小檗碱衍生物的医药用途.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201310218544.0

申请日:

2013.06.04

公开号:

CN104208061A

公开日:

2014.12.17

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/4375申请日:20130604|||公开

IPC分类号:

A61K31/4375; A61P35/00

主分类号:

A61K31/4375

申请人:

中山大学

发明人:

胡海燕; 付胜楠; 庹珏; 谢彦奇; 张国光; 王亚龙; 朱文博; 颜光美

地址:

510275 广东省广州市新港西路135号

优先权:

专利代理机构:

广州粤高专利商标代理有限公司 44102

代理人:

倪小敏

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内容摘要

本发明提供式(I)的化合物或其盐在制备治疗恶性胶质瘤药物或线粒体靶向给药系统中方面的应用: 式(I),其中,R为C10-C18烷基,或者R为苄基。本发明通过实验发现,与对照相比,本发明的小檗碱衍生物不仅能更有效地抑制胶质瘤细胞的增殖,更能同时有效地抑制细胞的迁移与侵袭能力。此外,这些化合物能够很好地定位到线粒体中,因此能够作为线粒体靶向给药系统。

权利要求书

权利要求书
1.  式(I)的化合物或其盐在制备治疗恶性胶质瘤药物或线粒体靶向给药系统中的应用:
 式(I),
其中,R为C10-C18烷基,或者苄基。

2.  根据权利要求1所述的应用,其中,R为C10-C18正烷基。

3.  根据权利要求1所述的应用,其中,R为C12-C16正烷基。

4.  根据权利要求1所述的应用,其中,R为正十二烷基或正十六烷基。

5.  根据权利要求1至4任何一项所述的应用,其中所述盐选自氢溴酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和乳酸盐。

6.  根据权利要求1所述的应用,其中,所述化合物选自:9-O-正十烷基小檗碱,9-O-正十二烷基小檗碱,9-O-正十六烷基小檗碱,9-O-正十八烷基小檗碱,和9-O-苄基小檗碱。

7.  根据权利要求1所述的应用,其中,所述药物包含至少一种额外的对治疗恶性胶质瘤有效的成分。

8.  根据权利要求1所述的应用,其中,所述药物包含药用赋形剂。

9.  根据权利要求1所述的应用,其中,所述线粒体靶向给药系统包含至少一种额外的药物成分。

说明书

说明书小檗碱衍生物的医药用途
技术领域
本发明涉及小檗碱衍生物的新用途,特别是C9-O取代的长链烷基或苄基的衍生物在治疗恶性胶质瘤方面的新用途。
背景技术
恶性胶质瘤(Malignant Glioma)是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤,发病率占颅内肿瘤的46%。手术是首选的治疗方法,但由于其呈浸润性生长,与正常脑组织无明显界限,手术难以切除,术后复发率高达96%。即使辅以放疗和化疗,术后平均生存期也不超过14个月,预后极差。恶性胶质瘤的不可治愈性与其强迁移和侵袭能力密切相关。因此,抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭对恶性胶质瘤的治疗极为关键。然而,现存治疗手段并不能有效地抑制恶性胶质瘤的迁移与侵袭,导致治疗效果不佳,并且还存在神经毒性、血液毒性、耐药性等诸多缺陷。
此外,包括肿瘤在内,多种疾病的病理过程与线粒体损伤有关。肿瘤细胞与正常细胞的线粒体在结构和功能上存在较大差异,与线粒体直接相关的细胞内生化事件的异常,例如糖代谢模式的改变、ATP生成障碍、钙离子蓄积、氧化应激等在不同程度的功能失调都是肿瘤发生发展的重要原因。同时,肿瘤细胞中mtDNA突变以及过量ROS也已经被报道促进肿瘤细胞转移。这使得将药物靶向于肿瘤细胞的线粒体,并通过线粒体选择性地作用于肿瘤细胞成为可能,这对于靶向治疗恶性胶质瘤这类高侵袭性的肿瘤具有重要意义。
小檗碱(Berberine)是从黄连等传统中药材中提取分离得到的一种异喹啉类生物碱,口服安全性高,长期大量服用无血液、心血管及肝肾毒性。研究表明,小檗碱可以抑制肝癌、人舌鳞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌等的迁移与侵袭,但未见对胶质瘤迁移与侵袭的影响的报道。另一方面,虽然小檗碱具有对某些肿瘤的抑制活性,但其药效不太理想。
本发明拟在开发一种安全、有效、低毒的化疗药物,该化疗药物能有效抑制恶性胶质瘤细胞的迁移与侵袭。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种针对恶性胶质瘤的新的治疗方案,其基于小檗碱衍生物对恶性胶质瘤细胞的出乎意料的抑制效果而实现。
根据本发明的第一个方面,本发明提供式(I)的化合物或其盐在制备治疗恶性胶质瘤药物方面的应用:

其中,R为C10-C18烷基,或者R为苄基。所述C10-C18烷基包括C10-C18正烷基或它们的异构体。
在优选的实施方式中,R为C10-C18正烷基,例如正十烷基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基。更优选为C10-C16正烷基。更优选地,R为C12-C16正烷基。更优选地,R为正十二烷基或正十六烷基。
在优选的实施方式中,所述盐选自氢溴酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和乳酸盐,优选为氢溴酸盐、盐酸盐或硫酸盐。
根据本发明的优选实施方式,所述化合物选自:9-O-正十烷基小檗碱,9-O-正十二烷基小檗碱,9-O-正十六烷基小檗碱,9-O-正十八烷基小檗碱,和9-O-苄基小檗碱。
根据本发明的一个实施方式,所述药物包含至少一种额外的对治疗恶性胶质瘤有效的成分,以与本发明的衍生物联合使用。根据本发明的一个实施方式,所述药物包含药用赋形剂,以将所述药物制成合适的剂型。
发明人发现,9-O取代的长链烷基或苄基的小檗碱衍生物对于恶性胶质瘤细胞的生长抑制、迁移抑制和侵袭抑制出乎意料地好于其他小檗碱衍生物以及小檗碱本身。本发明通过实验发现,与对照相比,小檗碱衍生物不仅能更有效地抑制胶质瘤C6细胞的增殖,更能同时有效地抑制细胞的迁移与侵袭能力。可能的原因在于,当亲脂性基团(长链烷基或苄基)与母体药物小檗碱以醚键结合时,提高了化合物的脂溶性,通过提高跨膜转运,而将化合物有效地透过生物膜运送到病变部位及细胞内,从而增强了药效。
根据本发明的第二个方面,本发明提供式(I)的化合物或其盐在制备线粒体靶向给药系统中的应用:

