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1、(10)申请公布号 CN 104248645 A (43)申请公布日 2014.12.31 CN 104248645 A (21)申请号 201410300615.6 (22)申请日 2014.06.27 201310265297.X 2013.06.28 CN A61K 35/64(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 17/02(2006.01) A61K 31/79(2006.01) (71)申请人 成都百草和济科技有限公司 地址 610041 四川省成都市高新区高朋大道 5 号 1 栋 206 室 (72)发明人 张廷模 苏柘僮 邹俊波 (74)专利代理机。
2、构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 全学荣 杜朗宇 (54) 发明名称 一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种复方聚维酮碘消毒液， 每 1000ml 消毒液中含有如下用量的原料 ： 聚维酮碘 10100g， 美洲大蠊提取物以总氨基酸计在0.8g 以上， 碘酸钾适量， 余量为水。本发明还提供了消 毒液的制备方法。本发明将美洲大蠊醇提物与聚 维酮碘联合使用， 不仅具有良好的杀菌作用， 并且 还能够促进肉芽组织生长、 抗炎及消除炎性水肿， 二者组成复方聚维酮碘消毒液制剂， 可用于各种 创伤的消毒及治疗 ； 另外， 本发明研究发现， 聚。
3、维 酮碘中加入美洲大蠊提取物后， 明显增加了聚维 酮碘的稳定性， 为产品质量提供了保障。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 18 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书18页 (10)申请公布号 CN 104248645 A CN 104248645 A 1/1 页 2 1. 一种复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 每 1000ml 消毒液中含有如下用量的原料 ： 聚维酮碘 10 100g， 美洲大蠊提取物以总氨基酸计在 0.8g 以上， 碘酸钾适量， 余量为 水。 2. 根据权利要求 1 所述的复方聚。
4、维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 聚维酮碘的含量为 25 100g。 3. 根据权利要求 2 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 聚维酮碘的含量为 50 100g。 4.根据权利要求1所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 碘酸钾的含量为15g。 5. 根据权利要求 1 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 消毒液中还含有如下辅 料 ： 防腐剂或 / 和助溶剂。 6. 根据权利要求 5 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 所述防腐剂为苯甲酸钠 或 / 和山梨酸钾 ； 所述助溶剂为甘油或 / 和吐温。 7. 根据权利要求 1 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 所。
5、述美洲大蠊提取物为 去油脂的美洲大蠊提取物。 8. 根据权利要求 1 或 7 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 所述美洲大蠊提取 物的制备方法为 ： 去美洲大蠊， 乙醇提取后， 去除油脂， 即得。 9. 根据权利要求 8 所述的复方聚维酮碘消毒液， 其特征在于 ： 制备方法的具体操作如 下 ： 取美洲大蠊， 粉碎， 用 80 90 v/v 乙醇提取， 醇提液回收乙醇并浓缩后， 加水， 加 热搅拌， 静置， 冷却， 待油脂充分上浮， 取下清液， 过滤， 滤液浓缩或干燥后， 得美洲大蠊提取 物。 10. 权利要求 1-9 任意一项所述复方聚维酮碘消毒液的制备方法， 其特征在于 ： 它包括。
