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1、(10)申请公布号 CN 103173379 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173379 A *CN103173379A* (21)申请号 201210568113.2 (22)申请日 2012.12.24 10-2011-0140564 2011.12.22 KR 10-2012-0053240 2012.05.18 KR C12N 1/20(2006.01) C12P 33/00(2006.01) A23L 2/38(2006.01) A23L 1/29(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (71)申请人 熊津食品有限公司 地址 韩国忠淸南。
2、道公州市维鸠邑维鸠里 662 (72)发明人 金正勋 柳炚旴 李珠美 金濠彬 郑宰旭 金相来 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 武君 (54) 发明名称 新型的红参发酵用微生物， 及其利用该微生 物的红参发酵液和红参发酵饮料 (57) 摘要 新型的红参发酵用微生物， 及其利用该微生 物的红参发酵液和红参发酵饮料。本发明涉及一 种具有序列编号 8 序列的红参发酵用微生物。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 19 页 序列表 9 页 附图 18 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1。
3、页 说明书19页 序列表9页 附图18页 (10)申请公布号 CN 103173379 A CN 103173379 A *CN103173379A* 1/1 页 2 1. 一种具有序列编号 8 序列的红参发酵用微生物。 2. 根据权利要求 1 所述的红参发酵用微生物， 其特征在于， 上述微生物可以将红参 所含的 Rg1、 Re、 Rb1、 Rc、 Rb2 以及 Rd 中的一个以上主要皂甙转换成 F2、 Rg3、 Rh2 以及 Compound-K 中的一个以上次要皂甙。 3. 根据权利要求 1 所述的红参发酵用微生物， 其特征在于， 上述微生物呈现出副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobac。
4、illus paracasei subsp. paracasei) 碱基序列 99% 以上的相同性。 4. 根据权利要求 1 所述的红参发酵用微生物， 其特征在于， 上述微生物具有 KCTC12108BP 的寄托编号。 5. 一种红参发酵液的制造方法， 其特征在于， 包括， 将权利要求 1 至权利要求 4 中的某 一项微生物添加到红参萃取液进行发酵的阶段。 6. 根据权利要求 5 所述的红参发酵液制造方法， 其特征在于， 还包括， 上述发酵阶段 后， 添加酶进行处理的阶段。 7. 根据权利要求 5 所述的红参发酵液制造方法， 其特征在于， 上述发酵时， 添加蔗糖或 盐。 8. 根据权利要求 5。
5、 所述的红参发酵液的制造方法， 其特征在于， 上述发酵时使用的微 生物培养液是从白菜、 萝卜、 圆生菜、 圆白菜、 胡萝卜、 橡胶、 土豆和生菜组成的群组中选择 的一个以上制造。 9. 一种增强免疫用的红参发酵饮料， 其特征在于， 包括按照权利要求 5 的制造方法制 造的红参发酵液。 10. 一种缓解癌症以及预防癌症的红参发酵饮料， 其特征在于， 包括按照权利要求 5 的 制造方法制造的红参发酵液。 权 利 要 求 书 CN 103173379 A 2 1/19 页 3 新型的红参发酵用微生物， 及其利用该微生物的红参发酵 液和红参发酵饮料 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的红参发酵用微。
6、生物， 及其利用该微生物的红参发酵液制造 方法和红参发酵饮料。 背景技术 0002 红参皂甙的抗疲劳、 增强免疫力、 改善血行等效果已经得到证实， 而且持续的研究 结果表明， 还具有防老抗老、 保护肝功能、 改善血液循环、 改善痴呆和肝功能等功效。 0003 尤其是， 红参的皂甙中难以吸收的主要皂甙 (saponin)(Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 以及 Rd) 经过加水分解生成的次要皂甙 (saponin)(Rg3, Rh2, Compound-K 等 ) 被报告， 在 实验鼠中具有阻碍肿瘤细胞的转移、 在试管内阻碍肿瘤细胞的入侵、 诱发癌细胞的自杀、 抑 制癌细胞的转移、 降。
