性，其IC50均在30mol/L以下；并且，丹参酮IIA可有效地抑制APE1氧化还原功能介导的NF‑κB，AP‑1和HIF‑1α与DNA结合的活性；在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）试验中，丹参酮IIA对正常细胞无明显毒性。由此可见丹参酮IIA可以作为APE1氧化还原功能的特异性抑制剂，具有较强抗癌和化疗增敏性，以及较小毒副作用的使用开发前途。 
附图说明
图1所示为丹参酮IIA对Hela细胞增殖的抑制，其中，横坐标为时间，纵坐标为Hela细胞增殖百分比，曲线1示未添加丹参酮IIA的Hela细胞的增殖情况，曲线2示Hela细胞中添加丹参酮IIA使其终浓度为2μmol/mL的增殖情况，曲线3示Hela细胞中添加丹参酮IIA使其终浓度为4μmol/mL的增殖情况，曲线4示Hela细胞中添加丹参酮IIA使其终浓度为8μmol/mL的增殖情况，曲线5示Hela细胞中添加丹参酮IIA使其终浓度为16μmol/mL的增殖情况，曲线6示Hela细胞中添加丹参酮IIA使其终浓度为32μmol/mL的增殖情况；结果显示，未添加丹参酮IIA的Hela细胞的增殖率最高，在72小时后，达到了250%以上，而添加了丹参酮IIA的Hela细胞的增殖率明显下降； 
图2表示四组Hela细胞模型的内源性APE1蛋白敲低和外源性APE1蛋白表达的情况，其中，Control为对照细胞株；APE1shRNA为APE1稳定敲低细胞株；APE1wt为表达外源性APE1蛋白的细胞株；APE1C65S为表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株； 
图3表示APE1稳定敲低及APE1氧化还原缺失对丹参酮IIA肿瘤杀伤效应的影响，其中，纵坐标为Hela细胞增殖百分比，APE1‑wt示表达外源性APE1蛋白的Hela细胞株，APE1‑shRNA示APE1稳定敲低的Hela细胞株，APE1‑C65s示表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，■示为未添加丹参酮IIA的Hela细胞增殖率，■示为添加丹参酮IIA使其终浓度为8μmol/mL的Hela细胞增殖率，■示为添加丹参酮IIA使其终浓度为16μmol/mL的Hela细胞增殖率，＊表示在P<0.05条件下，与未添加丹参酮IIA的表达外源性APE1蛋白的Hela细胞株的增值率具有显著差异的细胞株，结果表明，APE1稳定敲低或者表达APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，其肿瘤细胞增殖率明显低于表达APE1野生型蛋白的细胞株，说明APE1氧化还原功能对肿瘤细胞的增殖具有重要的作用；并且，表达APE1野生型蛋白的细胞株，丹参酮IIA的对肿瘤细胞增殖的抑制效率为50%以上，但是APE1稳定敲低或者表达APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，丹参酮IIA对肿瘤细胞增殖的抑制效率下降至为10%以下，说明APE1氧化还原功能是丹参酮IIA发挥作用的重要靶点，而添加丹参酮IIA对Hela细胞的增殖率有明显的抑制作用； 
图4示丹参酮IIA对APE1的氧化还原功能介导的NF‑κB的DNA结合活性的影响，其中，APE1wt示表达外源性APE1蛋白的Hela细胞株，APE1shRNA示APE1稳定敲低的Hela细胞株，APE1C65S示表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，各泳道所示样品中丹参酮IIA的添加量从左至右依次为0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL，Free probe所指为未经结合的生物素标记的NF‑κB序列探针，NF‑κB binding所指为与探针发生结合的NF‑κB，结果表明，丹参酮IIA可有效地抑制APE1redox功能介导的NF‑κB的DNA结合活性； 
图5示丹参酮IIA对APE1的氧化还原功能介导的AP‑1的DNA结合活性的影响，其中，APE1wt示表达外源性APE1蛋白的Hela细胞株，APE1shRNA 示APE1稳定敲低的Hela细胞株，APE1C65S示表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，各泳道所示样品中丹参酮IIA的添加量从左至右依次为0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL，Free probe所指为未经结合的生物素标记的AP‑1序列探针，AP‑1binding所指为与探针发生结合的AP‑1，结果表明，丹参酮IIA可有效地抑制APE1redox功能介导的AP‑1的DNA结合活性； 
图6示丹参酮IIA对APE1的氧化还原功能介导的HIF‑1α的DNA结合活性的影响，其中，APE1wt示表达外源性APE1蛋白的Hela细胞株，APE1shRNA示APE1稳定敲低的Hela细胞株，APE1C65S示表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株，各泳道所示样品中丹参酮IIA的添加量从左至右依次为0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL、0μmol/mL、8μmol/mL、16μmol/mL，Free probe所指为未经结合的生物素标记的HIF‑1α序列探针HIF‑1α binding所指为与探针发生结合的HIF‑1α，结果表明，丹参酮IIA可有效地抑制APE1redox功能介导的HIF‑1α 的DNA结合活性； 
