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1、(10)申请公布号 CN 104224862 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104224862 A (21)申请号 201410253975.5 (22)申请日 2014.06.09 10-2013-0065519 2013.06.07 KR A61K 36/185(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61K 8/97(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (71)申请人 韩国原子力研究院 地址 韩国大田广域市 (72)发明人 郑一来 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 。
2、11002 代理人 谢顺星 王莹 (54) 发明名称 含辣木叶水溶性提取物为有效成分的用于治 疗或预防癌的组合物及辣木叶提取物的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及含有辣木叶水溶性提取物作为有 效成分的用于治疗或预防癌症的组合物， 以及对 于抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法， 本发明 的组合物对正常细胞的毒性低但对癌细胞显示出 优异的毒性， 且因为是水溶性而细胞内吸收非常 容易， 因此作为口服制剂的抗癌治疗剂具有有利 的优点， 从而能够应用于天然物抗癌新药的开发。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 16 页 序列表 2 页 附图 8 页 (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书16页 序列表2页 附图8页 (10)申请公布号 CN 104224862 A CN 104224862 A 1/1 页 2 1. 用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在于， 含有辣木叶的水溶性提取物作为 有效成分。 2. 根据权利要求 1 所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在于， 所述辣木 叶的水溶性提取物是使用水作为提取溶剂而得到的。 3. 根据权利要求 2 所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在于， 所述水的 温度为 0以上且低于 40。 4. 根据权利要求 3 所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物。
4、， 其特征在于， 所述辣木 叶提取物是将辣木叶在水中浸渍 1-60 分钟而得到。 5. 根据权利要求 3 所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在于， 所述辣木 叶提取物是将干燥的辣木叶在 0-20的水中浸渍 1-30 分钟而得到。 6. 根据权利要求 1-5 中任意一项所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在 于， 所述药物组合物， 相对于总组合物， 以提取物的蛋白质浓度为基准含有 0.001-600g/ ml 的辣木叶提取物。 7. 根据权利要求 1-5 中任意一项所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在 于， 所述癌选自肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 扁平上皮癌及纤维瘤。
5、中的一种以上。 8. 根据权利要求 1-5 中任意一项所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在 于， 该组合物进一步含有药学上可接受的载体。 9. 根据权利要求 8 所述的用于治疗或预防癌症的药物组合物， 其特征在于， 所述药物 组合物为包括片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 液剂、 混悬剂、 乳剂或胶囊剂的口服制剂。 10. 用于预防或改善癌症的食品组合物， 其特征在于， 含有辣木叶水溶性提取物作为有 效成分。 11. 用于预防或改善皮肤癌的化妆品组合物， 其特征在于， 含有辣木叶水溶性提取物作 为有效成分。 12. 对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法， 其特征在于， 使用 。
