一种有抗菌及增效抗菌活性的药物及其制备方法与应用.pdf

本发明提供一种药物物质，及其制备方法。本发明药物物质由连翘饮经过乙醇提取、大孔吸附树脂纯化得到，富集了连翘饮中的环烯醚萜类和酚类类成分，同时经过体内外抗菌试验证明，本发明药物物质体外联合口服抗生素头孢克洛胶囊有抗菌增效作用，体内试验对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠具有保护性作用，使细菌感染模型小鼠死亡率降低，延长存活时间，显示出良好的抗菌及抗菌增效活性。

权利要求书
1.  一种具有抗菌及增效抗菌作用的药物物质，其特征在于该药物物质的制备方法包括如下步骤： 
步骤1：选取如下原料： 
连翘  100-250重量份  防  风  100-250重量份 
栀子  100-250重量份  炙甘草  100-250重量份 
步骤2：乙醇提取； 
步骤3：弱极性或非极性大孔吸附树脂纯化； 
该药物物质的制备部位1中总环烯醚萜含量为10-40％，总酚含量为5％-40％，栀子苷含量5-30％，优选总环烯醚萜含量25-40％，总酚含量25-40％，栀子苷含量15-30％。制备部位2中总酚含量10-70％，连翘酯苷A含量0.12-2.0％，甘草酸含量0.4-5.0％，升麻素含量0.04-0.65％，连翘苷含量0.03-0.7％，优选总酚含量50-70％，连翘酯苷A含量1.0-2.0％，甘草酸含量3.5-5.0％，升麻素含量0.40-0.65％，连翘苷含量0.5-0.7％。 

2.  如权利要求1所述的药物物质，其特征在于步骤1中原料药的组成为： 
连翘  100-250重量份  防  风  100-250重量份 
栀子  100-250重量份  炙甘草  100-250重量份。

3.  如权利要求1或2所述的药物物质，其特征在于步骤2中，将原料药用8-12倍量，0-80％乙醇回流提取2-4次，每次提取0.5-2小时。 

4.  如权利要求1或2所述的药物物质，其特征在于步骤3中，将步骤2所得提取液合并减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，是上样液浓度为0.02-0.2g/ml。 

5.  如权利要求1或2所述的药物物质，其特征在于步骤3中，上样液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.2-0.7∶1，树脂柱径高比为1∶4-10，上样液浓度为0.02-0.2g/mL，吸附流速为1.0-4.0BV/h，水洗脱1-4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0-4.0BV/h，10-30％乙醇洗脱10-15倍树脂体积，洗脱流速为1.0-4.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得 环烯醚萜部位，优选15-20％乙醇洗脱；50-90％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为1.0-4.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。 

6.  如权利1-5所述中药药物物质组合其特征在于可由如下4组药用植物及其代用品种，包括其药用部位及非药用部位，药材及其饮片组合制成. 
组1：连翘、青翘、黄翘、秦连翘、金钟花、卵形连翘、丽江连翘、奇异连翘等木犀科植物及其炮制品. 
组2：防风、川防风、云防风、小防风等伞形科植物及其炮制品。 
组3：栀子、水栀子等茜草科及其同属植物及其炮制品。 
组4：甘草、胀果甘草、光果甘草、粗毛甘草、云南甘草、圆果甘草等甘草属及同科植物及其炮制品。 

7.  如权利1-5所述中药药物物质组合其特征在于可经上述原料药组合后以乙醇、或其他醇类、稀醇、或其他有机溶剂或水提取再通过大孔吸附树脂或其他色谱方法，如聚酰胺色谱法等，或溶剂萃取法等纯化得到。 

8.  如权利1-5所述中药药物物质组合其特征在于可由权利6中所述原料药的提取物经进一步富集纯化后或上述原料药的大孔树脂制备物混合而成。 

9.  如权利1-5所述中药药物物质组合其特征在于可经化学合成或结构修饰，生物合成或生物转等途径获得。 

10.  如权利要求1-9所述中药药物物质组合，其特征在于可加入本领域公知的各种药用辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，也可制成长效和缓释制剂、控释制剂、靶向制剂等其他传输系统给药制剂。所制得药剂可作为人药、兽药、植物用药使用或施用。 