R为C10-C18烷基或苄基。所述C10-C18烷基包括C10-C18正烷基或它们的异构体。
在优选的实施方式中,R为C10-C18正烷基,例如正十烷基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基。更优选为C10-C16正烷基。更优选地,R为C12-C16正烷基。更优选地,R为正十二烷基或正十六烷基。
根据本发明的优选实施方式,所述化合物选自:9-O-十烷基小檗碱,9-O-十二烷基小檗碱,9-O-十六烷基小檗碱,9-O-十八烷基小檗碱,和9-O-苄基小檗碱。
在优选的实施方式中,所述盐选自氢溴酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和乳酸盐,优选为氢溴酸盐、盐酸盐或硫酸盐。
所述线粒体靶向给药系统包含至少一种额外的药物成分,该药物成分通常自身难以进入线粒体,并且与本发明的衍生物不发生有害相互作用。该额外的药物成分在本发明的衍生物的作用下可被定位到线粒体中,从而发挥作用。
根据本发明的第三个方面,本发明提供一种治疗恶性胶质瘤的方法,该方法包括将治疗有效量的式(I)的化合物或其盐施用至有此需要的患者。
在本发明中,C10-C18烷基是指具有10至18个碳原子的直链或支链烷基,类似地,C12-C16烷基是指具有12至16个碳原子的直链或支链烷基。
附图说明
图1显示不同浓度的小檗碱及其衍生物作用于C6细胞24 h后细胞生存率的变化。
图2显示不同浓度的小檗碱衍生物作用于C6细胞24 h、48 h及72 h后细胞生存率的变化,(A)衍生物9-O-十二烷基小檗碱,简称B3, (B)衍生物9-O-十六烷基小檗碱,简称B4, (C) 衍生物9-O-十八烷基小檗碱,简称B5, (D)衍生物9-O-苄基小檗碱,简称B6。
图3显示了小檗碱及其衍生物C6细胞划痕实验结果,(A) 对照组、小檗碱组及小檗碱衍生物组的细胞划痕在0h和24 h后的细胞迁移情况,(B)各组间的相对迁移率比较,与对照比较,*表示P <0.05;**表示P <0.01;***表示P <0.001。B3代表9-O-十二烷基小檗碱;B4代表9-O-十六烷基小檗碱;B5代表9-O-十八烷基小檗碱;B6代表9-O-苄基小檗碱。
图4 显示了小檗碱及其衍生物C6细胞Transwell迁移实验结果,(A) 对照组、小檗碱组及小檗碱衍生物组的细胞迁移情况,(B)各组间的相对迁移率比较,与对照比较,*表示P <0.05;**表示P <0.01;***表示P <0.001。B3代表9-O-十二烷基小檗碱;B4代表9-O-十六烷基小檗碱;B5代表9-O-十八烷基小檗碱;B6代表9-O-苄基小檗碱 。
图5显示了小檗碱及其衍生物C6细胞Transwell侵袭实验结果,(A) 对照组、小檗碱组及小檗碱衍生物组对细胞的侵袭抑制情况;(B)各组间的相对迁移率比较,与对照比较,*表示P <0.05;**表示P <0.01;***表示P <0.001。B3代表9-O-十二烷基小檗碱;B4代表9-O-十六烷基小檗碱;B5代表9-O-十八烷基小檗碱;B6代表9-O-苄基小檗碱 。
图6为小檗碱亲脂性衍生物在C6(A)和U87(B)胶质瘤细胞内的线粒体定位的激光共聚焦观察结果。mitotracker表示mitotracker green标记的线粒体,呈绿色荧光;药物表示小檗碱及其亲脂性衍生物,呈黄色荧光;叠加表示以上两个图像的叠加。B3代表9-O-十二烷基小檗碱;B4代表9-O-十六烷基小檗碱。
具体实施方式
小檗碱衍生物的合成与鉴定
盐酸小檗碱购于西安小草植物科技有限公司,纯度97%;溴代十二烷、溴代十六烷、溴代十八烷、溴化苄均为分析纯,购于阿拉丁试剂有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯,用分子筛干燥处理,购于天津富宇精细化工有限公司;层析用中性氧化铝为国药集团产品;DMEM培养基(R10-013-cv)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素及链霉素均购于美国cellgro公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)均购于美国Sigma公司;4%多聚甲醛购于广州晶欣科技有限公司;实验用水为超纯水。大鼠胶质瘤C6细胞、人胶质瘤U87细胞来自美国ATCC细胞库。Millicell Cell Culture Inserts(8.0 μm PET)为美国Millipore公司产品。AvanceⅢ400MHz核磁共振谱仪为美国Bruker公司产品;超高效液相色谱串联质谱仪UPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access Max)为美国Thermo scientific产品;高速冷冻离心机(LEGEND MICRO 17R)为美国Thermo scientific公司产品;酶标仪(Microplate Reader)为美国BIO-RAD公司产品;倒置研究级显微镜(IX 71)为日本OLYMPUS公司产品;水套式CO2培养箱(HEPA class100)为美国Thermo scientific公司产品。
本发明小檗碱衍生物的一个示例性合成路线如下:

1.1小檗红碱(Berberrubine, B2)的合成与鉴定
采用高温裂解法合成中间体B2。
取干燥的盐酸小檗碱 10 g(0.0269 mol),在N2保护下190℃高温裂解5 h。冷却至室温,丙酮50 mL清洗,得红色晶体7.48 g,产率87%。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 9.22 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.02 (s, 2H), 4.52-4.62 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.05-3.14 (t, J = 6.3 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ: 151.11, 150.85, 149.47, 147.31, 135.54, 133.74, 130.66, 124.21, 122.90, 121.71, 119.63, 109.20, 108.17, 105.81, 103.25, 56.79, 55.53, 28.96; ESI-MS m/z: 322 [M+H]+。
小檗碱衍生物B3, B4, B5,B6和B12的合成与鉴定
将B2与相应溴代物反应分别得到B3, B4, B5, B6和B12。
取B2 0.32 g(1 mmol)溶于5 mL DMF中,在N2保护下,80 ℃与4 mmol相应溴代物反应2h~24h,过滤,取沉淀,干法上样,中性氧化铝柱纯化(氯仿-甲醇 200~100:1),分别得黄色结晶B3, B4,, B5,B6和B12。产率70%~80%。
9-O-十二烷基小檗碱(B3)1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9.76 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.19 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 4.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.24 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.81-1.94 (m, 2H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.39-1.22 (m, 16H), 0.85 (t, J = 6.7 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 150.34, 149.76, 147.62, 145.20, 142.84, 137.36, 133.01, 130.58, 126.62, 123.26, 121.61, 120.37, 120.16, 108.35, 105.38, 102.03, 74.22, 57.00, 55.30, 31.23, 29.43, 28.97, 28.77, 28.65, 26.30, 25.21, 22.03, 13.87; ESI-MS m/z: 490 [M-Br]+。
9-O-十六烷基小檗碱(B4)1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9.75 (s, 1H) 8.94 (s, 1H), 8.20 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.18 (s, 2H), 4.95 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.29 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.23 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.87-1.96 (m, 2H), 1.48-1.58 (m, 2H), 1.24 (s, 24 H), 0.85 (t, J = 3.4 Hz, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 150.36, 149.78, 147.65, 145.23, 142.86, 137.40, 133.02, 130.62, 126.68, 123.24, 121.63, 120.40, 120.18, 108.36, 105.39, 102.05, 74.21, 57.01, 55.29, 31.23, 29.43, 28.99, 28.78, 28.64, 26.31, 25.22, 22.03, 13.87; ESI-MS m/z: 546 [M-Br]+。
9-O-十八烷基小檗碱(B5)
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9.75 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.19 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 4.95 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.23 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 1.83-1.92 (m, 2H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.39-1.25 (m, 28H), 0.86 (t, J = 4.9 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 150.37, 149.80, 147.66, 145.22, 142.87, 137.44, 133.03, 130.63, 126.70, 123.26, 121.65, 120.40, 120.18, 108.37, 105.39, 102.04, 74.22, 57.01, 55.30, 31.21, 29.41, 28.95, 28.75, 28.62, 26.31, 25.21, 22.01, 13.87; ESI-MS m/z: 574 [M-Br]+。
9-O-苄基小檗碱(B6)1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9.73 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.21 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.38 (dt, J = 8.5, 5.1 Hz, 3H), 7.08 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.21 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 150.66, 149.78, 147.63, 145.24, 141.95, 137.30, 136.40, 132.89, 130.57, 128.75, 128.37, 128.31, 126.49, 123.71, 121.77, 120.32, 120.15, 108.36, 105.39, 102.04, 75.32, 57.03, 55.33, 26.31; ESI-MS m/z: 412 [M-Br]+。
