桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用.pdf

本发明公开了一种桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，探讨桑白皮脂肪油对SHR大鼠的利尿降压作用。本发明首先采用大鼠代谢笼法，观察桑白皮脂肪油对正常大鼠尿量的影响，然后选用自发性高血压大鼠（SHR）模型，重复剂量给药7天，观察桑白皮脂肪油对SHR大鼠尿量及收缩压（SBP）的影响。结果：与对照组（CMC-Na组）相比，桑白皮脂肪油对正常大鼠及SHR大鼠均具有明显的利尿作用（P<0.01），并且还可显著降低SHR大鼠的收缩压(P<0.01)。与现有技术相比，本发明确定了桑白皮脂肪油组分具有明显的利尿和降压作用，使得桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品中使用更方便，解决了因桑白皮发挥利尿降压作用的物质基础不明给患者用药带来了诸多不便的问题。

权利要求书
1.  一种桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，其特征在于：所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。

2.  根据权利要求1所述的桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，其特征在于：所述桑白皮脂肪油是将精密称取的干燥至恒重的桑白皮粉末过60-80目筛并置于滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器中，然后加入桑白皮粉末重量8-12倍量的石油醚，在温度为60~90℃时回流提取5-7h；将提取液放冷至室温，过滤并收集滤液，将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥去溶剂，在温度为100℃时干燥1h，移置于干燥器中，冷却30-40min，即得桑白皮脂肪油；所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。

3.  根据权利要求2所述的桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，其特征在于：所述滤纸为脱脂滤纸。