6、0-20的水提取辣木 叶。 13. 根据权利要求 12 所述的对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法， 其特征在于， 包 括 ： 将辣木叶在 1-20 倍的 0-20的水中浸渍的步骤 ； 收集辣木叶浸出液， 去除不溶性物质 的步骤 ； 及对去除不溶性物质的浸出液进行过滤的步骤。 14. 根据权利要求 13 所述的对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法， 其特征在于， 所 述的将辣木叶在 0-20的水中浸渍的步骤中， 辣木叶的浸渍时间为 1-60 分钟。 权 利 要 求 书 CN 104224862 A 2 1/16 页 3 含辣木叶水溶性提取物为有效成分的用于治疗或预防癌的 组合物及辣木叶提取物的制备。
7、方法 技术领域 0001 本发明涉及含有辣木 (Moringa oleifera) 叶水溶性提取物作为有效成分的用于 治疗或预防癌症的药物组合物、 含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的组合物及对抗癌 有效的辣木叶提取物的制备方法。 背景技术 0002 辣木是原产地为印度的小灌木但在世界任何地方都有栽培， 在广泛利用 辣木的地区已经被移入而野生。辣木科有 13 种辣木树， 其中， 最为人所熟知的是印度传统 辣木。印度传统辣木是以伞状展开的 4-8 米高的灌木。其特征为， 30-70cm 长度的叶子为落 叶性， 花为白色、 香浓， 果实为绿色、 革质和悬垂的长三角形长荚， 长达 30-40cm， 。
8、原生于印度 西北部喜马拉雅山坡上， 是在所有热带地区栽培的多用途的树种之一。 0003 辣木是原生于东南亚等地的植物， 富含营养成分， 而被称为奇迹之树， 已知其具有 抗糖尿病、 抗癌、 抗过敏等多种效果。虽然目前有利用辣木的单一的保健食品在销售， 但是 作为真正的抗癌剂还没有开发和上市。其理由是对辣木抗癌效果的科学论证资料不足， 没 有进行临床试验。且虽然开发了多种利用以往的辣木提取物的组合物， 但到目前为止的辣 木提取法主要依靠醇提法， 辣木醇提提取物虽然能够在实验室中应用， 但是还没有实际地 将癌症患者或动物癌症模型为对象进行的研究。 以往公知的辣木提取物相关专利有日本专 利公开公报第 。
9、2006-508902 号， 其组合物中含有辣木提取物作为有效成分， 但仅涉及血管 性头痛或神经疾病的治疗效果。此外， 美国专利公开公报第 2007-0264366 号公开有已知的 辣木叶提取物是利用乙醇提取， 并仅记 载其抗真菌效果。 0004 另外， 癌症患者的治疗方法的现状为主要依赖外科手术、 放射疗法以及通过使用 显示 40 多种强细胞毒性的抗癌物质给药的化学疗法， 这些疗法大部分只局限于早期癌症 患者或特定癌症， 因此癌症引起的死亡是继续增加的趋势。 0005 以往作为抗癌剂使用的物质不仅对癌细胞产生影响， 还对正常细胞显示毒性， 因 此发生很多导致副作用的情况。 此外， 现有的抗癌。
10、剂大部分主要是非水溶性物质， 因此具有 抗癌物质在细胞内吸收困难的缺点。为了溶解这些抗癌物质动用了多种附加方法， 因此还 可能导致由此引起的副作用， 还发生抗癌剂的药效降低的问题， 为了增加吸收同时还使用 促吸收剂。且以往的注射剂型的抗癌剂显示出多种毒性和副作用， 由于反复注射给药的困 难而给患者带来不便。因此迫切需要一种对正常细胞不产生毒性， 仅对癌细胞选择性地显 示优异毒性， 且给药便利性及人体吸收性提高的抗癌治疗剂。 0006 本发明发明人为了解决抗癌治疗剂的上述问题， 在天然物辣木叶中寻找有效的抗 癌成分而深入研究， 结果发现以水作为提取溶剂得到的辣木叶提取物具有优异的抗癌效 果， 由。
11、此完成了本发明。 0007 现有技术文献 0008 专利文献 说 明 书 CN 104224862 A 3 2/16 页 4 0009 专利文献 1 日本专利公开公报第 2006-508902 号 (2006 年 3 月 16 日公开 ) 0010 专利文献 2 美国专利公开公报第 2007-0264366 号 (1995 年 11 月 21 日公开 ) 发明内容 0011 发明目的 0012 本发明的目的在于提供含有辣木叶提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症 的药物组合物。 0013 本发明的另一目的在于提供含有辣木叶提取物的用于改善或预防癌症的食品组 合物及化妆品组合物。 0014 本发。