6、 如下操作步骤 ： (1) 按配比称取原料 ； (2) 取去油脂的美洲大蠊提取物、 聚维酮碘和碘酸钾， 加水溶解后， 加入常规辅料， 混 匀， 滤过， 灭菌， 即得消毒液。 权 利 要 求 书 CN 104248645 A 2 1/18 页 3 一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法。 背景技术 0002 美洲大蠊 (PeriplanetaAmericana) 属昆虫纲， 蜚蠊目， 蜚蠊科，“蟑螂” 为其俗名， 首见于 本草纲目拾遗 ， 也称其为石姜、 滑虫， 在地球上已经生存了 3.5 亿年， 是世界上生 命力最强、 最古老、 至。
7、今繁衍最成功的昆虫类群之一。 美洲大蠊药用主癥瘕、 破积聚， 通利血 脉， 外用可敛疮、 拔毒、 化腐、 生肌， 现代研究表明其还具有良好的抗菌作用。 0003 康复新液主要成分为美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物， 功能通利血脉， 养阴生肌， 现代医学认为康复新液具有促进肉芽组织生长、 抗炎及消除炎性水肿、 提高机体免疫功能、 抑制胃酸分泌等药理作用， 临床用于十二指肠溃疡， 胃溃疡， 烧烫伤等的治疗。 0004 聚维酮碘(PVP-I)是碘与表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及增溶剂形成的新型 消毒剂， 广泛应用于临床， 杀菌谱广， 对革兰阳性菌、 革兰阴性菌、 病毒、 芽孢、 真菌、 原虫等 都。
8、有强而迅速的杀灭作用。近年来有文献报道碘伏可能引起女性医护人员甲状腺疾病发 病率上升， 可能与碘的易挥发性有关， 有研究表明碘伏的稳定性易受温度影响， 也有文献表 明， 但有效碘浓度较高时 (1000g/L) 时， 对细胞增殖有抑制作用， 因此开展新型聚维酮 碘复方消毒产品的研究工作， 研发出质量好、 性能稳定的产品， 具有重要的意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种复方聚维酮碘消毒液。 0006 本发明提供了一种复方聚维酮碘消毒液， 每 1000ml 消毒液中含有如下用量的原 料 ： 0007 聚维酮碘 10 100g， 美洲大蠊提取物以总氨基酸计在 0.8g 以上 ( 例如 。
9、0.8 0.9g)， 碘酸钾适量， 余量为水。 0008 进一步地， 聚维酮碘的含量为 25 100g。 0009 更进一步地， 聚维酮碘的含量为 50 100g。 0010 目前在聚维酮碘溶液制剂中， 碘酸钾一直作为稳定剂存在于溶液中， 它有助于增 加聚维酮碘溶液的稳定性。 因此， 碘酸钾的用量可以参考已知聚维酮碘溶液制剂中的用量。 例如， 本发明中每 1000ml 消毒液中碘酸钾的含量为 1 5g。 0011 其中， 消毒液中还含有如下辅料 ： 防腐剂或 / 和助溶剂。 0012 进一步地， 所述防腐剂为苯甲酸钠或 / 和山梨酸钾 ； 所述助溶剂为甘油或 / 和吐 温。 0013 其中， 。
10、所述美洲大蠊提取物为去油脂的美洲大蠊提取物。 0014 进一步地， 所述去油脂的美洲大蠊提取物的制备方法为 ： 去美洲大蠊， 乙醇提取 后， 去除油脂， 即得。 0015 更进一步地， 制备方法的具体操作如下 ： 说 明 书 CN 104248645 A 3 2/18 页 4 0016 取美洲大蠊， 粉碎， 用8090v/v乙醇提取， 醇提液回收乙醇并浓缩后， 加水， 加热搅拌， 静置， 冷却， 待油脂充分上浮， 取下清液， 过滤， 滤液浓缩或干燥后， 得美洲大蠊提 取物。 0017 具体地， 美洲大蠊提取物的制备方法如下 ： 0018 取美洲大蠊， 粉碎， 用 80 90的乙醇提取， 第一次。
11、加 7 倍量乙醇回流提取 2 小 时， 第二次加 5 倍量乙醇回流提取 1.5 小时， 第三次加 3 倍量乙醇回流提取 1 小时， 合并提 取液， 静置 8h 以上， 滤过， 滤液回收乙醇并浓缩成稠膏 ( 相对密度约 1.30(85 )， 加入 20 倍浸膏量的纯水， 加热搅拌， 静置， 冷却， 使油脂充分上浮， 取下清液， 过滤， 滤液浓缩成稠膏 ( 相对密度约 1.30(85 )， 得美洲大蠊提取物。 0019 本发明还提供了上述复方聚维酮碘消毒液的制备方法， 它包括如下操作步骤 ： 0020 (1) 按配比称取原料 ； 0021 (2) 取去油脂的美洲大蠊提取物、 聚维酮碘和碘酸钾， 加。
12、水溶解后， 加入常规辅料， 混匀， 滤过， 灭菌， 即得消毒液。 0022 本发明将美洲大蠊醇提物与聚维酮碘联合使用， 不仅具有良好的杀菌作用， 并且 还能够促进肉芽组织生长、 抗炎及消除炎性水肿， 二者组成复方聚维酮碘消毒液制剂， 可用 于各种创伤的消毒及治疗 ； 另外， 本发明研究发现， 聚维酮碘中加入美洲大蠊提取物后， 明 显增加了聚维酮碘的稳定性， 为产品质量提供了保障。 具体实施方式 0023 实施例 1 0024 处方 0025 聚维酮碘 (PVP-I)50g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g 甘油 150ml 山梨酸 2g 苯甲酸钠 3.5g 碘酸钾 2g 。