说明书桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用
技术领域
本发明属于天然植物的应用，具体涉及桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用。 
背景技术
临床上常用的利尿剂如呋塞米、氢氯噻嗪，是最常用于人类心血管疾病的药物，这些药物可以在高血压疾病中降低血压，在心脏疾病中改善心脏衰竭功能。但是，这些利尿剂也存在一些副作用，比如全身电解质的紊乱，血容量减少，代谢性酸或碱中毒等等，因此，寻找新的天然植物利尿药已成为近年来研究心血管疾病的一个热点，它不仅可以治疗和缓解心血管类疾病，还可以减少对机体副作用的发生。 
桑白皮（Cortex Mori）为桑科植物桑Morus alba L.除去栓皮的干燥根皮。始载于《神农本草经》，列为中品，历代本草均有收载。桑白皮性寒、味甘，归肺经，具有清肺平喘、利尿消肿功效，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿。民间常用于消炎、利尿、解热、镇咳等。桑白皮为药食两用中药，主要含多种黄酮类成分，现代研究表明，桑白皮中富含桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇等二苯乙烯类物质。药理学方面研究表明，桑白皮浸膏的丙酮提取物有明显的平喘、利尿作用；桑白皮碱提取物可明显增加酚红排出量，有祛痰作用；桑白皮碱提取物或正丁醇提取物大鼠灌胃或腹腔注射，均有利尿、降糖作用；桑白皮75%乙醇提取物有明显的抗炎、镇痛作用；另外，还有报道称桑白皮具有抗菌、抗癌、降压及抑制中枢神经的作用等。 
桑白皮为常用中药，产于全国各省区，80年代初，中草药脂肪油类成分的活性引起国内外学者的关注，近20多年来随着气相色谱-质谱联用检测技术的日益完善，其被广泛应用于中草药脂肪油化学成分研究。采用GC-MS分析法结合Kovats保留指数对桑白皮脂肪油成分进行研究，发现桑白皮脂肪油中含有较多的化学成分，主要有小分子烯烃，长链脂肪酸类化合物，其中具有较强生物活性的三萜类化合物α-香树脂素和β-香树脂素脂肪油含量较高，分别为10.86%、4.84%，具有抗肿瘤，抗病毒，抗氧化，抗艾滋病等作用。实验表明桑白皮脂肪油还含有丰富的不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量为9.33%，它是一种必需脂肪酸，有营养脑细胞、调节植物神经、显著地降血脂、降低血液中胆固醇含量等功效，亚油酸和亚麻酸可以同时降低LDL，有研究报道表明桑白皮脂肪油具有良好的祛痰、体外抗氧化以及诱导CHO.hIR/STAT5b/Luc细胞靶控报告基因的表达的作用。国内外均有桑白皮利尿作用降压作用的报导，但关于其发挥利尿降压作用的物质基础不明，给患者用药带来了诸多不便。 
中药具有悠久的用药历史，临床上利尿中药在治疗高血脂、高血压、电解质紊乱及尿少浮肿或以上兼有的情况下具有较好的功效，与西药利尿剂引起的血脂升高、尿酸升高等毒副作用相比，中药利尿药显示了其独特的优势，因此，中药在利尿降压及联合用药方面具有较好的开发应用前景。 
发明内容
针对现有技术中因桑白皮发挥利尿降压作用的物质基础不明给患者用药带来了诸多不便的问题，为探讨桑白皮发挥利尿作用的物质基础及可能的作用机制，本发明提供了桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，对桑白皮脂肪油组分的利尿降压活性进行了初步药理学研究，为更深一步的探讨奠定基础，并为临床治疗水肿性疾病扩大用药资源。 
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 
一种桑白皮脂肪油在制备治疗利尿降压药品中的应用，所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。
所述桑白皮脂肪油是将精密称取的干燥至恒重的桑白皮粉末过60-80目筛并置于滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器中，然后加入桑白皮粉末重量8-12倍量的石油醚，在温度为60~90℃时回流提取5-7h；将提取液放冷至室温，过滤并收集滤液，将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥去溶剂，在温度为100℃时干燥1h，移置于干燥器中，冷却30-40min，即得桑白皮脂肪油；所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。 
所述滤纸为脱脂滤纸。 
本发明采用水煎煮提取法结合萃取、醇沉、大孔吸附树脂（DiaionHP-20大孔吸附树脂）等技术，桑白皮水蒸气蒸馏得到挥发油组分，将其水提物浓缩，加入2倍量石油醚萃取，石油醚层浓缩，回收溶剂后，真空干燥6h得到石油醚组分（脂肪油组分），然后将水提液层上DiaionHP-20大孔吸附树脂，得到30%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、80%乙醇洗脱组分和醇沉组分（多糖组分）。对各部位进行利尿活性的筛选，发现脂肪油组分具有较好的利尿作用，因此，对其利尿降压作用进行进一步的探讨。 
与现有技术相比，本发明的有益效果为：①本发明桑白皮脂肪油制备方法简单、方便、成本低，稳定可靠，并经多次以上试验，均取得了相同或相近似的结果；②采用大鼠代谢笼法，观察桑白皮脂肪油对正常大鼠尿量的影响，然后选用自发性高血压大鼠（SHR）模型，观察桑白皮脂肪油对SHR大鼠尿量及收缩压（SBP）的影响，与对照组（CMC-Na组）相比，桑白皮脂肪油对正常大鼠及SHR大鼠均具有明显的利尿作用（P<0.01），并且还可显著降低SHR大鼠的收缩压(P<0.01)，实验结果表明：桑白皮脂肪油具有明显的利尿和降压作用；③本发明确定了桑白皮脂肪油组分具有明显的利尿和降压作用，使得桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品中使用更方便，桑白皮脂肪油用量少、服用方便，解决了因桑白皮发挥利尿降压作用的物质基础不明给患者用药带来了诸多不便的问题，临床意义巨大，具有较好的开发前景。 
附图说明
图1为本实施例1中桑白皮各组分拆分的的工艺流程图。 
图2为实施例1中30%、50%、80%乙醇洗脱组分样本聚类分析图。 
图3为实施例1中30%、50%、80%乙醇洗脱组分样本主成分分析图。 
图4为实施例1中30%、50%、80%乙醇洗脱组分样本正交偏最小二乘法分析图。 
图5为实施例1中桑白皮脂肪油对正常大鼠尿量的影响，其中，空白对照组：* P<0.05， ** P<0.01 vs ，CMC-Na对照组：# P<0.05， ## P<0.01 vs。 