11.  如权利要求1-9所述中药药物物质组合，其特征在于可加入公知的食品添加剂如防腐剂、抗氧化剂剂、着色剂、增稠剂和稳定剂、膨松剂、甜味剂、酸度剂、增白剂、香料等制成具有预防保健功能的保健食品或饮品。 

12.  如权利要求1-9任一所述的中药药物物质组合在制备具有抗菌及增效抗菌、抗炎、解热、镇痛、止咳、化痰药物中的应用。 

说明书一种有抗菌及增效抗菌活性的药物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物研究开发领域，涉及一种药物物质，特别涉及一种具有抗菌及增效抗菌活性的药物物质及其制备方法。 
背景技术
随着抗生素在临床上的广泛使用，耐药性问题也日益突出，寻找新的抗菌药物或逆转细菌耐药已成为国际上研究的热点，现有不少研究显示中药具有抗菌活性或逆转细菌耐药的作用，很多中药复方制剂作用又优于单味中药，因此研究合理的中西药联用既能提高疗效，又可缩短疗程，并能抑制临床上耐药菌株出现的频繁性，具有重大的意义。 
连翘饮，来源于《类证活人书》卷二十，异名连翘散(《斑论萃英》)、防风散(《普济方》卷三六九)、上清连翘散(《丹溪心法附余》卷十)。由连翘、防风、甘草(炙)、山栀子等分组成。功用，疏风清热。主治，小儿风热感冒、诸疮肿毒、咽喉疼痛。方中连翘、栀子对多种病原微生物都有抑制作用，如抗细菌、抗真菌、抗病毒、杀钩端螺旋体作用等。防风、甘草具有很好的清热解毒、抗炎作用，同时也具有抗菌作用。目前临床上，连翘饮及其加减方多用于治疗小儿发热等疾病。 
本发明人以连翘饮为研究载体，以自然药学观为基本指导思想，运用笔者所创立的药物成分药代-药效动力学与相互作用性关联研究方法学体系(PK-PD-DI)，以药物体系所体现的自然性、协同性、亲和性为线索寻找连翘饮抗菌药物体系，并以药物体系为主导进行药物制备工艺研究，目前，未见从连翘饮中制备抗菌药物物质的报道，本发明基于药物体系研究结果，将连翘饮中的有关萜类成分和酚类成分作为药物物质基本组成采用大孔吸附树脂进行分离富集，得到连翘饮具有抗菌及增效抗菌作用的药物物质，有利于进一步创新药物的研发。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌及增效抗菌作用的中药药物物质，其药物体系由环烯醚萜、酚类等组成。本发明的另一个目的在于提供其制备方法及工艺，本发明的第三个目的在于提供其质量检测及其控制方法。本发明的第四个目的在于提供其体外抗菌及增效抗菌活性，以及对金黄色葡菌感染小鼠的保护作用。本发明的第五个目的在于提供该中药药物物质组合物的制品及其在药品、食品领域的应用。 
本发明的目的是通过如下途径实现的： 
本发明中药药物物质组合可由如下4组药用植物及其代用品种，包括其药用部位及非药用部位，药材及其饮片组合制成。 
组1：连翘、青翘、黄翘、秦连翘、金钟花、卵形连翘、丽江连翘、奇异连翘等木犀科植物. 
组2：防风、川防风、云防风、小防风等伞形科植物。 
组3：栀子、水栀子等茜草科及其同属植物。 
组4：甘草、胀果甘草、光果甘草、粗毛甘草、云南甘草、圆果甘草等甘草属及同科植物及其炮制品。 
本发明中药药物物质，可经上述原料药组合后以乙醇、或其他醇类、稀醇、或其他有机溶剂或水提取再通过大孔吸附树脂或其他色谱方法，如聚酰胺色谱法等，或溶剂萃取法等纯化得到。 
本发明中药药物物质可由上述原料药的提取物经进一步富集纯化后或上述原料药的大孔树脂制备物混合而成。 
本发明中药药物物质可经化学合成或结构修饰，生物合成或生物转等途径获得。 
本发明中药药物组合优选由如下原料药制成： 
连翘  100-250重量份  防风  100-250重量份 
栀子  100-250重量份  甘草  100-250重量份。 
本发明药物物质的制备方法包括如下步骤： 
步骤1：选取上述原料药； 
步骤2：乙醇提取； 
步骤3：弱极性或非极性大孔吸附树脂纯化； 
该药物物质的制备部位1中总环烯醚萜含量为4-50％，总酚含量为5％-50％，栀子苷含量2-30％，优选总环烯醚萜含量25-40％，总酚含量25-40％，栀子苷含量15-30％。制备部位2中总酚含量10-70％，连翘酯苷A含量0.12-2.0％，甘草酸含量0.4-5.0％，升麻素含量0.04-0.65％，连翘苷含量0.03-0.7％，优选总酚含量50-70％，连翘酯苷A含量1.0-2.0％，甘草酸含量3.5-5.0％，升麻素含量0.40-0.65％，连翘苷含量0.5-0.7％。 
上述步骤2中，将原料药用8-12倍量，0-80％乙醇回流提取1-4次，每次提取0.5-2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使上样液浓度为0.02-0.2g/ml。 