7、低血压、 抑制儿茶酚胺激素 (catecholamine) 的分泌、 激活镇痛剂以及 增强免疫力等卓越的药理活性。 0004 这样随着次要皂甙 (saponin) 的卓越的药理活性得到验证， 生成次要皂甙 (saponin) 的研究开展的非常活跃。主要尝试的方法有酸加水分解、 热处理、 酶加水分解以 及有机合成等方法。其中， 酶加水分解方法可以在低温中实施， 操作简便， 且由于酶的基质 特性副产品非常少， 所以说是生产次要皂甙 (saponin) 最合适的方法。目前为止， 通过酶转 换皂甙的研究主要集中在肠内细菌、 土壤微生物以及植物组织中分离的微生物。 但是， 这些 方法不适用于食用， 所以。
8、在实用化方面还是有不少难度。 0005 另外， 乳酸菌(lactic acid bacteria)是指大量生成乳酸(lactic acid)的细菌， 利用食品内的糖 (glucose) 生成乳酸， 不仅改善食品的口味， 还进行食品的酸化， 阻碍其他 有害的微生物成长。并且， 乳酸菌栖息在各种动物的肠管内， 保护消化管内的粘膜、 改善肠 内异常发酵、 促进消化和吸收、 促进维生素的合成以及钙的吸收等， 所以在从红参的主要皂 甙 (saponin) 中生成次要皂甙 (saponin) 时可以使用。 这些乳酸菌的培养通常都会使用比较典型的乳酸菌商用培基 -MRS 培基， 但是这些商 用培基在其成分或。
9、化学加工处理方法上， 无法得知都使用了哪些材料、 经过了哪些化学处 理， 所以不适合于食用。作为一个例子， 韩国注册专利第 0680318 号记载了包括胰蛋白胨、 大豆胨、 蛋白胨等的微生物培养用营养培基的内容。 但是， 上述的制造胰蛋白胨、 大豆胨、 蛋 白胨等的过程非常复杂， 而且在制造过程中还包括了处理氢氧化钠等强碱基的人体有害的 化学处理过程， 在这样的培基中培养的微生物无法直接用于食用。 0006 因此， 为了从红参的主要皂甙 (saponin) 生成次要皂甙 (saponin)， 需要开发新型 的乳酸菌菌株以及利用该菌株的红参发酵液的制造方法以及可直接用于食用的， 采用对人 体无害。
10、的材料的乳酸菌培养用培基。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种提升红参萃取液中所含的功能性次要皂甙 (saponin) 说 明 书 CN 103173379 A 3 2/19 页 4 的转换效率的新型的红参发酵用微生物。 0008 本发明的目的在于提供一种利用上述微生物的红参发酵液制造方法。 0009 并且， 本发明的目的在于提供一种使红参萃取液的功能性次要皂甙 (saponin) 的 含量最大化， 具有免疫活性和抗癌活性， 可安全摄入的红参发酵饮料。 0010 技术方案 为了实现上述的目的， 本发明提供具有序列编号 8 序列的红参发酵用微生物。 0011 根据本发明的一个实施方式，。
11、 上述微生物呈现出， 将红参所含的 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 以及 Rd 中一个以上的主要皂甙 (saponin) 转换成 F2, Rg3, Rh2 以及 Compound-K 中的一个以上次要皂甙 (saponin) 的特性。 0012 根据本发明的一个实施方式， 上述微生物呈现出与副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 碱基序列 99% 以上的相同性。 0013 根据本发明的一个实施方式， 上述微生物具有 KCTC12108BP 的寄托编号。 0014 本发明提供， 将上述微生物添加到红参萃取液进行发酵。
12、的红参发酵液制造方法。 0015 根据本发明的一个实施方式， 还包括， 上述发酵阶段后还添加酶进行处理的阶段。 0016 根据本发明的一个实施方式， 上述发酵时可以添加蔗糖 (sucrose) 或盐 (NaCl)。 0017 根据本发明的一个实施方式， 上述发酵时使用的微生物培养液是从白菜、 萝卜、 圆 生菜、 圆白菜、 胡萝卜、 香蕉、 土豆和生菜组成的群组中选择的一个以上的蔬菜制造的。 0018 本发明提供， 含有上述制造的红参发酵液的免疫增强用红参发酵饮料。 0019 并且， 本发明提供， 含有上述制造的红参发酵液的缓解癌症以及预防癌症的红参 发酵饮料。 0020 有益效果 本发明的新型。