13、0026 制备成 1000ml 0027 制法 0028 取 PVP-I 50g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量 的纯水、 甘油 150ml、 碘酸钾 2g、 苯甲酸钠 3.5g 及山梨酸 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0029 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 5， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。 0030 实施例 2 0031 处方 0032 聚维酮碘 (PVP-I)25g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g 甘油 150m。
14、l 吐温 -801ml 碘酸钾 2g 山梨酸 3g 0033 制备成 1000ml 0034 制法 0035 取 PVP-I25g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量 的纯水、 甘油 150ml、 碘酸钾 2g、 山梨酸 3g 及吐温 -801ml， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 说 明 书 CN 104248645 A 4 3/18 页 5 0036 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 2.5， 含美洲大蠊提取物 每 1000ml 不少于 0.8g。 0037 实施例 3 0038。
15、 处方 0039 聚维酮碘 (PVP-I)10g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 )0.8 0.9g 吐温 -805ml 碘酸钾 2g 0040 制备成 1000ml 0041 制法 0042 取PVP-I10g， 美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)0.85g， 加入80所需量的纯水、 吐 温 805ml 及碘酸钾 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0043 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 1， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 为 0.8 0.9g。 0044 实施例 4 0045 处方 0046 聚维酮碘 (PVP。
16、-I)75g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g 甘油 150ml 吐温 803ml 山梨酸 2g 碘酸钾 2g 0047 制备成 1000ml 0048 制法 0049 取 PVP-I75g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量的 纯水、 甘油 150ml、 吐温 803ml、 碘酸钾 2g 及山梨酸 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0050 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 7.5， 含美洲大蠊提取物 每 1000ml 不少于 0.8g。 0051 实施。
17、例 5 0052 处方 0053 聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g吐温803ml 碘酸钾 2g 0054 制备成 1000ml 0055 制法 0056 取PVP-I100g， 美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g， 加入80所需量的 纯水、 吐温803ml及碘酸钾2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0057 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 10， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。 0058 实施例 6 0059 处方 0060 聚维酮碘 (PVP-I。