图6为实施例1中桑白皮脂肪油对SHR大鼠给药第7天24h尿量的影响，其中，空白对照组：* P<0.05， ** P<0.01 vs，CMC-Na对照组：# P<0.05，## P<0.01 vs。 
图7为实施例1中桑白皮脂肪油对SHR大鼠收缩压（SBP）的影响，其中，空白对照组：* P<0.05，** P<0.01 vs，CMC-Na对照组：# P<0.05，## P<0.01 vs。 
图8为实施例1中桑白皮脂肪油成分的总离子流图，其中，横坐标：计数（%）与采集时间，纵坐标×101。 
具体实施方式
实施例1
本实施例所用的材料与仪器：
1.实验材料
1.1 动物
Wistar 大鼠，雄性，体重180~220g，由山东鲁抗医药股份有限公司质监中心实验动物室提供，合格证号：0014947。饲养于18~22℃清洁级动物实验室内，自由饮食、饮水。
SHR大鼠，雄性，13~16周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK2012-0001。饲养于18~22℃清洁级动物实验室内，自由饮食、饮水。 
1.2药物与试剂 
桑白皮购自郑州市中药材市场，由河南中医学院陈随清教授、董诚明教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮；  
阳性对照药选用氢氯噻嗪（HCTZ），购自山东仁和堂药业有限公司，批号为：121202。
1.3主要仪器 
IVC独立通风系统、大鼠代谢笼装置，江苏苏州冯氏实验动物有限公司； 90-3磁力搅拌器，上海振捷实验设备有限公司；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司；SK6200H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；BP-6A自动无创血压控制器，成都泰盟科技有限公司；Agilent7890/7000B三重串联四级杆气质联用仪（美国安捷伦公司）；标准玻璃索式提取器(上海豫明仪器有限公司)；AB204-N型万分之一电子天平（河南爱博特科技发展有限公司）；Q-250A3粉碎机（瑞达国际）；SB-1000型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）、ChemPattern软件(科迈恩北京科技有限公司)。
本实施例采用水煎煮提取法结合萃取、醇沉、大孔吸附树脂（DiaionHP-20大孔吸附树脂）等技术，桑白皮水蒸气蒸馏得到挥发油组分，将其水提物浓缩，加入2倍量石油醚萃取，石油醚层浓缩，回收溶剂后，真空干燥6h得到石油醚组分（脂肪油组分），然后将水提液层上DiaionHP-20大孔吸附树脂，得到30%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、80%乙醇洗脱组分和醇沉组分（多糖组分），工艺流程如下图1所示。 
对桑白皮各拆分组分互不交叉性研究： 
重复制备10批次拆分组分供试品，分别采用HPLC-PDA、HPLC-ELSD和UPLC-DAD方法进行检测，不同类型检测器之间形成优势互补，从不同角度、层面考察各组分化学成分相互交叉情况。
    对桑白皮各拆分组分，分别采用HPLC-PDA、HPLC-ELSD和UPLC-DAD方法进行互不交叉研究。因脂肪油组分、挥发油组分、多糖组分（醇沉组分）与水溶性组分之间成分不可能交叉，有可能交叉的是30%、50%、80%乙醇洗脱组分，在此，以HPLC-ELSD结果为例（HPLC-PDA和UPLC-DAD结果未附图），对有可能交叉的组分进行了互不交叉研究。 
HPLC-ELSD数据聚类分析：将制备好的10批次拆分组分按已确定的HPLC-ELSD液相条件进样分析，将数据导入ChemPattern软件，聚类分析结果显示，样本1～10号为一类、11～20号为一类、21～30号为一类。验证了30%、50%、80%乙醇洗脱组分各聚一类，互不交叉，分析结果如图2所示。 
HPLC-ELSD数据主成分分析：将制备好的10批次拆分组分按已确定的HPLC-ELSD液相条件进样分析，记录100min色谱图，经 ChemPattern软件处理分析，分析结果如图3所示。 
HPLC-ELSD数据正交偏最小二乘法：在前期分析的基础上，又进行了正交偏最小二乘法的分析，得到结果，如图4所示，从LV1-LV2-LV3散点图发现，样本可明显分为3区域，样本1～10号构成区域Ⅰ、11～20号构成区域Ⅱ、21～30号构成区域Ⅲ。验证了30%、50%、80%乙醇洗脱组分互不交叉。 
研究结果显示，桑白皮的挥发油组分、石油醚组分（脂肪油组分）、醇沉组分、30%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、80%乙醇洗脱组分等互不交叉，对各组分进行利尿活性的筛选，发现脂肪油组分具有较好的利尿作用，因此，对其利尿降压作用进行进一步的探讨。 
本实施例桑白皮脂肪油是将精密称取的100g干燥至恒重的桑白皮粉末过60目筛并置于脱脂滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器中，然后加入桑白皮粉末重量10倍量的石油醚，在温度为90℃时回流提取5h；将提取液放冷至室温，过滤并收集滤液，将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥去溶剂，在温度为100℃时干燥1h，移置于干燥器中，冷却30min，即得桑白皮脂肪油；所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。 
本实施例对正常大鼠利尿作用实验：
取180~220g的Wistar雄性大鼠预先置于代谢笼中适应2d，观察自由饮水条件下尿量是否稳定，实验前禁食不禁水18h，实验开始时轻压腹部，排尽膀胱内余尿，以口服灌胃法给予大鼠去离子水2.0ml/100g，收集2h尿液，凡尿量超过40%水负荷者可做为实验大鼠。选出合格大鼠32只，按体重和尿量分为4组，每组8只，分别为空白对照组、CMC-Na对照组、氢氯噻嗪组和桑白皮脂肪油组。实验开始时，各组先灌胃给予生理盐水5.0ml/100g进行给水负荷，30分钟后，空白对照组和CMC-Na对照组分别给予蒸馏水和0.5%CMC-Na溶液，氢氯噻嗪组给予氢氯噻嗪（HCTZ）17.0mg/kg，桑白皮脂肪油组给予桑白皮脂肪油83.7mg/kg，给药体积均为1.0ml/100g，轻压腹部，排尽膀胱内余尿，然后将大鼠分别置于代谢笼中，分别于给药1小时、3小时、5小时收集尿液。计算各组在一定时间段内的尿量和5小时累积排尿量，比较各组尿量。
桑白皮脂肪油对正常大鼠尿量的影响： 
    从结果可以看出，与CMC-Na对照组相比，桑白皮脂肪油在给药后1小时、3小时均能显著增加大鼠的尿量（P<0.01），药后第5小时作用不明显（P>0.05），3小时累积和5小时累积尿量均显著性增加（P<0.01），结果如表1和图5所示：
表1桑白皮脂肪油对正常大鼠尿量的影响