9-O-十烷基小檗碱(B12)1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.74 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.16 (s, 2H), 4.94 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.26 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 1.91 – 1.81 (m, 2H), 1.45 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.24 (s, 12H), 0.84 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 150.34, 149.72, 147.59, 145.23, 142.82, 137.32, 132.99, 130.57, 126.57, 123.27, 121.59, 120.38, 120.19, 108.33, 105.39, 102.03, 74.21, 56.99, 55.24, 31.26, 29.45, 28.96, 28.81, 28.67, 26.29, 25.23, 22.05, 13.90; ESI-MS m/z: 462 [M-Br]+。
 2. 小檗碱衍生物的功能验证
2.1 细胞培养
C6和U87胶质瘤细胞培养于10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基,在5% CO2、37 ℃的条件下培养。每隔48 h换培养液,传代培养。
法检测细胞的生存率
设对照组及5个不同浓度药物组,每组3个复孔。取对数生长期的C6细胞消化、计数,按细胞数10000/孔接种于96孔板,培养于37 ℃、5% CO2培养箱24 h后,加入不同浓度的药物溶液。继续培养24 h、48 h、72 h后,每孔加入四唑盐溶液 (MTT, 5 mg/mL) 20 μL继续培养4 h,吸弃上清液,每孔加入DMSO 100 μL,振摇10 min,酶标仪上测定570 nm的吸光度(A)。细胞存活率(%)=A药物组/A对照组×100%。结果如图1和图2所示。由图1可见,小檗碱及其衍生物对C6细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,不同浓度组(0、5、10、20、40 μM)之间细胞存活率差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,小檗碱在浓度大于20 μM时呈现明显的增殖抑制作用(P<0.05)。小檗碱衍生物(B3, B4, B5和B6)对细胞增殖的抑制作用较小檗碱显著(P<0.05)。其中,B3的增殖抑制作用最强,5 μM即对细胞的增殖活性产生明显影响,且各浓度的细胞生存率均明显低于小檗碱及其他衍生物(P<0.05)。图2为不同浓度的B3, B4, B5和B6作用于C6细胞24 h、48 h及72 h后细胞生存率的变化。小檗碱衍生物对C6细胞增殖的抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性(P<0.05)。
细胞划痕试验
取对数生长期的C6细胞并接种于6孔板,置于培养箱,待细胞长满单层约90%后,用灭菌的20 mL枪头均匀地做细胞划痕,磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)冲洗细胞碎片3次,更换为无血清培养液,设对照组和药物组,药物组培养液含药物浓度为5 mmol/L。24 h后用倒置显微镜(×40)观察细胞的迁移程度并拍照。用Image J2x (2.1.4.7版)软件测量细胞迁移距离。按照细胞相对迁移距离=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%,计算各组的相对迁移距离,然后以对照组的相对迁移距离为100%,计算药物组的相对迁移率。结果如图3所示。图3 A显示,对照组及小檗碱组的细胞划痕于24 h后几乎被迁移过来的细胞所覆盖,覆盖面积达90%以上;而各衍生物组的划痕区域仍明显可见。比较各组间的相对迁移率(图3 B),药物组与对照组间有显著性差异,而衍生物对迁移的抑制作用明显强于原料药小檗碱(P<0.05)。其中,B3对C6细胞的迁移抑制作用最强,相对迁移率(13.75%±4.86%)明显低于其他衍生物组(P<0.05)。B4组的相对迁移率为23.56%±8.67%,对细胞迁移的抑制作用仅次于B3,而强于B5和B6(相对迁移率分别为35.46%±2.33%和46.89%±10.56%)。
迁移试验
胰蛋白酶消化并收集细胞,含10% FBS的DMEM培养液洗涤3次,无血清的DMEM培养液重悬(细胞数 2.5×105/mL)。均匀加入100 μL细胞悬液至上室,同时加入适宜浓度的药物溶液;下室加入含10% FBS的DMEM培养液600 μL。同时,用同样细胞数的96孔板进行MTT实验以检测细胞数量变化。37℃,5% CO2培养24 h后,取出上室,用棉签擦去上室细胞,4%多聚甲醛固定30 min, 0.2%结晶紫染液染色10 min,蒸馏水洗三遍,显微镜(×200)下随机选取9个视野摄片并计数;每组平行设3个小孔,实验重复3次。最终,细胞的迁移能力用迁移率评价,迁移率=迁移细胞数/等浓度下MTT总细胞数×100%。各组迁移率与对照组迁移率的比值即相对迁移率。结果如图4所示。图4A显示,B3与B4组迁移至下室的细胞数最少(P<0.001)。
侵袭试验
Matrigel (BS Biosciences) 5 mL置于4 ℃过夜解冻,用4 ℃预冷的无血清DMEM培养液按照DMEM:Matrigel=3:1稀释,取稀释的Matrigel 50 μL加入预冷的Transwell上室,37 ℃温育4 h使凝胶形成。以下操作同2.4所述(上室接种细胞量为5×105 /100 μL)。最终,细胞的侵袭能力用侵袭率评价,侵袭率=侵袭细胞数/等浓度下MTT总细胞数×100%。各组侵袭率与对照组侵袭率的比值即相对侵袭率。
结果如图5所示。经药物处理后,C6细胞穿过重组人工基底膜的细胞数明显少于对照组,侵袭能力受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中,B3与B4(相对侵袭率分别为40.78%±3.72%和20.36%±5.84%)对侵袭的抑制作用明显强于原料药小檗碱(相对迁移率为56.17%±4.00%)。
以上数据均应用SPSS 13.0统计学软件分析。均值检验采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
强迁移与侵袭能力是制约恶性胶质瘤患者获得长生存期的关键因素。然而,目前的大量细胞毒性药物不仅不能有效地抑制胶质瘤的迁移与侵袭,相反耐药性、骨髓抑制效应限制了其临床应用。发明人发现本发明提供的小檗碱亲脂性衍生物,增加小檗碱的亲脂性的同时可增强其对C6胶质瘤细胞的增殖、迁移与侵袭的抑制作用。
3. 小檗碱衍生物的线粒体靶向性
取对数生长期的C6及U87细胞,以4×105个/皿接种在激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿中培养24h。除去培养基,分别加入含1μM的小檗碱,9-O-十二烷基小檗碱或9-O-十六烷基小檗碱的培养液,孵育24h。吸去上清液,PBS(pH 7.4)洗涤三次,用Mitotracker Green FM (500nM)染色30min,冰冷PBS洗涤三次,激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
在激光共聚焦下观察到,在C6(图6 A)和U87(图6 B)胶质瘤细胞中小檗碱及其亲脂性衍生物能选择性聚集于线粒体。C6和U87胶质瘤细胞的线粒体通过mitotracker green进行染色定位(呈绿色),且在小檗碱及其衍生物(呈黄色)孵育24小时后进行激光共聚焦观察。在所有叠加图(combined)中显示,黄色与绿色有很好的亚细胞共定位,叠加后显示为黄绿色。
在C6细胞中,小檗碱较为均匀地分布在整个细胞中(包括细胞质和细胞核),荧光强度较弱,显示了较弱的线粒体靶向性。比较而言,小檗碱衍生物B3和B4荧光分布与mitotracker绿色荧光基本上完全重合,在细胞核部分基本没有荧光,显示了较小檗碱更强的线粒体靶向性。在U87细胞中, B3和B4不仅准确地定位到细胞线粒体中,且荧光强度较强,表明其大量地分布到了线粒体,显示了比在C6细胞中更强的线粒体靶向性。