18、)10g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g 乙醇 750ml 山梨酸 2g 碘酸钾 2g 0061 制备成 1000ml 说 明 书 CN 104248645 A 5 4/18 页 6 0062 制法 0063 取 PVP-I10g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量的 纯水、 乙醇 750ml、 碘酸钾 2g 及山梨酸 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0064 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 1， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。。
19、 0065 实施例 7 0066 处方 0067 聚维酮碘 (PVP-I)50g 美洲大蠊醇提物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g 甘油 50ml 碘酸钾 2g 山梨酸 5g 0068 制备成 1000ml 0069 制法 0070 取 PVP-I50g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量的 纯水、 甘油50ml、 碘酸钾2g及山梨酸5g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤 过， 灌装， 即得。 0071 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 5， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。 0。
20、072 实施例 8 0073 处方 0074 聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油200ml 碘酸钾 2g 山梨酸 1g 0075 制备成 1000ml 0076 制法 0077 取PVP-I100g， 美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g， 加入80所需量的 纯水、 甘油 200ml、 碘酸钾 2g 及山梨酸 1g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0078 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 10， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。 0079 实施例 9。
21、 0080 处方 0081 聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 山梨酸 2g 苯甲酸钠 3.5g 碘酸钾 1g 0082 制备成 1000ml 0083 制法 0084 取 PVP-I100g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量 的纯水、 甘油 150ml、 碘酸钾 1g、 苯甲酸钠 3.5g 及山梨酸 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。 0085 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 10， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不。
22、少于 0.8g。 说 明 书 CN 104248645 A 6 5/18 页 7 0086 实施例 10 0087 处方 0088 聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 山梨酸 2g 苯甲酸钠 3.5g 碘酸钾 5g 0089 制备成 1000ml 0090 制法 0091 取 PVP-I100g， 美洲大蠊提取物 ( 以总氨基酸计 ) 不少于 0.8g， 加入 80所需量 的纯水、 甘油 150ml、 碘酸钾 5g、 苯甲酸钠 3.5g 及山梨酸 2g， 加热溶解， 滤过， 滤液加水至 1000ml， 搅匀， 灭菌， 滤过， 灌装， 即得。。