* P<0.05， ** P<0.01 vs  空白对照组；# P<0.05， ## P<0.01 vs  CMC-Na对照组
本实施例对SHR大鼠利尿降压作用实验：
取13~16周龄雄性SHR大鼠32只，适应性喂养一周，采用无创套尾法测血压，适应代谢笼2d，根据体重和血压分为4组，每组8只，分别为空白对照组、CMC-Na对照组、氢氯噻嗪组和桑白皮脂肪油组。空白对照组和CMC-Na对照组分别给予蒸馏水和0.5%CMC-Na溶液，氢氯噻嗪给予氢氯噻嗪（HCTZ）17.0mg/kg，桑白皮脂肪油给予桑白皮脂肪油83.7mg/kg，给药体积均为1.0ml/100g，重复给药7d，收集第7天给药后24h尿液并采用无创套尾法测定血压，计算并比较各组尿量及血压的变化。
桑白皮脂肪油给药7天对SHR大鼠尿量及血压（收缩压）的影响： 
从结果可以看出，与CMC-Na对照组相比，桑白皮脂肪油给药7天，可明显增加SHR大鼠的尿量（P<0.01），结果如表2和图6所示；并且从结果可以看出可显著降低SHR大鼠的收缩压（P<0.01），结果如表3和图7所示：
表2 桑白皮脂肪油对SHR大鼠给药第7天24h尿量的影响

