《一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102921045 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102921045 A *CN102921045A* (21)申请号 201210430662.3 (22)申请日 2012.11.02 A61L 27/46(2006.01) (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇大 学城学园路 2 号福州大学新区 (72)发明人 陈景帝 余其凤 张惠 张玉珏 张其清 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素 复合支架 (5。
2、7) 摘要 本发明公开了一种高生物响应纳米羟基磷灰 石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架及其制备方法， 以壳聚糖 / 硫酸软骨素为有机基体， 钙 - 磷盐溶 液为无机相前驱体 ； 将壳聚糖 / 硫酸软骨素乙酸 溶液与可溶性钙盐和磷酸盐溶液充分混合均匀， 再经交联剂交联， 注模成型， 碱液中原位仿生矿化 结晶， 冷冻干燥， 得到高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架。本发明在材料 制备方面模拟自然骨的组成和结构， 制备工艺条 件温和， 操作简单， 所制备的材料可以根据使用需 要， 进行随意赋形和再加工。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 4 页 (。
3、19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的制备方法， 其特 征在于 ： 以壳聚糖 / 硫酸软骨素为有机基体， 钙 - 磷盐溶液为无机相前驱体 ； 将壳聚糖 / 硫 酸软骨素乙酸溶液与可溶性钙盐和磷酸盐溶液充分混合均匀， 再经交联剂交联， 注模成型， 碱液中原位仿生矿化结晶， 冷冻干燥， 得到高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨 素复合支架。 2.根据权利要求1所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 的制备方法， 其特。
4、征在于 ： 所述的制备方法的具体步骤如下 ： 步骤一 ： 支架前驱体混合液的制备 （1） 配制 1 2mol/L 钙盐溶液和 0.6 1.2mol/L 磷酸盐溶液 ； （2） 将壳聚糖粉末和硫酸软骨素粉末溶解于体积分数为 1 2% 的乙酸溶液中， 搅拌使 各组分混合均匀 ； （3） 将上述 （1） 、（2） 的物料以不同的配比混合得到不同浓度的混合物， 体系中钙 - 磷摩 尔比为 1.67:1， 持续搅拌使其充分混合均匀， 接着加入交联剂进行交联， 得到支架前驱体混 合液 ； 步骤二 ： 纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的成型 （1） 将步骤一所制备的混合液注入模具， 移至4。
5、冰箱静置46 h， 随后放入超低温冰 箱至少冷冻 12h， 接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； （2） 将步骤二 （1） 所得的干燥样品置于碱液中浸泡， 然后再用去离子水反复浸洗至中 性， 超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨 素复合支架。 3.根据权利要求2所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤一 （1） 所述钙盐为硝酸钙或氯化钙 ； 磷酸盐为磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾中的一种。 4.根据权利要求2所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 。
6、的制备方法， 其特征在于 ： 在步骤一 （3） 最终混合液中壳聚糖的浓度为 10 20mg/mL， 硫酸 软骨素的浓度为 2 10mg/mL, 加入的 Ca/P 前驱体溶液理论形成 HAP 量为 8 20mg/mL， 有机基体组分与理论形成 HAP 的质量比为 1 ： 0.4 1。 5. 根据权利要求 2 所述的高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支 架的制备方法， 其特征在于 ： 步骤一 （3） 所述混合体系于常温下交联 4 6h， 交联剂为 EDC/ NHS ； 交联剂 EDC 的浓度为 2 5mg/mL， EDC 和 NHS 的摩尔比为 1.5 5 ： 1。 6. 根。
7、据权利要求 2 所述的高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素 复合支架的制备方法， 其特征在于 ： 步骤二 （1）所述的超低温冰箱中冷冻的温度范围 为 -5 -80。 7.根据权利要求2所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤二 （2） 所述的碱液是质量分数为 5 10 NaOH 的乙醇去 离子水溶液或者质量分数为 5 10 KOH 的乙醇去离子水溶液 ； 所述碱液中乙醇和去离 子水的体积比为 1 3 ： 1。 8.根据权利要求2所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤二 。
8、（2） 所述的干燥样品置于碱液中常温浸泡至少 8 小时。 权 利 要 求 书 CN 102921045 A 2 2/2 页 3 9.根据权利要求2所述的高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨素复合支架 的制备方法， 其特征在于 ： 硫酸软骨素为硫酸软骨素 A 或 C。 10. 一种如权利要求 1 所述的方法制得的高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸 软骨素复合支架。 权 利 要 求 书 CN 102921045 A 3 1/6 页 4 一种纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架 技术领域 0001 本发明属于人工骨修复材料技术领域， 具体涉及一种高生物响应纳米羟基磷灰。