13、的红参发酵用微生物具有， 以非常高的效率将红参所含的主要皂甙 (saponin) 转换成次要皂甙 (saponin) 的特性， 由此提高体内的皂甙吸收效率。 0021 并且， 本发明的红参发酵液制造方法优化本发明的新型的红参发酵用微生物的发 酵环境， 将次要皂甙(saponin)的转换效率提升2 3倍， 而且使用可食用的微生物培养培 基， 保证食品安全性， 节省成本。并且， 本发明的红参发酵饮料具有非常优异的免疫活性以 及抗癌活性 ( 缓解癌症以及抗癌的效果 )。 附图说明 0022 图 1 为按照本发明方法筛选的 WJ-1, 2, 4, 6, 23, 33 发酵菌株的 16S DNA 碱基 。
14、序列， 图 1a 为 WJ-1 菌株、 图 1b 为 WJ-2 菌株、 图 1c 为 WJ-4 菌株、 图 1d 为 WJ-6 菌株、 图 1e 为 WJ-23 菌株、 图 1f 为 WJ-33 菌株的 16S rDNA 碱基序列。 0023 图 2 为按照本发明方法筛选的发酵菌株的次要皂甙 (saponin) 转换能力的 TLC 层 析观察结果图。 0024 图 2a 为 WJ-1, 2, 4 以及 6 菌株的红参萃取液中， 将主要皂甙 (saponin) 转换为 次要皂甙 (saponin) 的效果图 (1 号泳道 : WJ-1, 2 号泳道 : WJ-2, 3 号泳道 : WJ-3, 4。
15、 号泳道 : WJ-4, 5 号泳道 : 标准 , 6 号泳道 : WJ-5, 7 号泳道 : WJ-6, 8 号泳道 : WJ-8, 9 号泳道 : WJ-9)。 0025 图 2b 为 WJ-23, WJ-33 菌株的红参萃取液中， 将主要皂甙 (saponin) 转换为次要 说 明 书 CN 103173379 A 4 3/19 页 5 皂甙 (saponin) 的效果图 (1 号泳道 : WJ-32, 2 号泳道 : WJ-33, 3 号泳道 : WJ-34, 4 号 泳道 : WJ-35, 5 号泳道 : 标准 , 6 号泳道 : WJ-36)。 0026 图 3 为利用 WJ-33。
16、 菌株的发酵过程中， 分别添加蔗糖或盐时转换为次要皂甙 (saponin)的结果图(1号泳道: WJ-32, 2号泳道: WJ-33, 3号泳道: WJ-34, 4号泳道: WJ-35, 5 号泳道 : 标准 , 6 号泳道 : WJ-36)。 0027 图 4 为同时使用按照本发明方法筛选的发酵菌株和作为诱导因子的蔗糖 (sucrose) 或盐 (NaCl) 时， 转换为次要皂甙 (saponin) 的转换效率观察结果。 0028 图 4a 为将 WJ-2 或 WJ-4 菌株和蔗糖 (sucrose) 一同添加到红参萃取液处理时， 生 成次要皂甙(saponin)的观察图(1号泳道: WJ-。
17、1, 2号泳道: WJ-2, 3号泳道: WJ-3, 4 号泳道 : WJ-4, 5 号泳道 : 标准 , 6 号泳道 : WJ-5, 7 号泳道 : WJ-6, 8 号泳道 : WJ-8, 9 号泳道 : WJ-9)。 0029 4b为将WJ-2或WJ-4菌株和盐(NaCl)一同添加到红参萃取液处理时， 生成次要皂 甙 (saponin) 的观察图 (1 号泳道 : WJ-1, 2 号泳道 : WJ-2 3 号泳道 : WJ-3, 4 号泳道 : WJ-4, 5 号泳道 : 标准 , 6 号泳道 : WJ-5, 7 号泳道 : WJ-6, 8 号泳道 : WJ-8, 9 号泳 道 : WJ-。
18、9)。 0030 图 5 为利用按照本发明方法筛选的发酵菌株进行发酵后， 一同使用筛滤的酶时， 转换为次要皂甙 (saponin) 的效率观察图 ( 不同泳道采用不同 % 进行接种和反应 )。 0031 图 6 为本发明红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的 NO 生成量确认结果。 0032 图 7 为本发明红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的 细胞生存率确认结果图。 0033 图 8 为本发明红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的 TNF- 发现量确认结果图。 0034 图 9 为本发明红。