上述步骤3中，将步骤2所得提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为0.02-0.2g/mL，通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.2-0.7∶1，树脂柱径高比为 1∶4-10，上样液浓度为0.02-0.2g/mL，吸附流速为1.0-4.0BV/h，水洗脱1-4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0-4.0BV/h，10-30％乙醇洗脱10-15倍树脂体积，洗脱流速为1.0-4.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位，优选15-20％乙醇洗脱；50-90％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为1.0-4.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位，优选75-85％乙醇洗脱； 
将以上所得药物物质，加入常规辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液等。 
本发明药物物质由连翘饮经过乙醇提取、大孔吸附树脂纯化得到，富集了连翘饮中的环烯醚萜类成分和酚类成分，同时经过体内外抗菌试验证明，本发明药物物质体外联合口服抗生素头孢克洛胶囊有抗菌增效作用，体内试验对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠具有保护性作用，使细菌感染模型小鼠死亡率降低，延长存活时间。 
实验例1 本发明抗菌活性部位体外联用抗生素具有抗菌增效的作用 
(一)实验材料 
1.菌种 
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC26112)购自北京北纳创联生物技术研究院。 
2.药品及试剂 
头孢克洛胶囊(昆明贝克诺顿制药有限公司批号：国药准字H53021942) 
3.仪器设备 
HD-1360洁净工作台(北京东联哈尔仪器制药有限公司)、HZQ-X100震荡培养箱(中国.哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司)、MLS-3780日本三洋高压蒸汽灭菌器(北京得尔贝经贸有限公司)、MP6001电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、Sartorius BT25S型1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)、KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。 
(二)实验方法及结果 
1.液体培养基及LB平板制备 
LB液体培养基：精密称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加1L去离子水超声溶解，用1.0mol/L NaOH溶液调pH约7.2，置高压蒸汽灭菌锅灭菌30min，冷却待用。 
LB平板制备：精密称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂10g，加1L去离子水溶解，用1.0mol/L NaOH溶液调pH约7.2，置高压蒸汽灭菌锅灭菌30min，趁热倒入已灭菌的玻璃培养皿中，冷却凝固后形成厚度为4mm的平板，取出一个LB平板置于 37℃恒温箱内培养18h做无菌试验，其余用封口膜密封置4℃冰箱保存，7d内用完。 
2.菌液制备 
金黄色葡萄球菌一代菌液以菌液体积∶培养液体积＝1∶10，接种于液体培养基内，置37℃培养箱内振荡培养(200r/min)18h，作为原菌液。以生理盐水稀释菌液至1/2麦氏比浊度，按1∶1000稀释菌液至含菌量约10^6个/ml，作为待用菌液。 
3.供试品及载药纸片制备 
3.1供试品溶液制备：去本发明药物物质适量，以去离子水溶解并定容，制成每个供试品浓度相当于1.25g全方生药量/ml，记作A1。将A1样品进行2倍稀释，定容，得A2溶液。 
3.2抗生素溶液制备：精密称取头孢克洛胶囊内容物1.93mg，置10ml容量瓶中，去离子水溶解定容，得B1溶液；精密移取B1溶液5ml，置10ml容量瓶中，去离子水溶解定容，得B2溶液；再精密移取B2溶液5ml，置10ml容量瓶中，去离子水溶解定容，得B3溶液；再精密移取B3溶液5ml，置10ml容量瓶中，去离子水溶解定容，得B4溶液，过0.22μm无菌滤膜除菌待用。 
3.3载药纸片的制备：用打孔器将滤纸达成直径6mm的滤纸片，高压蒸汽灭菌后至烘箱内烘干，得空白纸片。分别按照表1分组进行载药纸片的制备，每片纸片载药5μl，吹干待用。 
表1载药纸片制备方法表 