图7示丹参酮IIA对依托泊苷肿瘤杀伤效应的影响，纵坐标为Hela细胞增殖百分比，柱1示仅添加依托泊苷的Hela细胞，柱2示添加依托泊苷和终浓度为8μmol/L的丹参酮IIA的Hela细胞，柱3示添加依托泊苷和终浓度为16μmol/L的丹参酮IIA的Hela细胞，■示为Hela细胞的增殖率，■示为依托泊苷对Hela细胞增殖的抑制率，■示为丹参酮IIA对Hela细胞增殖的抑制率，结果表明，丹参酮IIA的存在可较大幅度地提高肿瘤细胞对依托泊苷化疗敏感性，且敏感性随丹参酮IIA剂量的增加而增加； 
图8示丹参酮IIA对HUVEC细胞增殖的影响，其中，横坐标为时间，纵坐标为HUVEC细胞增殖百分比，以未添加丹参酮IIA的HUVEC的细胞增值率为100%，对添加了丹参酮IIA的HUVEC细胞的增殖率进行计算，■示为未添加丹参酮IIA的HUVEC细胞增殖率■示为添加丹参酮IIA使其终浓度为8μmol/mL的HUVEC细胞增殖率，■示为添加丹参酮IIA使其终浓度为16μmol/mL的HUVEC细胞增殖率，经过72小时的实验，添加了丹参酮IIA的HUVEC细胞的增殖率与未添加丹参酮IIA的HUVEC的增殖率无显著差异，表明丹参酮IIA对正常细胞无明显毒性。 
具体实施方式
本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症的辅助剂和/或抗癌增敏剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 
本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用。 
本发明还提供了丹参酮IIA在制备治疗癌症的辅助剂和/或化疗增敏剂中的应用。 
本发明提供的治疗癌症的辅助剂为化学药物或生物制剂。 
丹参酮IIA通过抑制APE1的氧化还原功能可杀伤肿瘤细胞。并且，丹参酮IIA可逆转肿瘤细胞中APE1的高表达，从而抑制氧化还原功能过度活化，抑制肿瘤细胞的增殖和浸润，逆转肿瘤细胞的抗凋亡并预防肿瘤细胞转移。 
在此基础上，本发明提供了一种治疗癌症的辅助剂，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。 
本发明提供的治疗癌症的辅助剂为口服剂或注射剂。 
为方便使用，本发明提供的治疗癌症的辅助剂的口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。 
本发明提供的化疗增敏剂为化学药物或生物制剂。 
另外，本发明还提供了一种化疗增敏剂，包括丹参酮IIA及药学上可接受的辅料。 
本发明提供的化疗增敏剂为口服剂或注射剂。 
为方便使用，本发明提供的化疗增敏剂的口服剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。 
本发明提供了丹参酮IIA作为APE1氧化还原功能抑制剂的应用及其在制备治疗癌症的辅助剂和/或抗癌增敏剂中的应用。丹参酮IIA可抑制APE1的氧化还原功能，并通过抑制APE1氧化还原功能直接杀伤肿瘤细胞。另外，丹 参酮IIA可逆转肿瘤细胞中因APE1的高表达而造成的氧化还原功能过度活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖、浸润，逆转肿瘤细胞的抗凋亡并预防肿瘤细胞的转移。因此，丹参酮IIA可提高肿瘤细胞对依托泊苷化疗敏感性，可用于制备癌症治疗辅助剂。另外，丹参酮IIA还可以逆转肿瘤细胞中由于APE1高表达而导致的肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，因此可用于制备抗癌增敏剂。 
本发明采用的Hela细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购于American Type Culture Collection（ATCC,Manassas,VA），APE1稳定敲低细胞株（APE1shRNA）、表达外源性APE1蛋白的细胞株（APE1wt）、表达外源性APE1氧化还原缺失蛋白的细胞株（APE1C65S）细胞均由第三军医大学第三附属医院肿瘤中心实验室自行构建并保存；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、丹参酮IIA、丙烯酰胺（Acrylamide）、过硫酸胺、TEMED、甘油、依托泊苷均购自Sigma公司；1.5mol/L Tis‑HCl（pH值为8.8）、1.5mol/L Tis‑HCl（pH值为6.8）、PVDF膜、正电子尼龙膜、滤纸均购自Bio‑rad公司；HRP发光液购于Thermo公司，核蛋白提取试剂盒、PMSF均购自碧云天；NF‑κB、AP‑1、HIF‑1α生物素探针购自生工公司；仪器采用酶联免疫检测仪、PCR仪、Mini‑Trans‑Blot系统、PowerpacBasic电泳仪、Mini‑proteam3电泳系统。其余试剂、仪器皆为普通市售品。 
下面结合实施例，进一步阐述本发明： 
实施例1丹参酮IIA对Hela细胞增殖的影响 
取Hela细胞接种于96孔板，使细胞密度约5000~10000/孔，四周边缘孔以100μL的PBS缓冲液填充，温度为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度条件下，培养24小时； 
然后取培养后的Hela细胞，分别加入5个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计依次为2nmol/mL、4nmol/mL、8nmol/mL、16nmol/mL、32nmol/mL），每个浓度设5个复孔，并取5个含有Hela细胞但不添加丹参酮IIA溶液的孔作为对照，在温度为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度下培养24小时；另取两份培养后的Hela细胞，做同样处理，分别培养48小时、72小时； 