9、石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架及其制备方法。 背景技术 0002 人体骨组织是由弱结晶度的纳米羟基磷灰石和胶原组装复合而成的具有高度精 密结构的自然矿化生物材料。从广义上说， 可被看成是基体中含有纳米晶体的双相复合材 料或者有机 / 无机纳米复合材料， 这为骨修复材料的研究开发提供了灵感和启发， 纳米羟 基磷灰石骨修复复合材料应运而生。所谓纳米复合材料是指分散相尺寸至少小于 100nm 的 复合材料， 由于分散相与基体之间的界面面积大， 能把分散相与基体的性能更充分结合起 来， 因而具有良好的综合性能。通常制备纳米羟基磷灰石骨修复复合材料的方法主要是将 基体材料与人工合成的纳米羟基磷灰。
10、石通过简单的物理机械或化学方式混合均匀后 , 再 注入模具, 冷冻干燥成型。 在简单复合制备的复合材料中羟基磷灰石分散不均匀,易发生 团聚现象， 界面结合力弱 , 使得材料的力学性能下降 , 微观结构无序。原位复合制备技术 是近年来发展起来的一个新兴研究领域， 采用原位复合就地反应制备无机 / 有机系分子复 合材料是一种比较有前景的制备有机 / 无机复合材料的方法， 它可以很好的降低有机 / 无 机界面的界面能， 实现无机粒子在有机基质上的均匀分散。本研究采用原位复合法制备以 壳聚糖/硫酸软骨素为有机基体,均匀分散的纳米HAP为无机相的复合材料, 实现了分子 级复合 , 保证了材料的力学性能。。
11、 0003 壳聚糖是天然的生物材料， 带正电荷， 其结构与细胞外基质中的主要成分糖胺 聚糖十分类似， 其降解产物对人体无毒副作用， 具有良好的生物降解性和生物相容性。硫 酸软骨素是一种带有负电荷的直链糖胺聚糖， 是细胞外基质中的主要成分， 它可促进细胞 贴附， 提高骨组织的强度和韧性， 所以具有极好的生物活性。 壳聚糖、 硫酸软骨素的氨基、 羧 基、 羰基集团对于纳米羟基磷灰石的结晶起着电位互补、 绑定和螯合作用， 引导纳米羟基磷 灰石在有机基体上进行原位结晶， 造成了原位结晶的纳米羟基磷灰石与壳聚糖、 硫酸软骨 素具有一定的相互作用， 起到了降低羟基磷灰石前驱体和壳聚糖、 硫酸软骨素材料间的。
12、界 面结合能， 使得羟基磷灰石在有机基体上形成与基体有相互作用的均匀分散纳米颗粒， 从 而实现了纳米羟基磷灰石在有机基体上的原位结晶。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种高生物响应纳米羟基磷灰石/壳聚糖/硫酸软骨 素复合支架及其制备方法， 根据原位复合制备和仿生矿化原理研制一种结晶度可控、 高度 均匀分散， 且与有机基体之间形成有效稳定键合的纳米羟基磷灰石复合支架， 从而在结构 和功能上实现对天然骨的仿生构建。该方法的制备工艺条件温和， 操作简便， 成本比较低， 制备所得到的支架材料可以根据使用部位和形状的具体要求， 进行加工塑形。 0005 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案。
13、 ： 说 明 书 CN 102921045 A 4 2/6 页 5 一种高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的制备方法， 以壳聚 糖/硫酸软骨素为有机基体， 钙-磷盐溶液为无机相前驱体 ； 将壳聚糖/硫酸软骨素乙酸溶 液与可溶性钙盐和磷酸盐溶液充分混合均匀， 再经交联剂交联， 注模成型， 碱液中原位仿生 矿化结晶， 冷冻干燥， 得到高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架。 0006 所述的制备方法的具体步骤如下 ： 步骤一 ： 支架前驱体混合液的制备 （1） 配制12mol/L钙盐溶液和0.61.2mol/L磷 酸盐溶液 ；（2） 将壳聚糖粉末和硫。
14、酸软骨素粉末溶解于体积分数为 1 2% 的乙酸溶液中， 搅拌使各组分混合均匀 ；（3） 将上述 （1） 、（2） 的物料以不同的配比混合得到不同浓度的混 合物， 体系中钙 - 磷摩尔比为 1.67:1， 持续搅拌使其充分混合均匀， 接着加入交联剂进行交 联， 得到支架前驱体混合液 ； 步骤二 ： 纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的成型 （1） 将步骤一所制备 的混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 4 6 h， 随后放入超低温冰箱至少冷冻 12h， 接着转 入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ；（2） 将步骤二 （1） 所得的干燥样品置于碱液中浸泡， 然后再用去离子水反复浸洗至中。
15、性， 超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得高生物响应纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架。 0007 步骤一 （1） 所述钙盐为硝酸钙或氯化钙 ； 磷酸盐为磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸 二氢钾、 磷酸氢二钾中的一种。 0008 在步骤一 （3） 最终混合液中壳聚糖的浓度为 10 20mg/mL， 硫酸软骨素的浓度为 210mg/mL, 加入的Ca/P前驱体溶液理论形成HAP量为820mg/mL， 有机基体组分与理 论形成 HAP 的质量比为 1 ： 0.4 1。 0009 步骤一 （3） 所述混合体系于常温下交联 4 6h， 交联剂为 1- 乙基 -3-(3- 二甲基 氨丙基 。