12、明的又一目的在于提供对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法。 0015 技术方案 0016 为了解决上述目的， 本发明一实施例中提供含有辣木叶的水溶性提取物作为有效 成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。 0017 在本发明的药物组合物中， 作为优先实施例为了得到所述辣木叶的水溶性提取 物， 可以使用水作为提取溶剂。此外， 用作所述提取溶剂的水可以使用低于 40的温度， 优 选使用 0-20， 更优选使用 0-10的水， 但不限于此。 0018 所述辣木叶提取物可以将辣木叶浸渍于提取溶剂中得到。此时， 辣木叶在水中浸 渍的时间优选为 1-60 分钟， 但不限于此。 0019 作为更优选实施例， 作。
13、为有效成分而包含于本发明的组合物中的辣木叶提取物， 可以使用在0-20的水中浸渍1-30分钟而得到的辣木叶提取物。 此外， 优选以辣木叶体积 为基准， 使用 1-20 倍体积的水进行浸渍得到， 但不限于此。 0020 根据本发明的药物组合物想要预防或治疗的癌症可以是所有的癌症， 优选肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 扁平上皮癌及纤维瘤， 更优选为肺癌或肝癌。 0021 本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体。 且本发明的药物组合物使用水溶性溶剂， 尤其是使用水作为提取溶剂， 因此具有能够容易 以口服吸收的制剂制备的优点， 优选制备为片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂。
14、、 液剂、 混悬 剂、 乳剂或胶囊剂等口服制剂， 但不限于此， 也可以制备为非口服制剂。 0022 此外， 本发明另一实施例中提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于预 防或改善癌症的食品组合物。 此外， 本发明还提供含 有辣木叶水溶性提取物作为有效成分 的用于预防或改善癌症的化妆品组合物。 0023 本发明的又一实施例中提供对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法， 其特征为， 使用 0以上且低于 40的水提取辣木叶。 0024 所述辣木叶提取物的制备方法， 包括 ： 将辣木叶在以辣木叶体积为基准 1-20 倍体 积的 0-20的水中浸渍的步骤 ； 收集辣木叶浸出液， 去除不溶性物质的步骤 ；。
15、 及对去除所 述不溶性物质的浸出液进行过滤的步骤。所述的将辣木叶在水中浸渍的步骤中， 优选将辣 木叶在水中浸渍 1-60 分钟进行提取。 0025 下面详细说明本发明。 0026 本发明中使用的术语 “预防” 是指给药本发明的组合物而抑制癌症或延迟癌症的 进行的所有行为。 说 明 书 CN 104224862 A 4 3/16 页 5 0027 本发明中使用的术语 “治疗” 是指给药本发明的组合物而癌症症状好转或变得有 利的所有行为。 0028 本发明中使用的术语 “给药” 是指使用任意的适当的方法， 向个体提供规定的本发 明组合物。 0029 本发明中使用的术语 “药学上有效的量” 是指可适。
16、用于医学治疗的合理的受惠量 或风险比例的用于治疗疾病的充分的量， 这可以根据个体的疾病的种类、 严重程度、 药物的 活性、 对药物的敏感性、 给药时间、 给药途径及排泄比例、 治疗期间、 包括同时使用的药物等 因素以及其他医学领域公知的因素决定。 0030 本发明的一实施例涉及含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于治疗或预 防癌症的药物组合物。 0031 在本发明的药物组合物中， 以有效成分而含有的所述辣木叶提取物为水溶性提取 物， 其特征为使用水溶性溶剂， 尤其是使用水作为提取溶剂。根据本发明的一实施例， 可以 确认使用水作为提取溶剂时， 相比使用其他有机溶剂得到的提取物， 其癌细胞的杀灭。
17、效果 更优异 ( 图 15)。 0032 此外， 作为本发明药物组合物中含有的提取物的提取溶剂使用的水的温度优选低 于40的温度。 因此根据本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物中含有的有效成分可 以大部分是辣木叶水溶性成分。 现有的辣木叶提取物大部分使用乙醇或甲醇等有机溶剂作 为提取溶剂或使用热水提取物法。使用上述有机溶剂提取或热水提取的情况时， 活性成分 的化学结构内具有巨大的疏水性基团， 从而具有低水溶性， 因此具有难以剂型化， 且即使给 药到体内也很难吸收的问题。 相反， 本发明使用低温水对辣木叶进行提取， 提取物中含有水 溶性成分， 细胞内的吸收容易， 具有易溶于水的优点， 因此可以。