然后，在每孔加入20μL质量‑体积浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续 培养4小时；终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO，将96孔板置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； 
在酶联免疫检测仪OD490波长处测量各孔的吸光值。 
实验结果见图1。图中结果显示，随着时间的推移，各个孔中的Hela细胞都有增殖，但是添加了丹参酮IIA的Hela细胞的增殖率明显低于对照，并且随着溶液浓度的增大，丹参酮IIA对肿瘤细胞的杀伤作用表现的更加明显。 
说明丹参酮IIA对肿瘤细胞的杀伤效应具有时间和剂量依赖性，并且，当丹参酮IIA对Hela细胞的杀伤达到50%时，丹参酮溶液的浓度（IC50）如表1所示： 
表1丹参酮IIA对肿瘤细胞的杀伤效应的IC50值 
时间（小时） IC50（μM） 24 29.6 48 12.1 72 4.8
实施例2Western Blot验证三组Hela细胞模型的内源性APE1蛋白敲低和外源性APE1蛋白表达的情况 
首先，提取Hela细胞、APE1shRNA、APE1wt和APE1C65S细胞总蛋白，具体操作如下：吸弃细胞培养上清液，然后用冰PBS洗2遍；加入1×蛋白上样缓冲液150μL，用细胞刷挂下贴壁细胞，直至液体呈粘稠样；吸取粘稠样液体于干净的1.5mL离心管中，超声30pulse以裂解核酸，直至打出白色气泡；裂解后的液体放于干式恒温器上5min，温度为100℃；提取后的样品于‑80℃保存。 
然后，配制Western Blot电泳胶，其中，下层胶由： 


配制而成，待下层胶凝结后，配制浓缩胶，浓缩胶由 

配制而成。 
待凝胶凝结后，取样品进行SDS‑PAGE电泳：取10μL样品与loading buffer混合均匀后上样，以165V的电压进行电泳，直至loading buffer跑到底部； 
然后，小心取下凝胶，按照滤纸‑PVDF膜‑凝胶‑滤纸的顺序重叠各层，对齐各边，赶尽各层间的气泡，将有膜的一面置于转印槽正极，电压100V，转膜2小时； 
待转膜完成后，取出PVDF膜，浸泡在含奶粉的TBST封闭液中，其中，奶粉的质量分数为10%，在37℃条件下，80rpm摇床上，封闭1小时； 
然后，用含奶粉的TBST封闭液配制一抗：其中，奶粉的质量分数为5％，β‑actin和APE1抗体的体积比为1:8000；然后在4℃条件下孵育一抗过夜；次日，在80rpm摇床，37℃复温1小时后用TBST封闭液漂洗5次；用含奶粉的TBST封闭液配制二抗：其中，奶粉的质量分数为10％，β‑actin和APE1抗体配制比例为1:8000；在37℃条件下，80rpm摇床上孵育二抗，1小时后用TBST封闭液漂洗5次；然后，将配制好的HRP发光液（由SuperSignal West Pico Luminol/Enhancer Solution250μL和SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution250μL混合）滴至膜上；根据观察到的荧光强度调整曝光时间及显影定影时间。 
Western Blot实验结果见图2。结果显示，APE1shRNA细胞中内源性APE1蛋白显著敲低，APE1wt和APE1C65S细胞中外源性APE1蛋白显著表达。 
实施例3MTT实验考察APE1稳定敲低及APE1氧化还原缺失对丹参酮IIA 肿瘤杀伤效应的影响 
将APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞分别接种96孔板，细胞密度约5000~10000/孔；四周边缘孔以100μL的PBS填充；37℃条件下，CO2体积分数为5%，饱和湿度下培养24小时； 
在APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞中分别加入2个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL），每个浓度设5个复孔。37℃条件下，CO2体积分数为5％，饱和湿度下培养24小时。 
在每孔加入20μL质量‑体积浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时；终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO后，将96孔板置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； 
在酶联免疫检测仪OD490波长处测量各孔的吸光值。 
实验结果见图3。结果显示，APE1稳定敲低及APE1氧化还原缺失显著降低丹参酮IIA的肿瘤杀伤效应。 
实施例4电泳迁移率实验（EMSA）考察丹参酮IIA对APE1redox功能介导的NF‑κB的DNA结合活性的影响 
取APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞，分别加入2个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL）；37℃条件下，CO2体积分数为5％，饱和湿度下培养24小时。 
然后使NF‑κB探针退火，具体操作为：在一个离心管中，将摩尔浓度为100pmol/μL的两条单链寡核苷酸探针溶液按照1：1的摩尔比进行混合（各取2.5μL混合），然后加入5μL的10×退火缓冲液和40μL灭菌水，将探针溶液稀释到摩尔浓度为5pmol/μL，混匀后瞬间离心，在PCR仪上反应，反应结束后，分装并于‑20℃保存。 