16、) 碳二亚胺 (EDC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) ； 交联剂 EDC 的浓度为 2 5mg/mL, EDC 和 NHS 的摩尔比为 1.5 5:1。 0010 步骤二 （1） 所述的超低温冰箱中冷冻的温度范围为 -5 -80。 0011 步骤二 （2） 所述的碱液是质量分数为 5 10 NaOH 的乙醇去离子水溶液或者 质量分数为 5 10 KOH 的乙醇去离子水溶液 ； 所述碱液中乙醇和去离子水的体积比为 1 3 ： 1。 0012 步骤二 （2） 所述的干燥样品置于碱液中常温浸泡至少 8 小时。 0013 硫酸软骨素为硫酸软骨素 A 或 C。 0014 本发明的显著优点在于 。
17、： 壳聚糖是一种含有大量氨基的天然阳离子多糖， 硫酸软 骨素是一种阴离子糖胺聚糖， 将硫酸软骨素与壳聚糖进行交联形成支架有机基体， 在微观 结构和理化性能上， 如表面电荷、 亲疏水性等方面， 与生物大分子存在许多相似性。有机基 体中含有的羧基、 羟基、 磺酸基、 胺基及酰胺基等基团不仅可促进细胞的粘附和生长， 而且 是无机相羟基磷灰石的成核位点。本发明正是利用这些基团在有机基体上有规律的分布， 原位诱导纳米羟基磷灰石的成核结晶， 从而制备出纳米颗粒高度分散、 结晶度可控的高生 物响应纳米复合支架。 0015 制备所得的支架相对于其他复合支架有以下优点 ： (1) 选用壳聚糖、 硫酸软骨素和羟基。
18、磷灰石组分的组合， 这三种组分的生物相容性、 生 物活性均较好， 且三种组分的配比可以调整 ； 说 明 书 CN 102921045 A 5 3/6 页 6 (2) 根据原位复合制备和仿生矿化原理研制一种结晶度可控、 高度均匀分散， 且与有机 基体之间形成有效稳定键合的纳米复合支架， 由于复合支架上纳米颗粒的均匀分散， 复合 支架的力学性能得到了提高 ； (3) 采用乳鼠成骨细胞建立复合支架材料的体外评价模型， 结果表明该材料细胞相容 性好 ； (4) 该高生物响应纳米复合支架的制备工艺条件较温和， 操作简便， 成本较低。 附图说明 0016 图 1-2 是高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖。
19、 / 硫酸软骨素复合支架的扫描电子 显微镜图。 0017 图 3 是高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的 X 射线衍射 图。 0018 图 4-7 是高生物响应纳米羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架与乳鼠成骨 细胞体外复合培养的相差显微镜图 ( 图 4-7 复合培养时间分别 ： 4h， 12h， 72h， 96h ； 由于支 架不透光， 在相差显微镜下表现为阴影 )。 具体实施方式 0019 实施例 1 1） 配制 2mol/L 硝酸钙盐溶液， 1.2mol/L 磷酸二氢钾溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量 比为 10:1 ； 2） 将所述质量配比的壳聚。
20、糖 / 硫酸软骨素溶解于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ; 3） 往上述壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙盐溶液， 磷酸二 氢钾溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.4 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 2mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 1.5:1， 常温交联 6h ； 最终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 4 h， 随后放入 -10超低温冰箱至少冷冻 12h， 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于 5 NaOH 的乙醇去离。
21、子水中常温浸泡 10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -10超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0020 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0021 实施例 2 1） 配制 2mol/L 硝酸钙溶液， 0.6mol/L 的磷酸二氢钾溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量 比为 5:1 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙溶液， 磷酸 二氢钾溶液， 搅拌 1h ； 其中 n。
22、(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.5 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 2.5mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 2:1， 常温交联 5h ； 说 明 书 CN 102921045 A 6 4/6 页 7 最终混合液注入模具， 移至4冰箱静置4h， 随后放入-20超低温冰箱至少冷冻12h,接着 转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于 5 NaOH 的乙醇去离子水中常温浸泡 10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -20超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0022 采用乳鼠成骨细。
23、胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0023 实施例 3 1） 配制 1mol/L 硝酸钙溶液， 1.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 为 10:3 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙溶液， 磷酸 氢二钠溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.6 ； 4） 加入交联剂 EDC。