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1、(10)申请公布号 CN 104208061 A (43)申请公布日 2014.12.17 CN 104208061 A (21)申请号 201310218544.0 (22)申请日 2013.06.04 A61K 31/4375(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路 135 号 (72)发明人 胡海燕 付胜楠 庹珏 谢彦奇 张国光 王亚龙 朱文博 颜光美 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 倪小敏 (54) 发明名称 小檗碱衍生物的医药用途 (57) 摘要 本发明提供。

2、式 (I) 的化合物或其盐在制备治 疗恶性胶质瘤药物或线粒体靶向给药系统中方面 的应用 : 式 (I) , 其中, R 为 C10-C18烷基, 或者 R 为苄基。本发明通 过实验发现, 与对照相比, 本发明的小檗碱衍生物 不仅能更有效地抑制胶质瘤细胞的增殖, 更能同 时有效地抑制细胞的迁移与侵袭能力。 此外, 这些 化合物能够很好地定位到线粒体中, 因此能够作 为线粒体靶向给药系统。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104208。

3、061 A CN 104208061 A 1/1 页 2 1. 式 (I) 的化合物或其盐在制备治疗恶性胶质瘤药物或线粒体靶向给药系统中的应 用 : 式 (I) , 其中, R 为 C10-C18烷基, 或者苄基。 2. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, R 为 C10-C18正烷基。 3. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, R 为 C12-C16正烷基。 4. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, R 为正十二烷基或正十六烷基。 5. 根据权利要求 1 至 4 任何一项所述的应用, 其中所述盐选自氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 氢 氟酸盐、 盐酸盐、 硫酸盐、 硝酸盐、 磷酸盐、 柠檬。

4、酸盐、 醋酸盐和乳酸盐。 6. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, 所述化合物选自 : 9-O- 正十烷基小檗碱, 9-O- 正 十二烷基小檗碱, 9-O- 正十六烷基小檗碱, 9-O- 正十八烷基小檗碱, 和 9-O- 苄基小檗碱。 7. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, 所述药物包含至少一种额外的对治疗恶性胶质 瘤有效的成分。 8. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, 所述药物包含药用赋形剂。 9. 根据权利要求 1 所述的应用, 其中, 所述线粒体靶向给药系统包含至少一种额外的 药物成分。 权 利 要 求 书 CN 104208061 A 2 1/7 页 3 小檗碱衍生物的。

5、医药用途 技术领域 0001 本发明涉及小檗碱衍生物的新用途, 特别是 C9-O 取代的长链烷基或苄基的衍生 物在治疗恶性胶质瘤方面的新用途。 背景技术 0002 恶性胶质瘤 (Malignant Glioma) 是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤, 发病 率占颅内肿瘤的 46%。手术是首选的治疗方法, 但由于其呈浸润性生长, 与正常脑组织无明 显界限, 手术难以切除, 术后复发率高达 96%。即使辅以放疗和化疗, 术后平均生存期也不 超过 14 个月, 预后极差。恶性胶质瘤的不可治愈性与其强迁移和侵袭能力密切相关。因 此, 抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭对恶性胶质瘤的治疗极为关键。 然而, 现。

6、存治疗手段并不 能有效地抑制恶性胶质瘤的迁移与侵袭, 导致治疗效果不佳, 并且还存在神经毒性、 血液毒 性、 耐药性等诸多缺陷。 0003 此外, 包括肿瘤在内, 多种疾病的病理过程与线粒体损伤有关。 肿瘤细胞与正常细 胞的线粒体在结构和功能上存在较大差异, 与线粒体直接相关的细胞内生化事件的异常, 例如糖代谢模式的改变、 ATP 生成障碍、 钙离子蓄积、 氧化应激等在不同程度的功能失调都 是肿瘤发生发展的重要原因。同时, 肿瘤细胞中 mtDNA 突变以及过量 ROS 也已经被报道促 进肿瘤细胞转移。这使得将药物靶向于肿瘤细胞的线粒体, 并通过线粒体选择性地作用于 肿瘤细胞成为可能, 这对于靶。

7、向治疗恶性胶质瘤这类高侵袭性的肿瘤具有重要意义。 0004 小檗碱 (Berberine) 是从黄连等传统中药材中提取分离得到的一种异喹啉类生物 碱, 口服安全性高, 长期大量服用无血液、 心血管及肝肾毒性。 研究表明, 小檗碱可以抑制肝 癌、 人舌鳞癌、 黑色素瘤、 乳腺癌、 膀胱癌等的迁移与侵袭, 但未见对胶质瘤迁移与侵袭的影 响的报道。另一方面, 虽然小檗碱具有对某些肿瘤的抑制活性, 但其药效不太理想。 0005 本发明拟在开发一种安全、 有效、 低毒的化疗药物, 该化疗药物能有效抑制恶性胶 质瘤细胞的迁移与侵袭。 发明内容 0006 为解决上述问题, 本发明提供一种针对恶性胶质瘤的新的。

8、治疗方案, 其基于小檗 碱衍生物对恶性胶质瘤细胞的出乎意料的抑制效果而实现。 0007 根据本发明的第一个方面, 本发明提供式 (I) 的化合物或其盐在制备治疗恶性胶 质瘤药物方面的应用 : , 说 明 书 CN 104208061 A 3 2/7 页 4 其中, R 为 C10-C18烷基, 或者 R 为苄基。所述 C10-C18烷基包括 C10-C18正烷基或它们的 异构体。 0008 在优选的实施方式中, R 为 C10-C18正烷基, 例如正十烷基、 正十一烷基、 正十二烷 基、 正十三烷基、 正十四烷基、 正十五烷基、 正十六烷基、 正十七烷基、 正十八烷基。 更优选为 C10-C1。