4.体外抗菌实验： 
分别吸取金黄色葡萄球菌待用菌液50μl，至固体培养基，玻璃涂布棒涂布均匀，将上述载药纸片按图1位置贴在相应的位置，至37℃培养箱内倒置培养18h，游标卡尺测定各载药纸片的抑菌环直径，以抑菌环大小为评判指标。 
5.实验结果 
表2对金黄色葡萄球菌体外抗菌增效实验结果 

受试药组F出现了抑菌圈，说明受试药本身有抗菌作用，比较FK与K组抑菌圈直径，可发现在使用抗生素的同时，加入受试药有增强抗生素抗菌的活性；同时比较F1/2K与1/2K、K组抑菌圈直径，抗生素的用量减半，加入受试药，抑菌圈直径比1/2K产生的较大，且接近于K组大小，说明抗生素减半的情况下，受试药的增效抗菌作用进一步表现出来；将抗生素进一步减半，即增加1/4K和F1/4K组，可发现1/4K浓度下的抗生素已不能产生抑菌圈，而F1/4K与F比，可发现在抗生素不显示抗菌作用的剂量下仍对受试药抗菌活性有增强作用。 
实验例2 本发明抗菌活性部位对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的保护性作用 
(一)实验材料 
1药物 
双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司生产，批号：13051516国药准字Z10920053) 
头孢克洛胶囊(昆明贝克诺顿制药有限公司批号：130117国药准字H53021942) 
2动物 
KM小鼠，体重20～25g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司生产，生产许可证号(京)2012-0001。 
3菌株 
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC26112)购自北京北纳创联生物技术研究院。 
4试剂与设备 
高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，GB/T20886-2007)HD-1360洁净工作台(北 京东联哈尔仪器制药有限公司)、HZQ-X100震荡培养箱(中国.哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司)、MLS-3780日本三洋高压蒸汽灭菌器(北京得尔贝经贸有限公司)、MP6001电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、Sartorius BT25S型1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)、KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。 
5统计方法死亡数据为分类资料，用SPSS16.0统计软件的fisher’exact test检验进行统计分析。 
(二)实验方法及结果 
1.80％MLD确定 
选取小鼠42只，体重20～25g，雌雄各半，随机分为7组，分别为6个菌液稀释组和1个空白对照组，每组6只。6个菌液稀释组，每组分别腹腔注射以5％干酵母生理盐水溶液稀释的菌溶液(稀释度分别为1×100，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5)，注射量0.4mL/只；空白对照组腹腔注射5％酵母浸出粉-生理盐水溶液0.4mL/只。观察染菌后2d内动物的死亡率，并选取感染死亡率为80％～100％的稀释浓度作为正式实验的感染菌液浓度。 
结果：5％干酵母对照组无动物死亡，5％干酵母生理盐水溶液稀释的菌溶液稀释度为1×10-3，1×10-4的致死率均为83.33％，同时进行进一步实验证明，1×10-3稀释度的菌液浓度过高，造成小鼠急性死亡，导致中药阳性对照组(双黄连口服液)全部死亡，故选择正式实验感染菌液的浓度为1×10-4稀释度，即6.4×105个/ml。2.体内抗菌保护性实验正式实验 
正式实验选取健康小鼠98只，体重为20～25g，雌雄各半，随机分为7组，即空白对照组、模型对照组、头孢克洛对照组、双黄连对照组、受试药组。各组动物按剂量连续灌胃给药5d，1次/d。(空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水，头孢克洛对照组在感染菌前1d开始给药1次)，1次/d。感染前小鼠禁食12h，第5天，选80％～100％小鼠死亡的金黄色葡萄球菌酵母浸出粉稀释液0.4mL/只，给小鼠造成感染，空白对照组注射等量干酵母浸出粉-生理盐水溶液，0.4mL/只，感染后6h后再给药1次。观察和记录各组动物感染后7d内的反应情况以及死亡数。死亡动物及未死亡动物取心脏血涂板培养，应得到死亡动物心脏血有菌生长，未死亡动物心脏血无菌生长。 
表1对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用 