23、 0092 该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为 10， 含美洲大蠊提取物每 1000ml 不少于 0.8g。 0093 本发明实施例中美洲大蠊提取物的均为去油脂品， 其制备方法可以参见现有技术 中的公开方法， 如 201210446614.3。也可参照如下方法 ： 0094 取美洲大蠊， 粉碎， 用 80 90的乙醇提取， 第一次加 7 倍量乙醇回流提取 2 小 时， 第二次加 5 倍量乙醇回流提取 1.5 小时， 第三次加 3 倍量乙醇回流提取 1 小时， 合并提 取液， 静置 8h 以上， 滤过， 滤液回收乙醇并浓缩成稠膏 ( 相对密度约 1.30(85 )， 加入 20 倍浸。
24、膏量的纯水， 加热搅拌， 静置， 冷却， 使油脂充分上浮， 取下清液， 过滤， 滤液浓缩成稠膏 ( 相对密度约 1.30(85 )， 得美洲大蠊提取物。 0095 以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。 0096 下述试验例中， 复方聚维酮碘消毒液中的有效碘浓度参照各具体试验步骤要求， 消毒液中所含美洲大蠊提取物以总氨基酸计， 每 1000ml 含 0.8 0.9g。 0097 试验例 1 复方聚维酮碘消毒液的药理作用考察 ： 0098 1. 复方聚维酮碘消毒液对体外培养血管内皮细胞增殖的影响 0099 1.1 材料 0100 1.1.1 细胞株 0101 内皮细胞细胞株 ECV-304 购。
25、于山东省医学科学院。 0102 1.1.2 主要试剂 0103 复方聚维酮碘消毒液 ( 实验中所用的复方聚维酮碘消毒液， 其中除了聚维酮碘、 美洲大蠊提取物、 碘酸钾外， 不含防腐剂和其他辅料 ) 0104 美洲大蠊饮片、 美洲大蠊醇提物 ( 四川科伦药业集团有限公司 ) 0105 聚维酮碘溶液(PVP-I， 批号 ： 101004， 有效碘浓度10.0)， (成都永安制药有限公 司 ) 0106 聚维酮碘粉末 ( 纯度 99， 郑州赛诺康化工产品有限公司 ) 0107 RPMI1640 培养基， ( 美国 GIBCO 公司 ) 0108 胎牛血清， ( 上海玉博生物科技有限公司 ) 0109。
26、 PBS 缓冲液 (pH 7.4)， ( 福州迈新生物技术开发有限公司 ) 0110 0.25胰蛋白酶， ( 北京格源天润生物科技有限公司 ) 0111 青霉素 (80 万 U/ml)， ( 山东鲁抗制药股份有限公司 ) 0112 链霉素 (100 万 U/ml)， ( 山东鲁抗制药股份有限公司 ) 说 明 书 CN 104248645 A 7 6/18 页 8 0113 溴化丙啶 (PI)， (SIGMA) 0114 鼠抗人 PCNA 单克隆抗体， ( 上海亿欣生物科技有限公司 ) 0115 兔抗人 Ki-67 单克隆抗体， ( 上海亿欣生物科技有限公司 ) 0116 PV-9000 通用型。
27、二抗， ( 上海亿欣生物科技有限公司 ) 0117 DAB， ( 上海亿欣生物科技有限公司 ) 0118 1.1.3 仪器 0119 酶标仪， Bio-RAD550， ( 美国 Bio-RAD 公司 ) 0120 倒置显微镜， olympus， ( 日本 ) 0121 医用净化工作台， APR-GM-ZYT-6， ( 成都艾普瑞实验设备有限公司 ) 0122 微型迷你振荡器， MS-1， ( 日本 IKA 公司 ) 0123 医用低速离心机， TDL-5， ( 四川蜀科仪器有限公司 ) 0124 CO2细胞培养箱， MCO175， ( 日本三洋电器有限公司 ) 0125 液氮生物容器， YDS。
28、-30， ( 成都信杰诚贸易有限公司 ) 0126 -20冰箱， 康佳， ( 安徽康佳电器有限公司 ) 0127 -80超低温冰箱， ThermoForma725 型， ( 日本三洋电器有限公司 ) 0128 电热恒温干燥箱， ( 成都特思特仪器有限公司 ) 0129 流式细胞仪， FACSCalibur， ( 美国 BD 公司 ) 0130 培养板， 6、 24、 96 孔， (COSTER) 0131 1.1.4 各溶液配方 0132 (1)RPMI1640 培养液 ： 取一包 RPMI1640 培养基粉末溶解于 300ml 三蒸水再用三蒸 水洗包装袋内两次。 加入磁性搅棒， 放在振荡器上。