19、参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的 羊栖菜萃取物吞噬作用确认结果。 0035 ( 野生型 ; DMEM 培养基 (10% FBS), P-CON; 酵母聚糖 (Zymosan), I-CON; DMEM 培养基 (10% FBS) + 抑制剂 (2M / 24hr) + 酵母聚糖 ( zymosan), 红参 ; 未发酵红参萃取液 + 酵母聚糖 (zymosan), 发酵红参 ; 本发明的红参发酵液 + 酵母聚糖 (zymosan) 图 10 为口服本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的实验鼠的脾脏细胞增殖能力确认结。
20、果图。 0036 图 11 为口服本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红 参” ) 的实验鼠腹腔巨噬细胞中的 TNF- 发现确认结果图。 0037 图 12 为口服本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红 参” ) 的实验鼠腹腔巨噬细胞中的 IL-1 发现确认结果图。 0038 图 13 为口服本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红 参” ) 的实验鼠腹腔巨噬细胞中 IL-6 发现确认结果图。 0039 图 14 为口服本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红 参” ) 的实验鼠。
21、血浆内的 Compound K 含量确认结果图。 说 明 书 CN 103173379 A 5 4/19 页 6 0040 图 15 为本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 的抑制肺癌细胞增殖的活性确认结果图。 0041 图 16 为本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 抑制胃癌细胞增殖的活性确认结果。 0042 图 17 为本发明的红参发酵液 (“发酵红参” ) 以及未发酵红参萃取液 (“红参” ) 抑制大肠癌细胞的活性确认结果图。 0043 图 18 为按种类分别添加植物性素材的培基中， 培养副干酪乳杆菌副干酪。
22、亚种 (Lactobacillusparacasei subsp. paracasei) 后， OD 值的测定结果图。 0044 图 19 为 分 别 添 加 糖 的 培 基 中，培 养 副 干 酪 乳 杆 菌 副 干 酪 亚 种 (Lactobacillusparacasei subsp. paracasei) 后， OD 值的测量结果图。 0045 图 20 为分别添加不同浓度的盐分以及营养成分的培基中， 培养副干酪乳杆菌副 干酪亚种 (Lactobacillusparacasei subsp. paracasei) 后， OD 值的测量结果图。 0046 图 21 为 再 添 加 植 物。
23、 性 素 材 的 培 基 中， 培 养 副 干 酪 乳 杆 菌 副 干 酪 亚 种 (Lactobacillusparacasei subsp. paracasei) 后， OD 值的测量结果图。 0047 图 22 为混合添加植物性素材的培基中， 培养副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillusparacasei subsp. paracasei)24 小时后， OD 值的测量结果图。 具体实施方式 0048 下面详细介绍本发明的具体实施方式。 0049 本发明涉及一种新型的微生物以及利用该微生物的红参发酵液的制造方法以及 红参发酵饮料。 0050 本发明的新型的微生物具有， 将红参。
24、所含的主要皂甙 (saponin) 高效转化为次要 皂甙 (saponin) 的特性， 可以是从红参米酒中分离的。使用本发明的新型的微生物发酵红 参制作饮料时， 富含次要皂甙 (saponin)， 具有优异的免疫增强以及抗癌功效。 0051 本发明的主要皂甙(saponin)可以是Rg1、 Re、 Rb1、 Rc、 Rb2 以及 Rd中的一个 以上， 但不限于此。本发明的次要皂甙 (saponin) 可以是 F2、 Rg3、 Rh2 以及 Compound-K 中 的一个以上， 但不限于此。 0052 本发明的新型的微生物可以是新型的乳酸菌， 具体而言， 与布氏乳杆菌 (Lactobacill。