18、有效用作口服抗癌治疗剂。 0033 作为上述提取溶剂使用的水优选低于 40温度的水， 更优选 0以上 20以下的 水， 最优选 0以上 10以下的水。可以确认提取溶剂水的温度为 40以上时， 即使提高 提取物的浓度处理， 提取物对癌细胞生存的影响甚微， 温度越低对癌细胞的毒性越低 ( 图 1a)。 0034 此外， 本发明的提取溶剂的浸渍时间优选为 1 小时以内， 浸渍时间为 30 分钟以内 的提取物对癌细胞的存活显示出更优异的毒性效果 ( 图 1b)。 0035 因此， 作为更优选的实施例， 本发明的辣木叶提取物可以是在 0以上至 10以 下的水中浸渍 1-30 分钟而得到的。 0036 本。
19、发明的药物组合物以有效成分包含的辣木叶水溶性提取物， 其特征为， 以辣木 叶体积为基准， 浸渍于 1-20 倍的水中得到。根据本发明一实施例的辣木叶提取物优选使用 干燥的辣木叶粉末， 但不限于此， 也可以使用没有干燥的辣木叶。 0037 本发明中， 所述癌症可以是选自肝癌、 胃癌、 结肠癌、 乳腺癌、 肺癌、 扁平上皮癌、 纤 维瘤、 非小细胞性肺癌、 骨癌、 胰腺癌、 皮肤癌、 头部或颈部癌、 皮肤或眼球内黑色素瘤、 子 宫癌、 卵巢癌、 直肠 癌、 肛周癌、 输卵管癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 阴道癌、 外阴癌、 何杰金式 病 (Hodgkins disease)、 食道癌、 小肠癌、 内。
20、分泌腺癌、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 肾上腺癌、 软组织肉瘤、 尿道癌、 阴茎癌、 前列腺癌、 慢性或急性白血病、 淋巴癌、 膀胱癌、 肾癌或输尿管 癌、 肾细胞癌、 肾盂癌、 中枢神经系统 (Central nervous system， CNS) 肿瘤、 原发性 CNS 肿 瘤、 脊髓瘤、 脑间神经胶质瘤或脑垂体腺瘤组成的组中的一种以上， 优选为选自肝癌、 乳腺 说 明 书 CN 104224862 A 5 4/16 页 6 癌、 肺癌、 扁平上皮癌及纤维瘤组成的组中的一种以上， 优选为肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 扁平上 皮癌及纤维瘤中的一种以上， 更优选为肺癌或肝癌， 但不限于此。本发明一。
21、实施例中， 给实 验小鼠口服给药辣木叶提取物 1 次， 结果发现辣木叶提取物对肝癌及肺癌细胞具有优异的 抑制效果 ( 图 14)。 0038 本发明的药物组合物以药物组合物的总重量为基准， 可以含有 0.01-50 重量的 辣木叶提取物作为有效成分， 进一步含有药学上可接受的载体。 0039 此外， 将所述含有辣木叶提取物的药物组合物剂型化时， 可以使用通常使用的填 充剂、 增量剂、 结合剂、 湿润剂、 崩解剂、 表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制备。 0040 本发明的药物组合物可根据药学领域的通常的方法， 以适合给药到患者体内的单 位给药型制剂剂型化。 适于这种目的的剂型中非口服给药剂型优选注。
22、射用溶液或混悬液或 可注射时使用注射用蒸馏水而制备的即时使用型注射用干燥粉末等注射用制剂 ； 或软膏剂 等局部给药用制剂等。此时， 可以同时使用通常使用的填充剂、 增量剂、 结合剂、 湿润剂、 崩 解剂、 表面活性剂等稀释剂或赋形剂。此外， 本发明的药物组合物还可以制备成片剂、 水性 或油性混悬液、 分散用粉末或颗粒、 乳剂、 硬质或软质胶囊、 糖浆或酏剂等适合口服给药的 口服型制剂。这些组合物的制备可以通过本领域技术人员公知的任意的方法制备。 0041 本发明的药物组合物含有水溶性提取物作为有效成分， 因此优选为片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 液剂、 混悬剂、 乳剂或胶囊剂的口服。
23、制剂， 但不限于此。用于口服 给药的上述固体制剂可以在所述提取物中混合至少一种以上的如淀粉、 碳酸钙 (calcium carbonate)、 蔗糖(sucrose)、 乳糖(lactose)或明胶等赋形剂制备。 此外， 除了单一的赋形 剂之外， 还可以使用硬脂酸镁、 滑石等润滑剂。 0042 本发明的药物组合物还可以进一步包含向需要进行癌症治疗的患者给药的药剂， 所述药剂选自由抗生素、 烷基化剂、 抗代谢药、 激素物质、 免疫学制剂、 干扰素制剂及其他抗 癌剂组成的组中的 1 种以上。但是本发明的医药用途及治疗用药物组合物并不限于上述内 容， 且可联用的其他药剂也不限于上述内容。 0043 。
