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1、(10)申请公布号 CN 104255432 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255432 A (21)申请号 201410450321.1 (22)申请日 2014.09.04 A01H 1/02(2006.01) (71)申请人 镇江瑞繁农艺有限公司 地址 212400 江苏省镇江市句容市宁杭路 112 号 (72)发明人 孙春青 潘跃平 马志虎 戴忠良 毛忠良 吴国平 秦文斌 姚悦梅 张振超 潘永飞 孙国胜 王建华 陈智超 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 龚燮英 (54) 发明名称 一种获得睡莲品种间杂交种的方法 (。
2、57) 摘要 本发明涉及一种获得睡莲品种间杂交种的方 法， 属于植物育种技术领域。其主要技术措施是 ： 品种间进行杂交后， 取授粉后 14-16d 的子房， 并 对其进行无菌处理， 再将其中的胚取出， 后将胚 作为外植体在 1/2MS 添加 2， 4-D 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L 的培养基进行培养， 经过继代培养和扩 繁得到幼苗后， 将幼苗转移到MS添加0.2mg/LNAA 的培养基中生根， 培养温度 20-25， 每日光照 10-12h， 光照度 1600-2000lx。本发明能够解决睡 莲品种间杂交受精后障碍这一关键技术问题， 同 时可得到睡莲品种间的杂交种实生苗。 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104255432 A CN 104255432 A 1/1 页 2 1. 一种获得睡莲品种间杂交种的方法， 包括以下步骤 ： 步骤一、 将父母本在开花前一天进行套袋隔离， 第二天上午， 取新鲜的父本花粉对母本 进行授粉， 授粉后进行套袋隔离 ； 步骤二、 授粉后 14-16d 连续取杂交花序， 将子房轻轻剥出， 后将子房用流水冲洗 10min， 再用医用乙醇消毒 50s， 消毒后置于 0.1的升汞溶液中 4-5min， 然后用。
4、无菌水冲洗 5-6 次， 冲洗后用无菌的刀片划开种皮， 取其胚作为外植体 ； 步骤三、 将外植体置于添加生长素和细胞分裂素的接种培养基中进行培养 , 每瓶接种 胚胎 10-15 个 ； 35d 后转入继代培养， 得到幼苗后转到 MS+6-BA 0.2mg/L 的培养基中扩繁 ； 扩繁得到幼苗后， 将幼苗转移到生根培养基中， 培养温度 20-25， 每日光照 10-12h， 光照 度 1600-2000lx。 2. 根据权利要求 1 所述一种获得睡莲品种间杂交种的方法， 其特征在于 ： 所述步骤二 中， 取子房的时间为授粉后 14-16d。 3. 根据权利要求 1 所述一种获得睡莲品种间杂交种的。
5、方法， 其特征在于 ： 所述步骤三 中接种培养基为 ： 1/2MS， 培养基中添加的生长素是浓度为 1.5mg/L 的 2， 4-D， 细胞分裂素是 浓度为 2.0mg/L 的 6-BA ； 所述继代培养的培养基为 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L ； 所述 生根培养基为 MS 添加 0.2 mg/L NAA。 权 利 要 求 书 CN 104255432 A 2 1/2 页 3 一种获得睡莲品种间杂交种的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种获得睡莲品种间杂交种的方法， 属于植物育种技术领域。 背景技术 0002 睡莲是睡莲科睡莲属 (Nymphaea) 植物的泛称。。
6、全世界睡莲属植物有 40-50 种， 我 国有 5 种。睡莲以其丰富的花色、 圣洁的寓意及茎叶对水中富营养物和有害物质的强吸附 能力， 深受人们的喜爱， 被广泛应用于园林水景中。 0003 目前， 品种间杂交育种依然是花卉新品种的选育的主要方法之一。国外睡莲的杂 交选育开展了 150 年， 已选育大批新品种， 而国内睡莲的新品种选育从上世纪末刚刚起步， 许多通过杂交手段获得杂交种技术还未能突破， 如， 睡莲部分品种间杂交存在受精后障碍， 致使杂交得不到种子， 严重影响了睡莲花色、 叶色等优异基因的再组合， 因此解决这一难题 对睡莲新品种选育具有重要的意义。 0004 而利用胚培养技术来克服睡莲。