25、us buchneri), 类布氏乳杆菌 (Lactobacillus parabuchneri), 副干酪 乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei), Lactobacillus harbinensis或 酵 母 菌 酶 母 (Saccharomyces cerevisiae CBS405) 的 碱 基 序 列 呈 现 99% 以上的相同性。并且， 与布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri), 类布氏乳杆菌 (Lactobacillus parabuchneri), 副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobaci。
26、llus paracasei subsp. paracasei), Lactobacillus harbinensis或 酵 母 菌 酶 母 (Saccharomyces cerevisiae CBS405) 相比， 呈现出显著的次要皂甙 (saponin) 转换效率的新的菌株。换句 话说， 本发明的新型的微生物可以是呈现出将红参所含的 Rg1、 Re、 Rb1、 Rc、 Rb2 以及 Rd 中的一个以上主要皂甙 (saponin) 转换为 F2、 Rg3、 Rh2 以及 Compound-K 中的一个以上次 要皂甙 (saponin) 的特性的。尤其， 本发明的新型的微生物是与副干酪乳杆菌副。
27、干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 呈现出 99% 以上相同性的新菌株。 说 明 书 CN 103173379 A 6 5/19 页 7 0053 具体而言， 上述的微生物可以是具有序列编号3至8中的某一个序列的， 最好是具 有序列编号 8 序列的。并且， 本发明的微生物最好具有 KCTC12108BP 的寄托编号。 0054 并且， 本发明涉及一种红参发酵液的制造方法， 具体而言， 包括将上述新型的微生 物添加到红参萃取液进行发酵的阶段。根据本发明的一个实施方式， 上述的微生物是以红 参萃取液的总重量为准以 0.001 3 %(v/。
28、w) 的比例接种的。 0055 并且， 本发明的红参发酵液制造方法是以红参发酵液的体积为准， 以 0.001 3 %(v/v) 的比例添加蔗糖 (sucrose) 或盐 (NaCl) 的。 0056 并且， 利用本发明的新型的微生物发酵红参后， 为了使皂甙 (saponin) 的转换能 力加倍， 可以在上述的红参发酵液中再添加食用酶。 上述的酶只要是可食用的即可， 没有其 他限制。 0057 一方面， 上述发酵时使用的微生物培养液可以是从可食用的物质中制作的培养 液。上述可食用的物质可以是包括植物性素材、 糖源以及营养成分的。 0058 本发明的植物性素材可以是白菜、 萝卜、 圆生菜、 圆白菜。
29、、 胡萝卜、 香蕉、 土豆以及 生菜中的一个以上， 其中萝卜的效果最佳。并且， 作为植物性素材还可以包括萝卜、 胡萝卜 以及香蕉中的一个以上。上述植物性素材的添加量而言， 微生物培养用培基成分的总重量 为准， 添加3 25%的重量比较好。 这是因为各种植物性素材混合在一起， 作为能量源使用。 上述的植物性素材可以是以浓缩液的形态 (type) 或粉末形态 (type) 添加。 本发明中的糖源可以是蔗糖 (sugar)、 聚葡萄糖 (polydextrose)、 果糖 (fructose), 低聚糖(maltooligo)、 葡萄糖(glucose)、 糊精(dextrin)、 低聚果糖(fru。
30、ctooligo)以及乳 糖 (lactose) 中的一个以上， 尤其是乳糖以及葡萄糖中的一个以上比较好。上述糖源是以 微生物培养用培基成分的总重量为准， 添加 1 2.5% 的重量为好。这是因为有一定程度的 糖源时， 乳酸菌的发育更活跃。 0059 本发明中的营养成分采用酶母提取物 (yeast extract) 为好。上述酶母提取物是 具有氨基酸和维生素等成分的纯天然添加物， 可以购买商用食用酶母提取物使用。上述营 养成分是以微生物培养用培基成分总重量为准， 添加 711% 的重量为好。 0060 上述微生物培养用培基的成分还可以包括盐分。上述盐分最好是磷酸二钾 (Dipotassium 。