24、/NHS， EDC 的浓度为 3mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 2.5:1， 常温交联 5h ； 最终混合液注入模具， 移至4冰箱静置6h， 随后放入-80超低温冰箱至少冷冻12h,接着 转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于 5 NaOH 的乙醇去离子水中常温浸泡 10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -80超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0024 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0025 实施例 4 1） 配制 2mol/L 硝酸钙溶液， 0.6。
25、mol/L 磷酸氢二钠溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 为 5:2 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 2% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙溶液， 磷酸 氢二钠溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.7 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 4mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 3:1， 常温交联 6h ； 最终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 4 h， 随后放入 -10超低温冰箱至少冷冻 12。
26、h， 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于5KOH的乙醇去离子水中常温浸泡10h， 再用去离子水反复浸洗 至中性， -10超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0026 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0027 实施例 5 1） 配制 1mol/L 氯化钙溶液， 1.2mol/L 磷酸二氢钾溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 为 2:1 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 2% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨。
27、素混合液中缓慢地加入一定量的氯化钙溶液， 磷酸 说 明 书 CN 102921045 A 7 5/6 页 8 二氢钾溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.8 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 5mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 3:1， 常温交联 5h ； 最 终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 6 h， 随后放入 -20超低温冰箱至少冷冻 12h, 接着 转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于5KOH的乙醇去离子水中常温浸泡10h， 再用去离子水反复。
28、浸洗 至中性， -20超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0028 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0029 实施例 6 1） 配制 2mol/L 氯化钙溶液， 0.6mol/L 的磷酸二氢钾溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量 比为 5:3 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的氯化钙溶液， 磷酸 二氢钾溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:。
29、1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.9 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 4mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 1.5:1， 常温交联 4h ； 最终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 5 h， 随后放入 -10超低温冰箱至少冷冻 12h, 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于5KOH的乙醇去离子水中常温浸泡10h， 再用去离子水反复浸洗 至中性， -10超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0030 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合。