○受试药组为2个部位，本实验中是按照处方比例进行配比，△与空白对照组比，P＜0.01，**与模型对照组比，P＜0.01，*与模型对照组比，P＜0.05；n＝14。 
3.实验结果 
结果表明，与空白对照组比较，模型对照组的动物死亡率为85.71％(P＜0.01)，表明浓度为6.4×10^5个/ml金黄色葡萄球菌的干酵母悬液能明显引起小鼠死亡，造模成功。与模型对照组比较，两个阳性药组，即双黄连口服液组与头孢克洛组死亡率明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，且平均存活天数要明显增加；与模型对照组相比，受试药组小鼠死亡率明显降低(P＜0.05)，死亡率与双黄连组相同，但平均存活时间比双黄连组要长，说明受试药药效优于双黄连，对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠具有保护性作用，使细菌感染模型小鼠死亡率降低，延长存活时间。 
下述实施例均能实现上述实验例的效果。 
附图说明：
图1是载药纸片位置图。 
具体实施方式
实施例1： 
连翘  250g  防风  250g 
栀子  250g  甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：239nm。 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制)比例1∶0.9的混合溶液1.8ml，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例2：胶囊剂 
连翘  250g  防风  250g 
栀子  250g  炙甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。两部分按一定比例组合加入常规辅料，按照常规工艺制成胶囊剂。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：239nm。 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制)比例1∶0.9的混合溶液1.8ml，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例3：片剂 
连翘  250g  防  风  250g 
栀子  250g  炙甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。两部分按一定比例组合加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min 检测波长：239nm。 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制)比例1∶0.9的混合溶液1.8ml，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下 柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例4：丸剂 
连翘  250g  防  风  250g 
栀子  250g  炙甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。两部分按一定比例组合加入常规辅料，按照常规工艺制成丸剂。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：239nm。 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制)比例1∶0.9的混合溶液1.8ml，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例5：口服液体制剂 
连翘  250g  防  风  250g 
栀子  250g  炙甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。两部分按一定比例组合加入常规辅料，按照常规工艺制成口服液制剂。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：239nm 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制)比例1∶0.9的混合溶液1.8m1，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下 柱温：30℃ 流速：1ml/min 检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例6：注射剂 
连翘  250g  防  风  250g 
栀子  250g  炙甘草  250g 
按上述比例取原料药饮片1kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液减压浓缩，至相对密度1.15-1.25g/ml的清膏，加水分散，使水溶液浓度为0.05g/mL(以折生药材量计，其中环烯醚萜浓度为0.8mg/ml，酚类浓度为3.556mg/ml，栀子苷浓度0.57mg/ml，连翘酯苷A浓度0.068mg/ml，甘草酸浓度0.201mg/ml，升麻素浓度0.0202mg/ml，连翘苷浓度0.017mg/ml)，优选AB-8大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为0.35∶1，树脂柱径高比为1∶6，上样液浓度为0.05g/mL，吸附流速为2.0BV/h，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3.0BV/h，20％乙醇洗脱12倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得环烯醚萜部位；80％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得总酚部位。两部分按一定比例组合加入常规辅料，按照常规工艺制成注射剂。 
总环烯醚萜的含量测定方法： 
对照品：栀子苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)(0-30mim：15％A：85％B-34％A：66％B)，柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：239nm。 
测定方法： 
以对照品确定栀子苷的色谱峰，并根据栀子苷的色谱峰紫外吸收，确定具有相同或相似紫外吸收的色谱峰，并以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量，即栀子苷类成分的含量，即总环烯醚萜类含量，经测定栀子苷含量25.5521％，总环烯醚萜类含量34.37％。 
总酚含量测定方法： 
对照品：连翘酯苷A； 
试剂：0.6％三氯化铁溶液，0.9％铁氰化钾溶液，0.3％十二烷基硫酸钠溶液，70％甲醇溶液，0.1mol/L盐酸溶液； 
显色方法：精密移取样品溶液适量，置于25ml棕色容量瓶中，加70％甲醇至5ml，再加入0.3％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，摇匀，加入0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(新配制) 比例1∶0.9的混合溶液1.8ml，暗处放置7min，用0.1mol/L盐酸加至25ml刻度线，在暗处放置40min，以备测定。 
测定方法：将上述显色后样品于762±2nm波长范围内测定，记录其最大吸光度值，经测定20％乙醇部位总酚含量为34.20％，80％乙醇部位总酚含量为65.43％。 
指标性成分连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷含量测定方法 
对照品：连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷 
色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，见表格如下 柱温：30℃ 流速：1ml/min检测波长：全波长扫描 
流动相梯度表 