31、phosphate;K2HPO4)。 上述盐分是以微生物培养用培基成分的总重量为准， 添 加 0.01 0.03% 的重量为好。 0061 本发明的微生物培养用培基成分是采用植物性材料的， 所以能直接食用是其特 征。尤其， 可以用于发酵食品的制造中使用的微生物的培养。 0062 本发明涉及一种含有上述制造的红参发酵液的红参发酵饮料。 本发明的红参发酵 饮料呈现出非常强的增强免疫以及缓解和预防癌症的功效。 0063 上述红参发酵饮料的制造方法相关的记载内容， 均适用于本发明的红参发酵饮 料。 0064 下面结合实施方式和实验例子详细介绍本发明。但是， 下面的实施方式和实验例 子只是例示性的， 本。
32、发明不会局限于下面的实施方式和实验例子， 可以有更多的修改和变 更。 0065 实施方式 1. 新型的发酵菌株的获得 说 明 书 CN 103173379 A 7 6/19 页 8 (1) 米酒中分离和培养乳酸菌 为了分离出红参发酵所需的乳酸菌， 从忠南锦山、 忠南 麻田、 大田广域市收集了人参、 红参米酒以及生米酒等试料(在锦山市场购买)。 从中分离100多菌株的乳酸菌后， 利用红 参米酒的灭菌水连续稀释至 10-110-5， 在 MRS agar plate 中分别展开 (spreading)100 后， 在 37培养基培养了 48 小时。 0066 按照 - 葡萄糖苷酶 (-glucos。
33、idase) 分泌能力筛选发酵菌株 上述 (1) 中分离和培养的发酵菌株中， 为了筛选出具有皂甙转换能力的菌株， 利用 可验证皂甙转换能力的七叶苷琼脂 (Esculin agar) 方法， 如下筛选了 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase) 分泌菌株。 0067 众所周之， - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase) 分泌菌株是切割七叶苷的 - 葡 萄糖 (-glucose) 生成的 esculetin( 七叶苷中脱落 -glucose 的结构 ) 与柠檬酸铁铵 (ferric ammonium citrate) 产生反应， 在培基上的聚集地 (colony) 周围形成黑色的复 合体 。
34、(complex)。即， 形成这些黑色复合体的乳酸菌具有皂甙转换能力， 所以优先筛选了 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase) 分泌菌株。就是说， 筛选了肉眼观察时在乳酸菌周围产 生黑圈的菌株， 这样筛选的菌株命名如表 1。 0068 【表 1】 从红参米酒中筛选的- 葡萄糖苷酶 (-glucosidase)分泌菌株 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase)分泌菌株 WJ-1 WJ-2 WJ-4 WJ-6 WJ-23 WJ-33 比较例 1. 比较菌株的获得 上述实施方式 1.(1) 中分离和培养的 100 多菌株中， 在实施方式 1.(2) 中评估 - 葡 萄糖苷酶(-glucos。
35、idase)分泌能力的结果， 将不分泌-葡萄糖苷酶(-glucosidase) 的菌株划归到了比较例。 0069 实验例 1. 新型的发酵菌株的同定 (1) DNA 的提取 上述实施方式 1 的 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase) 分泌微生物中提取了染色体 DNA(chromosomal DNA)。此时， 采用了 CoreOne bacterial DNA 回收试剂盒 (Coretech. Co. Ltd. Korea)。具体而言， 为了提取染色体 DNA， 将培基上纯培养的菌株在 1.5 试管 中悬浊洗涤一次后使用了分泌微生物。然后， 利用 1% 琼脂糖凝胶 (agarose ge。
36、l) 通过电泳 确认了提取的 DNA。 0070 的 PCR 增幅 为了对上述实施方式 1 中筛选的微生物进行同定， 实施了以增幅 16S rDNA 域为目的 的 PCR。为了 PCR 反应， 分别倒入主型 DNA(100 ng/ ) 1 、 9F(100 pmol)( 序列号 1) 以及 1512R(100 pmol) 基液各 1 、 Taq polymerase(5 U/ ) 0.5 、 dNTP mix(10 mM each) 4 、 10 X反应缓冲液10 、 蒸馏水82.5 ， 制作了总体积100 的反应混合物。 0071 PCR 反应是在 94中进行五分钟的先变性过程后， 在 94。