9、6正烷基。更优选地, R 为 C12-C16正烷基。更优选地, R 为正十二烷基或正十六烷基。 0009 在优选的实施方式中, 所述盐选自氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 氢氟酸盐、 盐酸盐、 硫酸 盐、 硝酸盐、 磷酸盐、 柠檬酸盐、 醋酸盐和乳酸盐, 优选为氢溴酸盐、 盐酸盐或硫酸盐。 0010 根据本发明的优选实施方式, 所述化合物选自 : 9-O- 正十烷基小檗碱, 9-O- 正 十二烷基小檗碱, 9-O- 正十六烷基小檗碱, 9-O- 正十八烷基小檗碱, 和 9-O- 苄基小檗碱。 0011 根据本发明的一个实施方式, 所述药物包含至少一种额外的对治疗恶性胶质瘤有 效的成分, 以与本发明的衍生。

10、物联合使用。 根据本发明的一个实施方式, 所述药物包含药用 赋形剂, 以将所述药物制成合适的剂型。 0012 发明人发现, 9-O 取代的长链烷基或苄基的小檗碱衍生物对于恶性胶质瘤细胞的 生长抑制、 迁移抑制和侵袭抑制出乎意料地好于其他小檗碱衍生物以及小檗碱本身。本发 明通过实验发现, 与对照相比, 小檗碱衍生物不仅能更有效地抑制胶质瘤 C6 细胞的增殖, 更能同时有效地抑制细胞的迁移与侵袭能力。 可能的原因在于, 当亲脂性基团 (长链烷基或 苄基) 与母体药物小檗碱以醚键结合时, 提高了化合物的脂溶性, 通过提高跨膜转运, 而将 化合物有效地透过生物膜运送到病变部位及细胞内, 从而增强了药效。

11、。 0013 根据本发明的第二个方面, 本发明提供式 (I) 的化合物或其盐在制备线粒体靶向 给药系统中的应用 : , R 为 C10-C18烷基或苄基。所述 C10-C18烷基包括 C10-C18正烷基或它们的异构体。 0014 在优选的实施方式中, R 为 C10-C18正烷基, 例如正十烷基、 正十一烷基、 正十二烷 基、 正十三烷基、 正十四烷基、 正十五烷基、 正十六烷基、 正十七烷基、 正十八烷基。 更优选为 C10-C16正烷基。更优选地, R 为 C12-C16正烷基。更优选地, R 为正十二烷基或正十六烷基。 0015 根据本发明的优选实施方式, 所述化合物选自 : 9-O-。

12、 十烷基小檗碱, 9-O- 十二烷 基小檗碱, 9-O- 十六烷基小檗碱, 9-O- 十八烷基小檗碱, 和 9-O- 苄基小檗碱。 0016 在优选的实施方式中, 所述盐选自氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 氢氟酸盐、 盐酸盐、 硫酸 盐、 硝酸盐、 磷酸盐、 柠檬酸盐、 醋酸盐和乳酸盐, 优选为氢溴酸盐、 盐酸盐或硫酸盐。 0017 所述线粒体靶向给药系统包含至少一种额外的药物成分, 该药物成分通常自身难 以进入线粒体, 并且与本发明的衍生物不发生有害相互作用。该额外的药物成分在本发明 的衍生物的作用下可被定位到线粒体中, 从而发挥作用。 0018 根据本发明的第三个方面, 本发明提供一种治疗恶性胶质。

13、瘤的方法, 该方法包括 将治疗有效量的式 (I) 的化合物或其盐施用至有此需要的患者。 说 明 书 CN 104208061 A 4 3/7 页 5 0019 在本发明中, C10-C18烷基是指具有 10 至 18 个碳原子的直链或支链烷基, 类似地, C12-C16烷基是指具有 12 至 16 个碳原子的直链或支链烷基。 附图说明 0020 图1显示不同浓度的小檗碱及其衍生物作用于C6细胞24 h后细胞生存率的变化。 0021 图 2 显示不同浓度的小檗碱衍生物作用于 C6 细胞 24 h、 48 h 及 72 h 后细胞生存 率的变化,(A) 衍生物 9-O- 十二烷基小檗碱, 简称 B。

14、3, (B) 衍生物 9-O- 十六烷基小檗碱, 简 称 B4, (C) 衍生物 9-O- 十八烷基小檗碱, 简称 B5, (D) 衍生物 9-O- 苄基小檗碱, 简称 B6。 0022 图 3 显示了小檗碱及其衍生物 C6 细胞划痕实验结果, (A) 对照组、 小檗碱组及小 檗碱衍生物组的细胞划痕在 0h 和 24 h 后的细胞迁移情况, (B) 各组间的相对迁移率比较, 与对照比较, * 表示 P 0.05 ; * 表示 P 0.01 ; * 表示 P 0.001。B3 代表 9-O- 十二烷基 小檗碱 ; B4 代表 9-O- 十六烷基小檗碱 ; B5 代表 9-O- 十八烷基小檗碱 ;。

15、 B6 代表 9-O- 苄基小 檗碱。 0023 图 4 显示了小檗碱及其衍生物 C6 细胞 Transwell 迁移实验结果, (A) 对照组、 小 檗碱组及小檗碱衍生物组的细胞迁移情况, (B) 各组间的相对迁移率比较, 与对照比较, * 表示 P 0.05 ; * 表示 P 0.01 ; * 表示 P 0.001。B3 代表 9-O- 十二烷基小檗碱 ; B4 代 表 9-O- 十六烷基小檗碱 ; B5 代表 9-O- 十八烷基小檗碱 ; B6 代表 9-O- 苄基小檗碱 。 0024 图 5 显示了小檗碱及其衍生物 C6 细胞 Transwell 侵袭实验结果, (A) 对照组、 小 。