24、本发明药物组合物的优选给药量根据患者的状态、 体重、 疾病程度、 药物形态、 给 药途径及给药期间而不同， 可由本领域技术人员进行适当的选择。但为了理想的癌症治疗 或预防效果， 本发明的提取物优选以每日 0.0001-600g/ml， 更优选 0.001-600g/ml 的 量给药。此时所述提取物的给药量以提取物中包含的蛋白质的浓度为基准， 而不是提取物 的干燥重量。因此， 实际给药时提取物干燥重量可能比所述蛋白质的用量更高。即根据本 发明的具体实施例， 实际给药的提取物的干燥重量大概为蛋白质用量的 3 倍， 因此如果是 以相对于总组合物的提取物干燥重量为基准的话， 给药量优选为 0.0001。
25、-18000g/ml。此 外本发明的组合物以 Kg 为基准时， 优选所含的提取物干燥重量为 50mg/Kg 以上， 更优选 200mg/Kg。 0044 给药方式可以是 1 天给药 1 次， 或分为数次给药。根据本发明的一实施例， 向小鼠 口服给药 200mg/Kg( 相对于总组合物的提取物干燥重量 ) 的本发明提取物时， 能够获得确 切的癌细胞抑制效果。有效成分的实际给药量可根据癌细胞的量、 给药途径、 患者体重、 年 龄及性别等各种相关因素决定， 因此上述给药量不管是选择哪种形式， 都 不限定本发明的 范围。 0045 本发明的提取物可以通过多种途径给药到大鼠、 小鼠、 家畜、 人类等哺乳。
26、动物。可 说 明 书 CN 104224862 A 6 5/16 页 7 使用所有的给药方式， 例如， 可通过经口给药、 直肠给药， 或静脉、 肌肉、 皮下、 子宫内膜或脑 血管内 (intracerebrove ntricular) 注射给药。 0046 此外， 本发明提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于预防或改善癌症 的食品组合物。所述食品组合物可以直接添加辣木叶水溶性提取物， 或可以与其他食品或 食品成分一起使用， 按照通常的方法适当地使用。添加到所述食品组合物的辣木叶水溶性 提取物优选使用将辣木叶利用水作为提取溶剂得到的。 作为提取溶剂的水优选使用40以 下的水， 更优选0以上。
27、至20以下的温度。 使用20以下的水作为提取溶剂时， 可以得到 对预防或改善癌症具有更优异的效果的辣木叶提取物。此外， 辣木叶提取物优选将辣木叶 浸渍于水中得到， 此时浸渍时间在 1 小时以内时， 能够得到预防或改善癌症的效果更好的 提取物。 0047 对所述食品的种类没有特别的限制。 能够添加所述辣木叶提取物的食品的具体实 例有肉类、 香肠、 面包、 巧克力、 糖果类、 点心类、 饼干类、 披萨、 方便面、 其他面类、 口香糖类、 包括冰淇淋的乳制品、 各种汤、 饮料、 茶、 保健饮料、 酒精饮料及维生素复合制剂等， 包括所 有通常含义的食品。 0048 本发明的食品组合物中的饮料组合物与通。
28、常的饮料一样可以含有各种增香剂或 天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物为葡萄糖、 果糖等单糖 ； 麦芽糖、 蔗 糖等双糖 ； 及糊精、 环糊精等多糖 ； 木糖醇、 山梨醇、 赤藓醇等糖醇。甜味剂可以使用索马 甜、 甜菊提取物等天然甜味剂 ； 糖精、 阿斯巴甜等合成甜味剂等。以本发明组合物 100ml 为 基准， 所述天然碳水化合物的比例通常约为 0.01-0.04g， 优选约为 0.02-0.03g。除了上述 成分之外， 本发明的辣木叶提取 物还可以含有各种营养剂、 维生素、 电解质、 增味剂、 着色 剂、 果胶酸及其盐、 海藻酸及其盐、 有机酸、 保护性胶体增稠剂、 pH 调节剂。
29、、 稳定剂、 防腐剂、 甘油、 酒精、 碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这种添加剂的比例并不是很重要， 通常以本发 明组合物 100 重量份为基准， 在 0.01-0.1 重量份范围内进行选择。 0049 此外， 本发明提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的化妆品组合物。所述 化妆品组合物具有改善或预防皮肤癌的效果， 更优选具有改善或预防扁平状皮肤癌的效 果。根据本发明化妆品组合物优选含有以水作为提取溶剂得到提取物作为有效成分。且此 时提取使用的水的温度优选使用低于 40的水， 更优选为 0以上至 20以下。此外， 包 含于所述化妆品组合物的辣木叶提取物优选将辣木叶浸渍于水中而得到， 此时浸渍时。