30、支架的细胞学特性。 0031 实施例 7 1） 配制 2mol/L 硝酸钙溶液， 1.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 为 10:7 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙溶液， 磷酸 二氢钠溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:1 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 4mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 2:1， 常温交联 6h ； 最终。
31、混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 4 h， 随后放入 -20超低温冰箱至少冷冻 12h， 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于10NaOH的乙醇去离子水中常温浸泡10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -20超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0032 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0033 实施例 8 1） 配制 2mol/L 硝酸钙溶液， 0.6mol/L 磷酸二氢钠溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 说 明 书 CN 102921045 A 。
32、8 6/6 页 9 为 5:4 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的硝酸钙溶液， 磷酸 二氢钠溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.6 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 5mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 1.5:1， 常温交联 5h ； 最终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 6 h， 随后放入 -20超低温冰箱至少冷冻 12h， 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至。
33、完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于10NaOH的乙醇去离子水中常温浸泡10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -20超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0034 采用乳鼠成骨细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0035 实施例 9 1） 配制 1mol/L 氯化钙溶液， 1.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 ； 壳聚糖、 硫酸软骨素的质量比 为 4:1 ； 2） 将所述配比的壳聚糖 / 硫酸软骨素溶于 1% 乙酸溶液， 充分搅拌均匀 ； 3） 往混合均匀的壳聚糖 / 硫酸软骨素混合液中缓慢地加入一定量的氯。
34、化钙溶液， 磷酸 二氢钠溶液， 搅拌 1h ； 其中 n(Ca2+):n(PO43-)=1.67:1， 有机组分与理论形成 HAP 的质量比为 1:0.7 ； 4） 加入交联剂 EDC/NHS， EDC 的浓度为 5mg/mL， EDC/NHS 摩尔比为 2:1， 常温交联 6h ； 最终混合液注入模具， 移至 4冰箱静置 5 h， 随后放入 -10超低温冰箱至少冷冻 12h, 接 着转入冷冻干燥机中冷冻干燥至完全脱水 ； 5） 将干燥样品置于 10 KOH 的乙醇去离子水中常温浸泡 10h， 再用去离子水反复浸 洗至中性， -10超低温冰箱冷冻后进行冷冻干燥获得产品。 0036 采用乳鼠成骨。
35、细胞建立支架材料的体外评价模型， 考察原位复合仿生合成的纳米 羟基磷灰石 / 壳聚糖 / 硫酸软骨素复合支架的细胞学特性。 0037 本制备方法可以使得原位复合支架根据实际需要预成型成各种形状 ； 由 SEM 图可 以观察到支架形成较好的相互贯穿的连通孔隙结构， 支架孔壁上有均匀分布的细小的纳米 颗粒。由支架的 XRD 图谱， 可发现支架中的无机结晶物的衍射峰与 HAP 的特征峰一致， 且其 衍射峰存在宽化、 弥散现象， 说明支架上已原位形成弱结晶度的纳米羟基磷灰石。 成骨细胞 与支架材料联合培养， 从相差显微镜图可以看出， 加入细胞悬液后， 细胞在材料边缘无规则 分布， 12 h后细胞呈梭形。
36、、 多角形平铺并有向材料端趋向的趋势， 72 h后可以观察到细胞已 经不断增殖。随着培养时间的延长和细胞的增殖， 可以发现材料边缘聚集着越来越多的细 胞， 在联合培养过程中成骨细胞一直保持着良好的生长状态， 说明复合支架的细胞相容性 好。 0038 以上所述仅为本发明的较佳实施方式， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化 与修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说 明 书 CN 102921045 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102921045 A 10 2/4 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102921045 A 11 3/4 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102921045 A 12 4/4 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 102921045 A 13 。