16、檗碱组及小檗碱衍生物组对细胞的侵袭抑制情况 ; (B) 各组间的相对迁移率比较, 与对照 比较, * 表示 P 0.05 ; * 表示 P 0.01 ; * 表示 P 0.001。B3 代表 9-O- 十二烷基小檗 碱 ; B4代表9-O-十六烷基小檗碱 ; B5代表9-O-十八烷基小檗碱 ; B6代表9-O-苄基小檗碱 。 0025 图 6 为小檗碱亲脂性衍生物在 C6(A) 和 U87(B) 胶质瘤细胞内的线粒体定位的激 光共聚焦观察结果。mitotracker 表示 mitotracker green 标记的线粒体, 呈绿色荧光 ; 药 物表示小檗碱及其亲脂性衍生物 , 呈黄色荧光 ; 。

17、叠加表示以上两个图像的叠加。B3 代表 9-O- 十二烷基小檗碱 ; B4 代表 9-O- 十六烷基小檗碱。 具体实施方式 0026 小檗碱衍生物的合成与鉴定 盐酸小檗碱购于西安小草植物科技有限公司, 纯度 97% ; 溴代十二烷、 溴代十六烷、 溴 代十八烷、 溴化苄均为分析纯, 购于阿拉丁试剂有限公司 ; N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 为分 析纯, 用分子筛干燥处理, 购于天津富宇精细化工有限公司 ; 层析用中性氧化铝为国药集团 产品 ; DMEM 培养基 (R10-013-cv) 、 胎牛血清 (FBS) 、 胰蛋白酶、 青霉素及链霉素均购于美国 cellgro 公司 ; 四甲基。

18、偶氮唑盐 (MTT) 及二甲基亚砜 (DMSO) 均购于美国 Sigma 公司 ; 4% 多 聚甲醛购于广州晶欣科技有限公司 ; 实验用水为超纯水。大鼠胶质瘤 C6 细胞、 人胶质瘤 U87 细胞来自美国 ATCC 细胞库。Millicell Cell Culture Inserts(8.0 m PET) 为美 国 Millipore 公司产品。Avance 400MHz 核磁共振谱仪为美国 Bruker 公司产品 ; 超高效 液相色谱串联质谱仪 UPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access Max) 为美国 Thermo scientific 产品 ; 高速冷冻离心机 (LEG。

19、END MICRO 17R) 为美国 Thermo scientific 公司产品 ; 酶标 仪 (Microplate Reader)为美国 BIO-RAD 公司产品 ; 倒置研究级显微镜 (IX 71) 为日本 说 明 书 CN 104208061 A 5 4/7 页 6 OLYMPUS 公司产品 ; 水套式 CO2培养箱 (HEPA class100) 为美国 Thermo scientific 公司产 品。 0027 本发明小檗碱衍生物的一个示例性合成路线如下 : 1.1 小檗红碱 (Berberrubine, B2) 的合成与鉴定 采用高温裂解法合成中间体 B2。 0028 取干燥的。

20、盐酸小檗碱 10 g (0.0269 mol) , 在 N2保护下 190高温裂解 5 h。冷却 至室温, 丙酮50 mL清洗, 得红色晶体7.48 g, 产率87%。 1H NMR (400 MHz, CD 3OD) : 9.22 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.02 (s, 2H), 4.52-4.62 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.05-3.14 (t, J = 6.3。

21、 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) : 151.11, 150.85, 149.47, 147.31, 135.54, 133.74, 130.66, 124.21, 122.90, 121.71, 119.63, 109.20, 108.17, 105.81, 103.25, 56.79, 55.53, 28.96; ESI-MS m/z: 322 M+H+。 0029 小檗碱衍生物 B3, B4, B5, B6 和 B12 的合成与鉴定 将 B2 与相应溴代物反应分别得到 B3, B4, B5, B6 和 B12。 0030 取 B2 0.32 g(1 m。

22、mol) 溶于 5 mL DMF 中, 在 N2保护下, 80 与 4 mmol 相应溴 代物反应 2h24h, 过滤, 取沉淀, 干法上样, 中性氧化铝柱纯化 (氯仿 - 甲醇 200 100:1) , 分别得黄色结晶 B3, B4, , B5, B6 和 B12。产率 70%80%。 0031 9-O- 十二烷基小檗碱 (B3) 1H NMR (400 MHz, DMSO) : 9.76 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.19 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s, 1H),。

23、 6.17 (s, 2H), 4.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.24 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.81-1.94 (m, 2H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.39-1.22 (m, 16H), 0.85 (t, J = 6.7 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) : 150.34, 149.76, 147.62, 145.20, 142.84, 137.36, 133.01, 130.58, 126.62, 123.26, 121。

24、.61, 120.37, 120.16, 108.35, 105.38, 102.03, 74.22, 57.00, 55.30, 31.23, 29.43, 28.97, 28.77, 28.65, 26.30, 25.21, 22.03, 13.87; ESI-MS m/z: 490 M-Br+。 0032 9-O-十六烷基小檗碱 (B4) 1H NMR (400 MHz, DMSO) : 9.75 (s, 1H) 8.94 (s, 1H), 8.20 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s,。

25、 1H), 6.18 (s, 2H), 4.95 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.29 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.05 说 明 书 CN 104208061 A 6 5/7 页 7 (s, 3H), 3.23 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.87-1.96 (m, 2H), 1.48-1.58 (m, 2H), 1.24 (s, 24 H), 0.85 (t, J = 3.4 Hz, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO) : 150.36, 149.78, 147.65, 145.23, 142.86, 137.40, 133.。