30、间为 1 小时以内时能够得到具有更好的预防或改善皮肤癌活性的提取物。根据本发明的化妆品 组合物除了有效成分之外， 还可以含有化妆品组合物中通常利用的成分， 例如还含有抗氧 化剂、 稳定剂、 溶解剂、 维生素、 颜料及香料等通常的助剂， 以及载体。 此外， 所 述化妆品组合物为了增强其效果还可以进一步含有皮肤吸收促进物质。 本发明的化妆品组 合物可以制备为本领域通常制备的任何剂型。 0050 本发明的另一实施例涉及对抗癌有效的辣木叶的提取物的制备方法， 其特征为， 将辣木叶使用 0以上 20以下的水进行提取。 0051 根据本发明的辣木叶提取物的制备方法包括 ： 0052 将辣木叶在以辣木叶体积。
31、为基准的 1-20 倍的 0-20的水中浸渍的步骤 ； 收集辣 木叶浸出液， 去除不溶性物质的步骤 ； 及对去除不溶性物质的浸出液进行过滤的步骤。 0053 本发明中， 所述辣木叶提取物优选在辣木叶中加入 1-20 倍的水， 浸渍一定时间后 说 明 书 CN 104224862 A 7 6/16 页 8 获得， 优选浸渍 1-6 分钟。所述辣木叶优选使用干燥的辣木叶， 但不限于此， 也可以使用没 有干燥的辣木叶。 0054 所述不溶性物质的去除可以利用离心分离进行。 本发明的一实施例中在12000rpm 条件下离心分离 10 分钟， 进行 3 次， 仅取上清液， 从而去除不溶性物质。 0055。
32、 此外， 所述过滤可以利用气孔尺寸为微米单位的滤布或滤纸将提取物分离为提取 液和残余提取原料固体成分， 过滤的提取液进一步使用气孔尺寸为纳米单位的膜滤器过 滤， 从而去除杂质 ( 异味成分或色素成分 )。将通过上述过滤获得的滤液进行浓缩， 从而可 以制备成液状辣木叶提取物， 还可以通过干燥制备成粉末形态。 此时， 干燥方法的种类不受 特别的限制， 但为了使活性成分的热变性最小化， 优选冷冻干燥。 0056 发明效果 0057 作为有效成分包含在本发明的组合物中的使用水作为提取溶剂提取的辣木叶提 取物， 对癌细胞的生长、 迁移及浸润具有卓越的抑制效果， 具体地， 对癌细胞的生长、 迁移及 浸润能。
33、力相比正常细胞在癌细胞中显示出更高的毒性， 且在诱导肝癌和肺癌的动物模型中 仅口服给药 1 次的情况下也显示出高的抗癌效果。根据本发明的组合物对正常细胞的毒性 低， 但对癌细胞显示出优异的毒性， 不仅因为是水溶性的而在细胞内的吸收及传递非常容 易， 而且能够克服有机溶剂提取时溶剂自身有毒性且难以制剂化的缺点， 因此作为口服制 剂的抗癌治疗剂具有有利的优点。从而本发明能够有效用于天然物抗癌新药的开发。 附图说明 0058 图 1 表示本发明组合物对 A549 肺癌细胞的增殖产生的效果的 MTT 分析结果。图 1a 表示在不同温度浸渍 30 分钟而得的提取物对 A549 肺癌细胞增殖产生的实验效果。
34、。图 1b 表示根据不同浸渍时间制备的辣木叶提取物的癌细胞抑制效果。 0059 图 2 是表示本发明一实施例在 A549 细胞中的细胞凋亡 (apoptos is) 诱发效果 的图。图 2a 是 FACScan 分析结果， 框中的数字表示 G0/G1 流分 (fraction) ； 图 2b 是半胱 天冬酶 -3(caspase-3) 的蛋白免疫印迹测定的结果。 0060 图 3 是表示独立进行 5 次实验而平均化的辣木提取物对 A549 细胞的细胞凋亡诱 导效果的谱图。 0061 图 4 是对其它癌细胞的辣木叶提取物的细胞凋亡诱导效果的 FACS 分析结果。 0062 图 5 是表示辣木叶提。
35、取物对细胞增殖的抑制效果的图。图 5a 是显微镜照片 (400) 和利用细胞计数器 (cell counter) 计算的细胞数 ； 图 5b 是表示通过集落形成测 定 (colony forming assay) 得到的集落数。 0063 图 6 是表示通过集落形成测定的辣木叶提取物对其它癌细胞的抑制效果。 0064 图 7 是表示使用本发明辣木叶提取物处理的 A549 细胞的迁移性分析结果。图 7a 是光学显微镜照片 ； 图 7b 表示平均迁移率。 0065 图 8 是表示通过 DCFH-DA 处理的活性氧簇， 用本发明组合物对细胞进行处理之后 使用 FACScan 对细胞内部的 ROS 水。
36、平进行分析的结果。 0066 图 9 是使用本发明组合物处理细胞后的蛋白质表达水平的蛋白免疫印迹测定的 结果。 0067 图 10 是对使用本发明组合物处理及未处理时进行比较的总细胞蛋白的 SDS-PAGE 说 明 书 CN 104224862 A 8 7/16 页 9 电泳照片。 0068 图 11 是基因微阵列的结果 ； 图 11a 是微阵列结果 ； 图 11b 是与上调的基因相关的 功能分析结果 ； 图 11c 是没有任何变化的基因的功能分析结果。 0069 图 12 是 rRNA 降解 (degradation) 的示意图。 0070 图 13 是正常细胞和癌细胞的细胞增殖的比较结果图。