29、搅匀， 加入2gNaHCO3， 定容接近1000ml， 并 用1mol HCL溶液调pH值至7.07.2， 并加入青霉素使终浓度至l00U/ml和链霉素终浓度 100U/ml。0.22m 滤膜两张过滤除菌， 无菌条件下分装， 4冷藏备用。每批使用不超过两 周。 0133 (2)PI 复合染液 ： 生理盐水 ： 129.6ml、 PI ： l0ml、 RNase ： 2mg、 1.0 Triton-100 ： 0.5ml、 枸椽酸钠 ： 200mg， 加蒸馏水至 200ml， 调整 pH 值至 7.2 7.6， 4避光保存。 0134 (3)l ： 50PCNA 或 Ki-67 抗体 ： 取 P。
30、CNA 或 Ki-67 抗体原液 10l， 以 490l PBS 稀 释至 500l， 现用现配。 0135 1.2 实验方法 0136 1.2.1 细胞培养 0137 内皮细胞株ECV-304培养于含10胎牛血清的RPMI1640培养液中， 内含终浓度为 100U/ml 的青霉素和链霉素， 置于 37、 5 CO2饱和湿度细胞培养箱内单层培养， 待细胞长 满 80 90后， PBS 缓冲液冲洗两遍， 0.25胰蛋白酶消化约 5 8min 待出现筛孔效应 后， 用 lml 吸管轻轻吹打完全后传代。 0138 1.2.2 复方聚维酮碘消毒液对体外培养 ECV-304 细胞增殖的影响 0139 分。
31、别取复方聚维酮碘消毒液适量， 用 RPMI1640 培养基分别稀释至一定浓度的溶 液， 具体方法步骤如下 ： 0140 1.2.2.1 消化制备单细胞悬液 ： 待培养瓶内细胞长满约 80 90后， 加 lml0.25胰蛋白酶消化， 镜下观察见细胞回缩， 出现筛孔效应， 倒掉消化液， 加入含 10胎 说 明 书 CN 104248645 A 8 7/18 页 9 牛血清的 RPMI16402 3ml 吹打， 使细胞脱壁， 加培养液至 10ml 继续吹打使细胞之间分散 成单个细胞， 并于镜下观察， 制备成单细胞悬液。 0141 1.2.2.2 计算细胞密度 ： 用 lml 刻度吸管吸取少许细胞悬液。
32、， 滴在计数板上并置于 倒置显微镜下观察， 计数并计算细胞密度。 0142 细胞数 /ml 4 大格细胞总数 /4104 0143 1.2.2.3 调整细胞密度 ： 使细胞密度调至 0.8 1.0105/ml， 一般每瓶细胞需加 培养基至 24 25ml 即可得到所需细胞密度。 0144 1.2.2.4 接种 ： 24 孔板每板分为 1 个对照组和 3 个实验组， 每组设 6 个实验复孔。 每孔加入 1ml 细胞悬液， 置于培养箱内约 2h 后细胞贴壁。 0145 1.2.2.5 加入复方聚维酮碘消毒液 ： 待镜下观察细胞贴壁后， 取出培养板向实验 孔加不同配比组成的复方聚维酮碘消毒液。具体方。
33、法为 ： 从实验孔中取出 20l 培养液弃 去， 然后加入等体积的复方聚维酮碘消毒液。 0146 1.2.2.6 细胞培养、 形态学观察及细胞计数 ： 加入不同复方聚维酮碘消毒液后放 入培养箱继续培养， 于第 4、 8、 12 和 24h 观察细胞生长状况， 并进行细胞计数。 0147 1.2.3 对细胞周期的影响 0148 将ECV-304细胞接种于6孔培养板上， 用含有效碘浓度为0.10、 5.00、 10.00 的复方聚维酮碘消毒液的培养液分别培养 24h 后用胰酶适度消化制备单个细胞悬液， 收集 至离心管 1000rpm 离心 15min， 弃上清。PBS 冲洗 2 次， 加 0.5m。
34、l PBS 吹匀， 用 5ml 注射器将 细胞吸起打入 5ml70冷乙醇中， 封口膜封口。4固定过夜。1000rpm 离心 15min， 弃上清 液， PBS 冲洗 2 次。用 0.4ml PBS 重新悬细胞并转至 Tube 中轻轻吹打 ( 防止细胞破碎 )， 将 细胞悬液和等体积的 PI 复合染液混合， 染色 (4， 20 30min)， 400 目尼龙网过滤后上机 检测。ModFit 分析软件分析， 用 S 期细胞比率 (SPR) 表示相对增殖力。 0149 SPR S/(Go/G1+S+G2/M) 0150 1.2.4 对 PCNA、 Ki67 表达的影响 0151 采用第二代聚合酶两步。
35、法 (PV 法 ) 分析， 其步骤为 ： 0152 1.2.4.1 在无菌条件下将消毒好的盖玻片放入 6 孔培养板 ； 0153 1.2.4.2 将 ECV-304 培养于盖玻片上 (6 片 / 实验组 )， 待细胞贴壁后加入等量的 复方聚维酮碘消毒液， 有效碘浓度分别为 10.00、 7.50、 5.00、 2.50和 0.10， 培养 24h ； 0154 1.2.4.3 由培养板中取出盖玻片， 冷丙酮固定细胞 ( 室温， 10min)， PBS 冲洗 (2min3 次 ) ； 0155 1.2.4.445烤片 3h， PBS 冲洗 5min， 三次 ； 0156 1.2.4.5 滴加 0。