7、品种间受精后障碍可以直接获得杂交花型、 花色、 叶色和抗性不同的睡莲新品种。这一技术的公布不仅可以填补国内睡莲胚培养技术的空 白， 而且可以提供一种选育睡莲新品种的方法， 从而加速睡莲特异遗资源应用于生产提供 技术支持。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是 ： 针对现有技术存在的缺陷， 提供一种获得睡莲品种 间杂交种的方法， 此方法能够解决睡莲品种间杂交受精后障碍这一关键技术问题， 同时可 得到睡莲品种间的杂交种实生苗。 0006 本发明通过以下技术方案解决技术问题 ： 一种获得睡莲品种间杂交种的方法， 主 要包括以下步骤 ： 0007 步骤一、 将父母本在开花前一天进行套袋隔离， 。
8、第二天上午， 取新鲜的父本花粉对 母本进行授粉， 授粉后进行套袋隔离 ； 0008 步骤二、 授粉后 14-16d 连续取杂交花序， 将子房轻轻剥出， 后将子房用流水冲洗 10min， 再用医用乙醇消毒 50s， 消毒后置于 0.1的升汞溶液中 4-5min， 然后用无菌水冲洗 5-6 次， 冲洗后用无菌的刀片划开种皮， 取其胚作为外植体。 0009 步骤三、 将外植体置于1/2MS添加2， 4-D 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L的培养基中进行 培养， 每瓶接种胚胎 10-15 个 ； 35d 后转入继代培养， 继代培养基为 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L， 。
9、得到幼苗后转到 MS+6-BA 0.2mg/L 的培养基中扩繁 ； 扩繁得到幼苗后， 将幼苗 转移到 MS 添加 0.2mg/LNAA 的培养基生根， 培养温度 20-25， 每日光照 10-12h， 光照度 1600-2000lx。 0010 有益效果本发明提供的获得睡莲品种间杂交种的方法， 与现有技术相比具有如下 优点和积极效果 ： 0011 (1) 本发明利用不同花色、 花型的睡莲品种间进行杂交， 结合胚培养技术进行种质 说 明 书 CN 104255432 A 3 2/2 页 4 创新， 拓宽了睡莲品种的遗传基础， 交换了睡莲品种间的优异基因， 实现了部分种间杂交， 创造了一批新种质。。
10、 0012 (2) 在胚培养技术上比较了不同培养基、 不同激素配比、 不同胚龄等的效果， 筛选 出培养胚龄以14-16d最好， 培养基以1/2MS， 培养基中添加2， 4-D1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L效 果较好。 0013 (3) 获得了一批睡莲品种间的种间杂种。 0014 (4) 在本发明的基础上， 使利用创新的睡莲种质进行睡莲育种成为可能， 同时可进 行睡莲起源演化及睡莲属亲缘关系研究。 具体实施方式 0015 本发明提供的获得睡莲品种间杂交种的方法， 其实施方式如下 ： 0016 1.1 材料选择 0017 粉妆 (NymphaeaFen Zhuang ) 和 白仙子 (N。
11、ymphaeaGonnere )( 均为公知 品种， 见参考文献黄国振 , 邓惠勤 , 李祖修 , 李钢 . 睡莲 . 中国林业出版社， 北京 ,2001)， 粉妆 花色是粉色花， 花型是星形， 而 白仙子 花色是白色， 花型球状。若将 白仙子 的花 型转移到 粉妆 上， 将培育出多瓣花型漂亮的粉色花， 事实上， 经过多年杂交实践，粉妆 与 白仙子 杂交得不到杂交种， 其主要原因在于存在受精后障碍。 0018 1.2粉妆 和 白仙子 杂交种实生苗的获得 0019 粉妆 作为母本，白仙子 作为父本进行人工杂交， 将父母本在开花前一天套 袋， 人工授粉工作选择在晴天进行， 花朵开放当天进行授粉。授。
12、粉前用干净的镊子将父本 的花粉块轻轻取下， 置于干燥的烧杯中或纸上， 置入母本的柱头上， 完成授粉后套袋。授粉 后 14-16d 连续取杂交花序， 将子房轻轻剥出， 后将子房用流水冲洗 10min， 再用医用乙醇消 毒 50s， 消毒后置于 0.1的升汞溶液中 4-5min， 然后用无菌水冲洗 5-6 次， 冲洗后用无菌 的刀片划开种皮， 取其胚作为外植体。将此外植体置于 1/2MS 添加 2， 4-D 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L 的培养基中进行培养 , 每瓶接种胚胎 10-15 个 ； 35d 后转入继代培养， 继代培养基 为 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L， 得到幼苗后转到 MS+6-BA 0.2mg/L 的培养基中扩繁 ； 扩 繁得到幼苗后， 将幼苗转移到MS添加0.2mg/LNAA的培养基生根， 培养温度20-25， 每日光 照 10-12h， 光照度 1600-2000lx。获得 粉妆 和 白仙子 种间杂交后代材料。 说 明 书 CN 104255432 A 4 。