37、。 0071 图 14a 表示中空纤维测定法 (hollow fi ber assay) 的试验方法 ； 图 14b 表示中空 纤维测定的结果。 0072 图15是分别使用水、 70乙醇、 100DMSO作为提取溶剂时， 辣木叶提取物的细胞 凋亡诱导效果的 FACS 分析结果。 具体实施方式 0073 以下通过实施例进一步详细说明本发明。但本发明可以以多种不同形式实施， 并 不由在此说明的实施例所限定。 且本发明中使用的术语、 技术等在没有特别限定的情况下， 应解释为本领域通常使用的含义。 0074 实施例 1 ： 根据提取时间的辣木叶提取物的制备 0075 干燥的辣木叶 (M.oleifer。
38、a leaves) 购自 GL 网络公司 (GL Net work Co.Ltd.) ( 在泰国清迈栽培 )。将 150mg 的干燥的辣木叶在 4的 1ml 水中浸渍， 进行 30 秒的涡旋 (vortexing)， 然后在冷藏室中搅拌保存。各实施例在冷藏室的保存时间各不相同， 即各实 施例的浸渍时间如下表 1 中所示进行不同设置。将浸渍时间不同的各浸渍物在室温下再次 进行 1 分钟的涡旋。此后通过进行 3 次离心分离 (12000r pm， 10 分钟 )， 将浮游物的不溶性 部分去除， 接着将上清液(supern atant)进行过滤(0.2M膜滤器)， 得到最终产物。 最终 的辣木叶提取。
39、物进行冷冻干燥， 并在 -20下储藏。 0076 表 1 0077 实施例 1 实施例 2 实施例 3 实施例 4 实施例 5 5 分钟30 分钟1 小时3 小时24 小时 0078 实施例 2 ： 根据提取温度的辣木叶提取物的制备 0079 按照与实施例 1 相同的方法制备辣木叶提取物， 不同的是， 将浸渍时间固定为 30 分钟， 各提取溶剂 ( 水 ) 的温度按照下表中所示进行不同设置。 0080 表 2 0081 实施例 6 实施例 7 实施例 8 实施例 9 20406080 0082 用于下述实验的冷冻干燥的辣木叶提取物在对蛋白质浓度进行定量后， 在蒸馏水 (D.W.) 中悬浮， 以。
40、使蛋白质浓度为 20mg/ml。以下实验中所用的辣木叶提取物的浓度是表 示蛋白质的浓度。 0083 实验方法 0084 1、 根据辣木叶提取物浓度的试样的准备 0085 辣木叶干燥粉末 100g 使用蒸馏水进行提取时， 在冷冻干燥提取物的情况下， 获得 总重为 17.5g 的具有活性的水溶性干燥粉末。从起始原料得到水溶性干燥粉末的收率约为 说 明 书 CN 104224862 A 9 8/16 页 10 17.5。 0086 此外， 取通过所述方法得到的冷冻干燥粉末 1g 在 10ml 的蒸馏水中溶解并对蛋 白质定量的情况下， 上述试样中含有的蛋白质量为 322mg， 在干燥试样中蛋白质含量约。
41、为 32。使用起始原料辣木叶 100g 进行提取， 因此根据上述蛋白含量计算的话最终蛋白质的 收率为 322mg*17.5 5.6。 0087 即 1g 的原料使用蒸馏水进行提取时得到 0.175g 的水溶性干燥粉末、 0.056g 的蛋 白质， 具有活性的水溶性干燥粉末中含有的蛋白质达 32。 0088 下面所有实施例中使用的标准均以蛋白质浓度为基准， 导入到上述提取结果时， 每克干燥重量含有 32的蛋白质， 因此含有 20mg/mL 蛋白质的试样最终换算为干燥重量时 大约相当于 60mg/mL 的干燥重量。即想要将实验所使用的活性提取物的所有蛋白质浓度换 算为干燥重量的话乘以3倍即可。 即。
42、以蛋白质浓度为基准使用100、 200、 300g/mL浓度时， 相当于 300、 600、 900g/mL 的干燥重量。下面没有特别说明的情况下所有试样的浓度都是 以蛋白质的浓度为基准。 0089 2、 细胞培养 (cell culture) 0090 为确认本发明效果而用于实验的肺癌细胞系 (Lung cancer cell line)A549、 肝 癌细胞系 (Hepatocellular carcinoma(HCC)cell li ne)HpG2 及源自肾脏的细胞系 ( 非 洲绿猴肾细胞， African green monkey kidney cells(COS-7) 购自 ATCC。