然后提取细胞核蛋白，具体操作为：准备溶液：低温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀；取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；将APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞用PBS缓冲 液洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用；加入200μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；最高速剧烈涡旋振荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；冰浴10分钟~15分钟；加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μL；最高速剧烈涡旋振荡5秒，冰浴1分钟；最高速剧烈涡旋振荡5秒，4℃条件下12,000g~16,000g离心5分钟；完全吸尽残余的上清，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；最高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，然后放回冰浴中，每隔1分钟~2分钟再高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，共30分钟；4℃条件下12,000g~16,000g，离心10分钟；立即吸取上清至一预冷的塑料管中，‑80℃冻存。 
然后制备非变性聚丙烯酰胺凝胶，非变性聚丙烯酰胺凝胶由： 

配制而成； 
然后配制结合反应体系，进行结合反应，结合反应体系包括： 

结合反应体系总体积为10μL，加1μL上样缓冲液，混匀后上样。其中，配制丹参酮IIA溶液采用的溶剂为二甲基亚砜（DMSO），配制完成的溶液中丹参酮IIA的摩尔体积浓度为10μmol/L。 
进行预电泳，具体操作为：对各孔进行冲洗后，接通电源，在100V进行预电泳30分钟以上；然后进行电泳，具体操作为：将各反应样品分别加到聚丙烯酰胺凝胶的不同点样孔中，将含有溴酚蓝的上样缓冲液单独上样于一 孔中作为电泳迁移标志；在0.5×TBE缓冲液中电泳，电压100V，直至溴酚蓝迁移至距胶板下缘1/3～1/4处为止。 
然后进行转膜及交联：用0.5×TBE缓冲液浸泡尼龙膜10分钟以上；在预冷的0.5×TBE缓冲液中用夹板固定胶合适大小的尼龙膜，注意采用干净的海绵（与做Western的不要混用）；380mA（约100V），转膜30分钟；转膜结束后，在紫外灯下（5cm~10cm的距离），交联20分钟； 
然后采用化学发光法检测生物素标记的探针，具体操作为：37℃~50℃温育Blocking Buffer和4×Wash Buffer，直到清澈（工作温度保持在室温至50℃）；以15mL的Blocking Buffer封膜，37℃，温和摇动40分钟；向Blocking Buffer中加入25μL的辣根过氧化物酶标记的链亲和素溶液（Stabilized Streptavidin‑Horseradish Peroxidase Conjugate，即SA‑HRP，其中，SA‑HRP与水的体积比为1：600)，37℃，温和摇动孵育30分钟；用1×Wash Buffer在37℃条件下摇动洗膜4次，每次用1×Wash Buffer20mL，共用1×Wash Buffer80mL，每次洗膜5分钟；以15mL Substrate Equilibration Buffer，37℃，温和摇动孵育5分钟；弃除Substrate Equilibration Buffer，轻轻吸干液体，用1mL Substrate Working Solution浸泡膜5分钟，勿摇。 
然后，进行压片及显影定影，根据观察到的荧光强度调整曝光时间及显影定影时间。 
实验结果如图4所示。结果显示，丹参酮IIA可有效地抑制APE1氧化还原功能介导的NF‑κB的DNA结合活性。 
实施例5电泳迁移率实验（EMSA）考察丹参酮IIA对APE1氧化还原功能介导的AP‑1的DNA结合活性的影响 
取APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞，分别加入2个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL）；37℃条件下，CO2体积分数为5％，饱和湿度下培养24小时。 
然后使AP‑1探针退火，具体操作为：在一个离心管中，将摩尔浓度为100pmol/μL的两条单链寡核苷酸探针溶液按照1：1的摩尔比进行混合（各取2.5μL混合），然后加入5μL的10×退火缓冲液和40μL灭菌水，将探针溶液稀释到摩尔浓度为5pmol/μL，混匀后瞬间离心，在PCR仪上反应，反应结束后，分 装并于‑20℃保存。 