36、.5 Triton-X100(37， 10min)， PBS 冲洗 5min， 三次 ； 0157 1.2.4.6 每张切片滴加蒸馏水新鲜配置的 3 H2O2(37， 10min)， 以灭活内源性过 氧化物酶， PBS 冲洗 5min， 三次 ； 0158 1.2.4.7 滴加一抗 ( 鼠抗人 PCNAIgG1 ： 50， 兔抗人 Ki67IgG1 ： 50)， 37 20min 后 4过夜 ； 0159 1.2.4.837复温 lh， PBS 冲洗 2min， 三次 ； 0160 1.2.4.9 滴加二抗中试剂 1， 37， 20min， PBS 冲洗 5min， 三次 ； 说 明 书 CN。
37、 104248645 A 9 8/18 页 10 0161 1.2.4.10 滴加二抗中试剂 2， 37， 30min ； PBS 冲洗 5min， 三次 ； 0162 1.2.4.11 滴加新鲜配置的 DAB 显色， 镜下控制时间， 蒸馏水冲洗终止反应 ； 0163 1.2.4.12 苏木素轻度复染， 自来水冲洗 ； 梯度酒精脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封 片 ； 0164 1.2.4.13 镜下观察并照相， 计数 100 个细胞中的阳性细胞数， 随机选择 6 个视野， 计算均值 100为阳性细胞的比率。 0165 1.2.5 统计处理方法 0166 数据处理采用 SPSS18.0 软件。。
38、实验数据均用均数 标准差表示， 多组均数间的 比较采用 F 检验， 多组均数间的多重比较采用 q 检验。P0.05 无统 计学意义。 0167 1.3 实验结果 0168 1.3.1 对体外培养 ECV-304 细胞增殖的影响 0169 ECV-304 细胞在不同配比组成的复方聚维酮碘消毒液培养液中培养不同时间后， 可见细胞计数和细胞形态与有效碘浓度及作用时间存在一定关系 ( 时间剂量效应关系， 见 表 1-1)。 0170 1.3.1.1.1 不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用 4h 对 ECV-304 细胞数量 及形态的影响 ： 加复方聚维酮碘消毒液培养 4h， 与对照组比较， 康复新。
39、液组和各实验组细 胞计数均显著增加， PVP-I 组有增强趋势但无统计学意义， 各组细胞形态无明显改变， 细胞 呈圆形或不规则形， 均匀透亮， 贴壁后内皮细胞呈典型铺路石状镶嵌排列， 或呈扁平的短梭 形、 多角形， 镶嵌排列。 0171 1.3.1.1.2不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用8h对ECV-304细胞数量及 形态的影响 ： 培养 8h 后， 康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加， 与对照组、 PVP-I 组 比较有统计学意义， 形态无明显改变 ； PVP-I 组细胞计数有减少趋势， 可见形态改变， 细胞 内可见空泡现象以及中毒颗粒。 0172 1.3.1.1.3 不同有效碘浓。
40、度的复方聚维酮碘消毒液作用 12h 对 ECV-304 细胞数量 及形态的影响 ： 培养 12h 后， 康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加， 与对照组、 PVP-I 组比较有统计学意义， 形态无明显改变 ； PVP-I 组细胞计数显著减少， 可见细胞形态明显改 变为成纤维样长梭形， 细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒。 0173 1.3.1.1.4 不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用 24h 对 ECV-304 细胞数量 及形态的影响 ： 培养 24h 后， 康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加， 与对照组、 PVP-I 组比较有统计学意义， 形态无明显改变 ； PVP-I 组细胞计数显。
41、著减少， 可见细胞形态明显改 变为成纤维样长梭形， 且可见部分细胞回缩脱壁， 细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒。 0174 表 1-1 不同时间段复方聚维酮碘消毒液对细胞计数的影响 0175 说 明 书 CN 104248645 A 10 9/18 页 11 0176 注 ： 与空白组相比， P110， 复方聚维酮碘 消毒液， 在不同浓度、 不同储存时间及条件下， 其下降率均 5.00， 达到消毒合格标准 ； 有效碘在 5.0010.00范围内时， 对白色念珠菌作用2min， 2.50浓度时作用10min杀灭对数值 4.00， 达到消毒合格标准 ( 表 2-4、 2-5、 2-6)。 0218 。