43、( 美国典型培养物 保藏中心， American Type Culture Collection ； 美国 ) 及韩国细胞系银行 (K orean Cell Line Bank， KCLB)。细胞在加入了 10 FBS( 胎牛血清， fetal bovine serum ； Hyclone Lab 公司， 美国 ) 和 1的青霉素 - 链霉素的 RPMI-1640(A549、 H23 和 H358) 或 DMEM(HpG2、 MC F-7、 A431、 HT1080 和 COS-7) 培养基中培养。将培养的细胞分别以 1105细胞接种于 6 孔 板， 然后在 37、 95空气 /5 CO2条件。
44、下维持。 0091 3、 细胞存活率分析 (MTT assay) 0092 细胞的存活能力通过使用四氮唑 (tetrazolium) 的细胞增殖分析方法MTT 分析 法进行分析。将细胞以每 100l 的培养基为基准以 3103的细胞浓度接种于 96 孔板。培 养 1 天之后， 使用实施例制备的辣木叶提取物以 0-400g/ml 的不同浓度在各板上进行处 理。继续培养 1 天或 2 天后， 向各孔中添加 10l 的 cell-counting Kit-8(Cat.No.CK04， 同仁化学研究所， 日本 ) 或 WST assay 试剂 (DAEIL LAB SERVICE， 韩国 )， 培养 。
45、4 小时。然 后， 利用酶标仪(microplate rea der)(型号680， 伯乐公司)在450nm波长处测定吸光度。 0093 4、 流式细胞分析 (Flow cytometric detection) 0094 在 6 孔板上以 1105细胞 /ml 接种细胞之后， 培养 1 天， 然后使用不同浓度的辣 木叶提取物进行处理。继续培养 2 天收集细胞， 用 PBS 洗涤之后， 在暗处使用 70乙醇在 4条件下反应 2 小时进行固定。固定的细胞使用 PBS 洗涤 2 次之后， 在室温下使用 50g/ ml 的碘化丙啶 (propidium iodide， PI) 进行 30 分钟染色。。
46、DNA 的量使用 F ACScan(EPICS XL流式细胞仪， 贝克曼库尔特计数器(Beckman Coulter Counter)测定。 各个细胞周期中 显示的效果通过在细胞周期各个时期中显示的细胞排列的 ( 百分率 ) 变化来进行测定， 通过 凤凰多循环软件 (Pheonix Multicycler software)( 凤凰流式系统， Ph oenix Flow System) 决定。 0095 5、 显微镜观察 (Microscopy) 说 明 书 CN 104224862 A 10 9/16 页 11 0096 为了观察细胞形态， 使用光学显微镜(徕卡显微系统， Leica Mi 。
47、crosystems)将细 胞可视化。使用佳能数码照相系统 (Cannon Digital Camera system)( 型号 ： Power Shot S45) 对影像进行捕捉。 0097 6、 cDNA 合成及 PCR 扩增 0098 各细胞 (1105细胞 ) 接种于 6 孔培养板中， 培养 1 天后， 使用本发明的辣木叶 提取物处理各细胞。继续培养 2 天后， 通过使用高纯 RNA 分离纯化试剂盒 (High Pure RNA isolation kit， Roche， Cat.No.11828665001) 从各细胞分离出总 RNA。为了使用 oligo dT 从总 RNA(1g)。
48、 中生产 cDNA， 利用了 cDNA 合成试剂盒 (cDNA synthe sis kit， Maxim RT Premix Kit-Oligo dT引物， iNtRON生物技术公司， 韩国)。 最终， cDNA通过使用Maxim PCR Premix Kit-iTaq(i NtRON生物技术公司， 韩国)由引物进行扩增。 使用的各引物的碱基序 列在表 3 中示出。扩增的 PCR 产物通过琼脂糖凝胶 (1.5 ) 电泳分析。其结果通过 UV 光 ( 智能凝胶显影分析系统， Smart gel im aging analysis system， 北京赛制创业科技有限 公司 ) 可视化。 009。
49、9 表 3 0100 0101 7、 免疫蛋白印迹分析 (Western blot analysis) 0102 各细胞 (1105细胞 ) 接种于 6 孔培养板中， 培养 1 天后， 使用本发明的辣木 叶提取物处理各细胞。继续培养 2 天后， 为了进行蛋白免疫印迹分析， 重新收集细胞 并将其裂解 (lysed)。用于蛋白免疫印迹分析的抗体均购自生物信号技术公司 (Cell Signalling Technology)-actin:Cat.No.cs4967， Akt:Cat.No.cs9272， p-JNK:Cat. No.cs9251， p-Erk:Cat.No.cs9101， p-IB:Cat.No.cs2859， 。