然后提取细胞核蛋白，具体操作为：准备溶液：低温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀；取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；将APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞用PBS缓冲液洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用；加入200μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；最高速剧烈涡旋振荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；冰浴10分钟~15分钟；加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μL；最高速剧烈涡旋振荡5秒，冰浴1分钟；最高速剧烈涡旋振荡5秒，4℃条件下12,000g~16,000g离心5分钟；完全吸尽残余的上清，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；最高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，然后放回冰浴中，每隔1分钟~2分钟再高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，共30分钟；4℃条件下12,000g~16,000g，离心10分钟；立即吸取上清至一预冷的塑料管中，‑80℃冻存。 
然后制备非变性聚丙烯酰胺凝胶，非变性聚丙烯酰胺凝胶由： 

配制而成； 
然后配制结合反应体系，进行结合反应，结合反应体系包括： 

结合反应体系总体积为10μL，加1μL上样缓冲液，混匀后上样。其中，配制丹参酮IIA溶液采用的溶剂为二甲基亚砜（DMSO），配制完成的溶液中丹参酮IIA的摩尔体积浓度为10μmol/L。 
进行预电泳，具体操作为：对各孔进行冲洗后，接通电源，在100V进行预电泳30分钟以上；然后进行电泳，具体操作为：将各反应样品分别加到聚丙烯酰胺凝胶的不同点样孔中，将含有溴酚蓝的上样缓冲液单独上样于一孔中作为电泳迁移标志；在0.5×TBE缓冲液中电泳，电压100V，直至溴酚蓝迁移至距胶板下缘1/3～1/4处为止。 
然后进行转膜及交联：用0.5×TBE缓冲液浸泡尼龙膜10分钟以上；在预冷的0.5×TBE缓冲液中用夹板固定胶合适大小的尼龙膜，注意采用干净的海绵（与做Western的不要混用）；380mA（约100V），转膜30分钟；转膜结束后，在紫外灯下（5cm~10cm的距离），交联20分钟； 
然后采用化学发光法检测生物素标记的探针，具体操作为：37℃~50℃温育Blocking Buffer和4×Wash Buffer，直到清澈（工作温度保持在室温至50℃）；以15mL的Blocking Buffer封膜，37℃，温和摇动40分钟；向Blocking Buffer中加入25μL的辣根过氧化物酶标记的链亲和素溶液（Stabilized Streptavidin‑Horseradish Peroxidase Conjugate，即SA‑HRP，其中，SA‑HRP与水的体积比为1：600)，37℃，温和摇动孵育30分钟；用1×Wash Buffer在37℃条件下摇动洗膜4次，每次用1×Wash Buffer20mL，共用1×Wash Buffer80mL，每次洗膜5分钟；以15mL Substrate Equilibration Buffer，37℃，温和摇动孵育5分钟；弃除Substrate Equilibration Buffer，轻轻吸干液体，用1mL Substrate Working Solution浸泡膜5分钟，勿摇。 
然后，进行压片及显影定影，根据观察到的荧光强度调整曝光时间及显影定影时间。 
实验结果如图5所示。结果显示，丹参酮IIA可有效地抑制APE1氧化还原功能介导的AP‑1的DNA结合活性。 
实施例6电泳迁移率实验（EMSA）考察丹参酮IIA对APE1氧化还原功能介的HIF‑1α的DNA结合活性的影响 
取APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞，分别加入2个药物浓度梯度的 丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL）；37℃条件下，CO2体积分数为5％，饱和湿度下培养24小时。 
然后使HIF‑1α探针退火：具体操作为：在一个离心管中，将摩尔浓度为100pmol/μL的两条单链寡核苷酸探针溶液按照1：1的摩尔比进行混合（各取2.5μL混合），然后加入5μL的10×退火缓冲液和40μL灭菌水，将探针溶液稀释到摩尔浓度为5pmol/μL，混匀后瞬间离心，在PCR仪上反应，反应结束后，分装并于‑20℃保存。 
然后提取细胞核蛋白，具体操作为：准备溶液：低温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀；取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mmol/L；将APE1wt、APE1shRNA和APE1C65S细胞用PBS缓冲液洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用；加入200μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；最高速剧烈涡旋振荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；冰浴10分钟~15分钟；加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μL；最高速剧烈涡旋振荡5秒，冰浴1分钟；最高速剧烈涡旋振荡5秒，4℃条件下12,000g~16,000g离心5分钟；完全吸尽残余的上清，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；最高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，然后放回冰浴中，每隔1分钟~2分钟再高速剧烈涡旋振荡15秒~30秒，共30分钟；4℃条件下12,000g~16,000g，离心10分钟；立即吸取上清至一预冷的塑料管中，‑80℃冻存。 
然后制备非变性聚丙烯酰胺凝胶，非变性聚丙烯酰胺凝胶由： 