* P<0.05，** P<0.01 vs 空白对照组；# P<0.05，## P<0.01 vs CMC-Na对照组
表3 桑白皮脂肪油给药7天对SHR大鼠收缩压（SBP）的影响

* P<0.05，** P<0.01 vs 空白对照组；# P<0.05，## P<0.01 vs CMC-Na对照组
本实施例中统计处理：
实验数据以±s表示，用SPSS18.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间差异的比较，以P<0.05为差异有显著性意义，以P<0.01为差异有极显著性意义。。
本实施例桑白皮脂肪油成分的鉴定： 
取本实施例桑白皮脂肪油适量（约100mg）于10mL具塞刻度试管中，加入4mL正己烷，再加入1mL0.8molL-1氢氧化钠甲醇溶液，涡旋5min，加入0.5g硫酸氢钠干燥，离心10min，取上层清液，过0.22μm滤膜，进行GC-MS分析：气相色谱条件：色谱柱为DB-5型石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm），载气为高纯氦气（99.999%），氦气流速1.0mL/min；进样口温度为280℃；分流进样，分流比30:1，进样量0.1μL；升温程序为160℃，保持3分钟，然后按4℃/min升温至240℃，以1℃/min升温至245℃，最后以4℃/min升温至290℃，保持10min，气化室温度280℃，接口温度280℃；质谱条件：碰撞气流速：氦气2.25ml/min；氮气1.5ml/min；离子源：电子轰击源，电子能量70eV；扫描范围45~400amu，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，溶剂延迟：4.0min，GC-MS接口温度280℃，分析结果，如图8所示。
对图8中桑白皮脂肪油成分的总离子流图中的各峰的质谱图进行质谱库检索，选取相似度高的前10个可能物质，分别通过http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文献（DB-5柱）得到其保留指数KI值的文献值，初步确定化学成分。保留指数KI文献结果与保留指数KI计算结果相比较，以质谱相似度和保留指数KI值接近度最高的化学结构为最佳鉴定结果，无法得到保留指数的部分仍以相似度为准，同时运用峰面积归一化法得各挥发性组分的相对百分含量，结果如表4： 
表4 本实施例桑白皮脂肪油化学成分GC-MS分析结果


通过GC-MS分析桑白皮脂肪油成分分离检测出38个组分，经质谱库检索与保留指数双重定性的方法鉴定出27种主要成分，其相对含量总和占总检出化合物的93.79%，含量最为丰富的物质为角鲨烷，占50.40%，其次为α-香树脂素（10.86%）、亚油酸甲酯（9.33%）、β-香树脂素（4.84%）、棕榈酸甲酯（3.08%）、油酸甲酯（1.76%）等。
实施例2
本实施例所用的材料与仪器：
1.实验材料
1.1药物与试剂
桑白皮购自郑州市中药材市场，由河南中医学院陈随清教授、董诚明教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮。  
1.2主要仪器
    90-3磁力搅拌器、上海振捷实验设备有限公司、ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱、上海智城分析仪器制造有限公司、SK6200H超声波清洗器、上海科导超声仪器有限公司、标准玻璃索式提取器(上海豫明仪器有限公司)、AB204-N型万分之一电子天平（河南爱博特科技发展有限公司）、Q-250A3粉碎机（瑞达国际）、SB-1000型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）。
本实施例桑白皮脂肪油是将精密称取的100g干燥至恒重的桑白皮粉末过70目筛并置于脱脂滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器中，然后加入桑白皮粉末重量8倍量的石油醚，在温度为70℃时回流提取6h；将提取液放冷至室温，过滤并收集滤液，将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥去溶剂，在温度为100℃时干燥1h，移置于干燥器中，冷却35min，即得桑白皮脂肪油；所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。 
实施例3
本实施例所用的材料与仪器：
1.实验材料
1.1药物与试剂
桑白皮购自郑州市中药材市场，由河南中医学院陈随清教授、董诚明教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮。  
1.2主要仪器
    90-3磁力搅拌器、上海振捷实验设备有限公司、ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱、上海智城分析仪器制造有限公司、SK6200H超声波清洗器、上海科导超声仪器有限公司、标准玻璃索式提取器(上海豫明仪器有限公司)、AB204-N型万分之一电子天平（河南爱博特科技发展有限公司）、Q-250A3粉碎机（瑞达国际）、SB-1000型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）。
本实施例桑白皮脂肪油是将精密称取的100g干燥至恒重的桑白皮粉末过80目筛并置于脱脂滤纸筒内，将滤纸筒置于索氏提取器中，然后加入桑白皮粉末重量12倍量的石油醚，在温度为60℃时回流提取7h；将提取液放冷至室温，过滤并收集滤液，将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥去溶剂，在温度为100℃时干燥1h，移置于干燥器中，冷却40min，即得桑白皮脂肪油；所述桑白皮脂肪油用于制备治疗利尿降压药品。