37、中进行一分钟的变性 说 明 书 CN 103173379 A 8 7/19 页 9 (denaturation)、 60中进行一分钟的退火 (annealing)、 在 72中进行一分钟的展延 (extension) 过程后， 最终在 72中进行了七分钟的额外增幅 (extra-extension) 过程实 施的。之后， 用于实验之前为止保管在 4的环境中。 0072 上述 16S rDNA 域增幅所需的 9F 以及 1512R 基液如下 表 3 所示。 PCR 反应后 增幅的 16S rDNA 是利用 1% agarose gel 通过电泳确认的。( 见表 2). 【表 2】 【表 3】 序。
38、列 9F( 序列号 1)5-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1512R( 序列号 2)5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 (3) PCR 产物的提炼和定序 上述 PCR 产物是采用 PCR 纯化试剂盒 (Bioneer, Korea) 提炼了 DNA。上述提炼的 16S rDNA 的碱基序列是采用 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)和Automatic DNA sequencer(model 3700, Applied Biosyste。
39、ms) 进行了分析。 0073 碱基序列的系统学的分析 利用 NCBI 的 Blast 决定了最接近米酒中分离的 WJ-1, 2, 4, 6, 23 以及 33 号活 性菌株的家族 (strain)。并且， 为了画出分离菌株的系统树， 利用登记在 GenBank 的序列 数据 (sequence data)， 调查位于所筛选菌株附近的各种 type strain 的 16S rDNA 碱基 序列， 并利用 Bioedit program(Hall, 1999) 和 Clustal X program 对碱基序列进行了 排序 (alignment)(Thompson et al., 1997)。。
40、跟踪菌株进化过程的作业采用了 Kimura two-parameter model(Kimura, 1983)， 通过 MEGA 3 Program 的 neighbor-joining 方法， 确定了 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase) 分泌菌株在系统分类学上的位置 (Kumar et al., 2004)。 0074 其结果， WJ-1 是由 1462bp, WJ-2 是由 854bp, WJ-4 是由 848bp, WJ-6 是由 1478bp, WJ-23 是由 1461bp, WJ-33 是由 1460bp 的碱基构成 ( 图 1 的 a-f)， WJ-1 与布氏 乳杆菌 。
41、（Lactobacillus buchneri） 呈现出 99.9% 的相同性， WJ-2 和 WJ-4 与酵母菌酶母 (Saccharomyces cerevisiae) CBS405 呈现出 99%， WJ-6 与布氏乳杆菌 （Lactobacillus 说 明 书 CN 103173379 A 9 8/19 页 10 buchneri）呈现出 99.9% 的相同性， WJ-23 和 WJ-33 分别与副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei)呈现出99.4%和99.6%的相同性(表4 以 及图 1 的 a 至 f)。 00。
42、75 【表 4】 Bp类似菌株相同性序列号 WJ-11462bp布氏乳杆菌99.9%3 WJ-2854bp酵母菌酶母CBS40599%4 WJ-4848bp酵母菌酶母CBS40599%5 WJ-61478bp布氏乳杆菌99.9%6 WJ-231461bp副干酪乳杆菌副干酪亚种99.4%7 WJ-331460bp副干酪乳杆菌副干酪亚种99.6%8 实施方式 2. 利用新型的红参发酵菌株制造红参发酵液 实施方式 2-1. 利用新型的红参发酵菌株制造红参发酵液 ( 不添加诱导因子 ) 将从 ( 株 ) 诚信购买的红参浓缩液进行稀释后， 上述实施方式 1 中筛选的分泌 - 葡 萄糖苷酶 (-gluco。
43、sidase) 的六个菌株， 500 内以 0.001 3 %(v/w) 的浓度分别接种， 然后在 37下发酵了 6 72 小时。 0076 实施方式 2-2. 利用新型的红参发酵菌株制造红参发酵液 ( 添加诱导因子 (elicitor) 为了最大限度提升发酵菌株的皂甙转换活性， 发酵时作为诱导因子添加了盐 (NaCl) 和蔗糖 (Sucrose)。 0077 即， 发酵菌株的发酵条件和 TLC 分析方法与实施方式 2-1 相同， 区别在于只是在 开始发酵时添加了盐 (NaCl) 或蔗糖 (Sucrose)。此时， 盐 (NaCl) 是以 1% 的浓度发酵时添 加， 蔗糖 (Sucrose) 。