配制而成； 
然后配制结合反应体系，进行结合反应，结合反应体系包括： 

结合反应体系总体积为10μL，加1μL上样缓冲液，混匀后上样。其中，配制丹参酮IIA溶液采用的溶剂为二甲基亚砜（DMSO），配制完成的溶液中丹参酮IIA的摩尔体积浓度为10μmol/L。 
进行预电泳，具体操作为：对各孔进行冲洗后，接通电源，在100V进行预电泳30分钟以上；然后进行电泳，具体操作为：将各反应样品分别加到聚丙烯酰胺凝胶的不同点样孔中，将含有溴酚蓝的上样缓冲液单独上样于一孔中作为电泳迁移标志；在0.5×TBE缓冲液中电泳，电压100V，直至溴酚蓝迁移至距胶板下缘1/3～1/4处为止。 
然后进行转膜及交联：用0.5×TBE缓冲液浸泡尼龙膜10分钟以上；在预冷的0.5×TBE缓冲液中用夹板固定胶合适大小的尼龙膜，注意采用干净的海绵（与做Western的不要混用）；380mA（约100V），转膜30分钟；转膜结束后，在紫外灯下（5cm~10cm的距离），交联20分钟； 
然后采用化学发光法检测生物素标记的探针，具体操作为：37℃~50℃温育Blocking Buffer和4×Wash Buffer，直到清澈（工作温度保持在室温至50℃）；以15mL的Blocking Buffer封膜，37℃，温和摇动40分钟；向Blocking Buffer中加入25μL的辣根过氧化物酶标记的链亲和素溶液（Stabilized Streptavidin‑Horseradish Peroxidase Conjugate，即SA‑HRP，其中，SA‑HRP与水的体积比为1：600)，37℃，温和摇动孵育30分钟；用1×Wash Buffer在37℃条件下摇动洗膜4次，每次用1×Wash Buffer20mL，共用1×Wash Buffer80mL，每次洗膜5分钟；以15mL Substrate Equilibration Buffer，37℃，温和摇动孵育5分钟；弃除Substrate Equilibration Buffer，轻轻吸干液体，用1mL Substrate Working Solution浸泡膜5分钟，勿摇。 
然后，进行压片及显影定影，根据观察到的荧光强度调整曝光时间及显影定影时间。 
实验结果如图6所示。结果显示，丹参酮IIA可有效地抑制APE1氧化还原功能介导的HIF‑1α的DNA结合活性。 
实施例7MTT实验考察丹参酮IIA对依托泊苷肿瘤杀伤效应的影响 
取Hela细胞接种于96孔板，使细胞密度约5000~10000/孔，四周边缘孔以100μL的PBS缓冲液填充，37℃条件下，CO2体积分数为5%，饱和湿度下培养24小时； 
然后，在Hela细胞中分别加入2个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL），每个浓度设5个复孔，在温度为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度下培养24小时后，每孔加入10μmol/L的依托泊苷溶液，在温度为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度下培养12小时；每孔加入20μL的MTT溶液（质量‑体积浓度为5mg/ml），继续培养4小时后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； 
然后，在酶联免疫检测仪OD490波长处测量各孔的吸光值。 
实验结果如图7所示。表2所示为丹参酮IIA对依托泊苷肿瘤杀伤效应的影响。 
表2丹参酮IIA对依托泊苷肿瘤杀伤效应的影响 

结合表2和图7，可以证明：丹参酮IIA可较大幅度地提高肿瘤细胞对依托泊苷化疗敏感性。 
实施例8MTT实验考察丹参酮IIA对HUVEC细胞增殖的影响 
取HUVEC细胞接种于96孔板，细胞密度约5000~10000/孔，四周边缘孔以100μL的PBS缓冲液填充，37℃条件下，CO2体积分数为5％，饱和湿度下培养24小时； 
然后。在HUVEC细胞中分别加入2个药物浓度梯度的丹参酮IIA溶液（使其终浓度以摩尔浓度计分别为8nmol/mL、16nmol/mL），每个浓度设5个复孔，在温度为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度下培养24小时。另取两份培养后的Hela细胞，做同样处理，分别培养48小时、72小时； 
然后，在每孔加入20μL质量‑体积浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时；终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO，将96孔板置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； 
在酶联免疫检测仪OD490波长处测量各孔的吸光值。 
实验结果如图8所示。结果显示，丹参酮IIA对正常细胞无明显毒性。 
实施例9丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的片剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得片剂。 
实施例10丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的胶囊剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得胶囊剂。 
实施例11丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的丸剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得丸剂。 
实施例12丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的颗粒剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得颗粒剂。 
实施例13丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的汤剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得汤剂。 
实施例14丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的膏剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得膏剂。 
实施例15丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的露剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得露剂。 
实施例16丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的口服液剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得口服液剂。 
实施例17丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的滴丸剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得滴丸剂。 
实施例18丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的糖浆剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得糖浆剂。 
实施例19丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的注射用粉针剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得注射用粉针剂。 
实施例20丹参酮IIA用于制备治疗癌症的辅助剂的注射液 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得注射液。 
实施例21丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的片剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得片剂。 
实施例22丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的胶囊剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得胶囊剂。 
实施例23丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的丸剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得丸剂。 
实施例24丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的颗粒剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得颗粒剂。 
实施例25丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的汤剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得汤剂。 
实施例26丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的膏剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得膏剂。 
实施例27丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的露剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得露剂。 
实施例28丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的口服液剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得口服液剂。 
实施例29丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的滴丸剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得滴丸剂。 
实施例30丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的糖浆剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得糖浆剂。 
实施例31丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的注射用粉针剂 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得注射用粉针剂。 
实施例32丹参酮IIA用于制备化疗增敏剂的注射液 
取丹参酮IIA添加常规辅料，采用常规方法制得注射液。 
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。