经测定酚类部位中含连翘酯苷含量1.5526％，甘草酸含量4.8472％，升麻素含量0.5593％，连翘苷含量0.546％。 
实施例7：胶囊剂的制备 
取本发明中药药物物质组合200g，粉碎，过80目筛，与微晶纤维素100g混合均匀，以95％乙醇制粒，干燥，以20目筛整粒，灌装胶囊。 
实施例8：片剂的制备 
取本发明中药药物物质组合50g，粉碎，过80目筛，与微晶纤维素70g、羧甲基淀粉钠5g混合均匀，以5％PVP制粒，干燥，以20目筛整粒，加入硬脂酸镁2g，压片。 
实施例9：滴丸剂的制备 
取本发明中药药物物质组合60g，粉碎，过80目筛，混合均匀，投入180g加热熔融的聚乙二醇6000中，搅拌至溶解，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80～90℃，调节滴丸机液滴定量阀门，由上往下滴入10～15℃的液体石蜡中，将形成的滴丸沥干并擦除液体石蜡，干燥。 
实施例10：口服液的制备 
取本发明中药药物物质组合70g，粉碎，过80目筛，混合均匀，与蜂蜜1000g、蔗糖200g、 苯甲酸钠10g及蒸馏水2000ml混合，加热至85～90℃，搅拌使溶解，保温30min，滤过，滤液加水稀释至4000ml，搅拌均匀，灌封，灭菌。 
实施例11：注射液的制备 
取本发明中药药物物质组合100g，加注射用水适量使溶解，加配置量的0.02％的活性炭搅拌5～10min，滤过，滤液稀释至10L左右，加氯化钠调节渗透压至等渗，调节pH7.5～8.0，超滤，灌封，100℃灭菌30min。 
实施例12：粉针剂的制备 
取本发明中药药物物质组合100g，加注射用水及稀氢氧化钠适量使溶解，加配置量的0.02％的活性炭搅拌5～10min，滤过，滤液稀释至1L，调节pH6.5～7.8，超滤，喷雾干燥，干粉无菌分装。每支100mg，临用前加注射用水适量使溶解，用氯化钠输液250～500ml稀释后缓慢静脉滴注。