44、是以 1% 的浓度分别添加到上述菌株， 并在 24 小时以内进行了处理。 0078 比较例 2. 未发酵红参萃取液的制造 上述的实施方式 2-1中准备了未经发酵过程的红参提取液。 红参浓缩液是从(株)诚 信购买的。 0079 实验例 2. 实施方式 2-1 红参发酵液的特性分析 (1) 分析向次要皂甙 (saponin) 的转换程度 本实验中使用的皂甙 Rb1 是从庆熙大学人参基因院素材银行中购置的。 0080 为了分析发酵产物， 实施了 TLC 层析图。为了实施 TLC 层析图， 将红参浓缩液 中添加菌株发酵的红参浓缩液与水泡化丁醇以 1:1 的比例倒入试管中进行涡旋 (vortex) 后进。
45、行离心分离， 分离丁醇层和红参浓缩液层， 获得了丁醇提取液。具体而言， 使用了 silica gel 60 F254 TLC plate， 将丁醇提取液滴定到 TLC plate 后， 采用 CHCl3-MeOH-H2O 65:35:10 v/v/v, lower phase的混合溶媒进行了延展。 在延展后的TLC plate上喷雾10% 硫酸后， 加热发色并确认了结果。 0081 其结果， 如图2所示， 筛选的菌株都具有将主要皂甙(saponin)转换为可供体内吸 收的 Rg3, Rd, Rb1 等次要皂甙 (saponin) 的卓越的效果。具体而言， WJ-1 和 6 菌株转换 Rd 和 。
46、Rg3， WJ-2 和 4 转换 Rd， WJ-23 和 33 是转换 Rg3 和 F2 的能力尤其优异。( 见图 2) (2) pH 变化的分析 为 了 分 析 红 参 浓 缩 液 和 各 个 发 酵 菌 株 进 行 发 酵 前 后 的 pH 变 化， 利 用 pH 计 说 明 书 CN 103173379 A 10 9/19 页 11 (Orion-550A) 进行了测量。 0082 其结果， 发酵前的 pH 值为 4.44， 虽说每个菌株都有一定的差异， 但是随着发酵的 进行产生了稍许的酸性 ( 见表 5) 。 0083 【表 5】 不同发酵时间内 pH 值的变化 2h4h8h12h16。
47、h20h24h28h36h44h WJ-14.44.35 4.34 4.37 4.34 4.31 4.31 4.32 4.23 4.15 WJ-24.39 4.36 4.36 4.39 4.34 4.34.29 4.34 4.32 4.27 WJ-44.39 4.36 4.35 4.35 4.35 4.32 4.27 4.34 4.29 4.28 WJ-64.36 4.37 4.35 4.21 4.37 4.38 4.37 4.44.36 4.34 WJ-234.35 4.33 4.36 4.35 4.44.44.36 4.41 4.35 4.37 WJ-334.36 4.35 4.35 4.。
48、31 4.37 4.39 4.37 4.44.34 4.37 (3) 糖度变化的分析 为了分析发酵前后 Brix 的变化， 利用 Brix meter(ATAGO-Rx-5000) 进行了测量。 0084 其结果， 发酵前的糖度为 8.13Brix， 虽说各个菌株有所差异， 但是随着发酵的进 行， 糖度降低了一些 ( 见表 6)。 0085 【表 6】 不同发酵时间里糖度的变化 2h4h8h12h16h20h24h28h36h44h WJ-17.87 7.97.89 7.96 7.91 7.77 7.97.97.92 7.91 WJ-27.97.87 7.86 7.82 7.64 6.76 6。
49、.67 6.62 6.66.43 WJ-47.88 7.87 7.86 7.82 7.64 6.91 6.67 6.77 6.96.88 WJ-67.97.97.93 7.96 7.93 7.89 7.92 7.97.91 7.96 WJ-237.94 7.94 7.91 7.94 7.97.73 7.96 7.92 7.91 7.93 WJ-337.91 7.97.97.93 7.92 7.94 7.95 7.97.91 7.94 实验例 3. 实施方式 2-2 发酵液的特性分析 ( 添加诱导因子的效果 ) 其结果， 如图3所示， WJ-33菌株在添加盐分时比添加蔗糖时相比， 生成了更多的Rg3和 F2( 见图 3)。 0086 并且， WJ-2 菌株在添加蔗糖时， 主要皂甙 。