42、表 2-4 复方聚维酮碘消毒液对金黄色葡萄球菌 (ATCC6538) 的定量杀灭试验结 果 0219 0220 表 2-5 复方聚维酮碘消毒液对大肠杆菌 (8099) 的定量杀灭试验结果 0221 说 明 书 CN 104248645 A 15 14/18 页 16 0222 表 2-6 复方聚维酮碘消毒液对白色念珠菌 (ATCC10231) 的定量杀灭试验结果 0223 0224 2.4 实验讨论 0225 从稳定性角度看， 复方聚维酮碘消毒液的各种浓度下有效碘下降率均得到较大程 度的改善， 碘挥发性实验也证明复方消毒液的碘挥发程度大大减轻， 可能与美洲大蠊醇提 物的成分组成有关， 美洲大蠊。
43、醇提物富含蛋白质、 氨基酸类成分， 蛋白质的三级空间结构有 利于碘的络合， 聚维酮碘本身为络合结构， 小分子的氨基酸填充其中也有利于碘的保留 ； 从 杀菌效果看， 10.0复方聚维酮碘消毒液杀菌效果与 PVP-I 相比， 具有增强趋势， 可能与康 复新中含有的抗菌肽有关， 较高有效碘浓度的， 随着有效碘浓度下降， 杀菌能力下降， 表明 该复方聚维酮碘消毒液中起杀菌作用的成分主要还是聚维酮碘， 美洲大蠊醇提物主要提高 聚维酮碘的稳定性。 0226 3. 复方聚维酮碘消毒液毒性考察 0227 3.1 实验材料 0228 复方聚维酮碘消毒液(自制， 规格有效碘浓度10.0)(实验中所用的复方聚维酮 。
44、碘消毒液， 其中除了聚维酮碘、 美洲大蠊提取物、 碘酸钾外， 不含防腐剂或其他辅料 ) 0229 3.2 实验动物 0230 昆明小鼠、 wistar 大鼠及日本大耳白兔均由四川达硕实验动物中心提供。 0231 3.3 实验方法 0232 依据 “消毒产品毒理学实验技术规范” 进行。 0233 3.3.1 急性经口毒性试验 0234 选取体重 180 220g 的 SPF 级 Wistar 大鼠 20 只、 体重 18 22g 的 SPF 级昆明 小鼠 20 只， 雌雄各半。一次灌胃至设计剂量 5000mg/kgbw， 连续观察 14d， 记录中毒反应 和死亡情况， 试验后解剖观察脏器变化， 。
45、计算大、 小鼠的 LD50。 0235 3.3.2 嗜多染红细胞微核试验 0236 取体重2530g的SPF级昆明小鼠50只， 分为5组 ： 即500、 2000、 5000mg/kg bw3 个剂量组， 1 个阳性对照组给予环磷酰胺 (40mg/kgbw)， 1 个阴性对照组给予无菌蒸馏水， 每组动物 10 只， 雌雄各半。采用经口灌胃 30h 染毒法， 即两次染毒间隔 24h， 第二次染毒后 6h 用颈椎脱臼法处死动物， 股骨髓涂片， Giemsar 染色。每只动物计数 1000 个 PCE， 微核率 以千分率表示。 说 明 书 CN 104248645 A 16 15/18 页 17 0。
46、237 3.3.3 多次完整皮肤刺激试验 0238 选取 2.5kg 左右的清洁级健康日本大耳白兔 3 只， 试验前 24h 于兔背部脊柱两侧 脱毛， 脱毛范围为左右各约 3cm3cm。次日将受试物原液 0.5ml 直接涂抹于一侧去毛完整 皮肤上， 另一侧涂无菌生理盐水作对照。作用 4h 后， 用无菌蒸馏水除去残留受试物。每天 涂抹一次， 连续涂抹 14d。在每次涂抹后 24h 观察结果， 进行刺激反应评分。 0239 3.3.4 一次破损皮肤刺激试验 0240 选取 2.5kg 左右的清洁级健康日本大耳白兔 3 只， 试验前 24h 于兔背部脊柱两侧 脱毛， 脱毛范围为左右各约 3cm3cm。
47、。次日在涂抹受试物之前， 在 2.5cm2.5cm 的去毛皮 肤上， 用 75酒精清洁、 消毒暴露皮肤， 待酒精挥发后， 用无菌注射针头在消毒区内划一个 “#” 形破损伤口， 以不伤及真皮为度， 并将受试物原液 0.5ml 直接涂抹于左侧破损区内皮肤 上， 然后用一层无刺激塑料膜覆盖， 再用无刺激胶布固定 ； 另一侧作对照， 用生理盐水代替 样品进行实验。作用 4h 后， 用无菌蒸馏水除去残留受试物。分别于除去受试物后 1h、 24h、 48h， 观察皮肤局部反应， 进行刺激反应评分。 0241 3.3.5 急性眼刺激试验 0242 选取 2.5kg 左右的清洁级日本大耳白兔 3 只， 将受试物原液 0.1ml 滴入兔左侧眼 结膜囊内， 立即使眼被动闭合 4s， 30s 后用无菌生理盐水冲洗。右眼作对照， 滴入等量无菌 生理盐水。于滴眼后 1h、 24h、 48h、 72h、 7d、 14d 和 21d， 肉眼。