26、02, 130.62, 126.68, 123.24, 121.63, 120.40, 120.18, 108.36, 105.39, 102.05, 74.21, 57.01, 55.29, 31.23, 29.43, 28.99, 28.78, 28.64, 26.31, 25.22, 22.03, 13.87; ESI-MS m/z: 546 M-Br+。 0033 9-O- 十八烷基小檗碱 (B5) 1H NMR (400 MHz, DMSO) : 9.75 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.19 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 9.。

27、0 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 4.95 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.23 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 1.83-1.92 (m, 2H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.39-1.25 (m, 28H), 0.86 (t, J = 4.9 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) : 150.37, 149.80, 147.66, 145.22, 142.87, 137.4。

28、4, 133.03, 130.63, 126.70, 123.26, 121.65, 120.40, 120.18, 108.37, 105.39, 102.04, 74.22, 57.01, 55.30, 31.21, 29.41, 28.95, 28.75, 28.62, 26.31, 25.21, 22.01, 13.87; ESI-MS m/z: 574 M-Br+。 0034 9-O- 苄基小檗碱 (B6) 1H NMR (400 MHz, DMSO) : 9.73 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.21 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.00 (d, J。

29、 = 9.0 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.38 (dt, J = 8.5, 5.1 Hz, 3H), 7.08 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.21 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) : 150.66, 149.78, 147.63, 145.24, 141.95, 137.30, 136.40, 132.89, 130.57, 128.75。

30、, 128.37, 128.31, 126.49, 123.71, 121.77, 120.32, 120.15, 108.36, 105.39, 102.04, 75.32, 57.03, 55.33, 26.31; ESI-MS m/ z: 412 M-Br+。 0035 9-O- 十烷基小檗碱 (B12) 1H NMR (400 MHz, DMSO) 9.74 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.16 (s, 2H)。

31、, 4.94 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.26 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 1.91 1.81 (m, 2H), 1.45 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.24 (s, 12H), 0.84 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) : 150.34, 149.72, 147.59, 145.23, 142.82, 137.32, 132.99, 130.57, 126.57, 123.27, 121.59, 120.38, 120.19, 10。

32、8.33, 105.39, 102.03, 74.21, 56.99, 55.24, 31.26, 29.45, 28.96, 28.81, 28.67, 26.29, 25.23, 22.05, 13.90; ESI-MS m/z: 462 M-Br+。 0036 2. 小檗碱衍生物的功能验证 2.1 细胞培养 C6 和 U87 胶质瘤细胞培养于 10胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 高糖培养基, 在 5 CO2、 37 的条件下培养。每隔 48 h 换培养液, 传代培养。 0037 法检测细胞的生存率 设对照组及 5 个不同浓度药物组, 每组 3 个复孔。取对数生长期的 C6 细胞消化、。

33、 计数, 按细胞数 10000/ 孔接种于 96 孔板, 培养于 37 、 5% CO2培养箱 24 h 后, 加入不同浓度的 药物溶液。 继续培养24 h、 48 h、 72 h后, 每孔加入四唑盐溶液 (MTT, 5 mg/mL) 20 L继 续培养 4 h, 吸弃上清液, 每孔加入 DMSO 100 L, 振摇 10 min, 酶标仪上测定 570 nm 的吸 说 明 书 CN 104208061 A 7 6/7 页 8 光度 (A)。细胞存活率 () A药物组 A对照组100。结果如图 1 和图 2 所示。由图 1 可 见, 小檗碱及其衍生物对 C6 细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性, 。

34、不同浓度组 (0、 5、 10、 20、 40 M) 之间细胞存活率差异具有统计学意义(P0.05)。 与对照组相比, 小檗碱在浓度大于 20 M 时呈现明显的增殖抑制作用 (P0.05) 。小檗碱衍生物 (B3, B4, B5 和 B6) 对细胞增 殖的抑制作用较小檗碱显著 (P0.05) 。 其中, B3的增殖抑制作用最强, 5 M即对细胞的增 殖活性产生明显影响, 且各浓度的细胞生存率均明显低于小檗碱及其他衍生物 (P0.05) 。 图 2 为不同浓度的 B3, B4, B5 和 B6 作用于 C6 细胞 24 h、 48 h 及 72 h 后细胞生存率的变 化。小檗碱衍生物对 C6 细。

35、胞增殖的抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性 (P0.05) 。 0038 细胞划痕试验 取对数生长期的 C6 细胞并接种于 6 孔板, 置于培养箱, 待细胞长满单层约 90% 后, 用灭 菌的20 mL枪头均匀地做细胞划痕, 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)冲 洗细胞碎片 3 次, 更换为无血清培养液, 设对照组和药物组, 药物组培养液含药物浓度为 5 mmol/L。 24 h后用倒置显微镜 (40) 观察细胞的迁移程度并拍照。 用Image J2x (2.1.4.7 版 ) 软件测量细胞迁移距离。按照细胞相对迁移距离 =(0 h 划痕宽度 -24 h。

36、 划痕宽度) /0 h 划痕宽度 100%, 计算各组的相对迁移距离, 然后以对照组的相对迁移距离为 100%, 计算药物组的相对迁移率。结果如图 3 所示。图 3 A 显示, 对照组及小檗碱组的细胞划痕 于 24 h 后几乎被迁移过来的细胞所覆盖, 覆盖面积达 90% 以上 ; 而各衍生物组的划痕区域 仍明显可见。比较各组间的相对迁移率 (图 3 B) , 药物组与对照组间有显著性差异, 而衍生 物对迁移的抑制作用明显强于原料药小檗碱 (P0.05) 。其中, B3 对 C6 细胞的迁移抑制作 用最强, 相对迁移率 (13.75%4.86%) 明显低于其他衍生物组 (P0.05) 。B4 组。

37、的相对迁移 率为 23.56%8.67%, 对细胞迁移的抑制作用仅次于 B3, 而强于 B5 和 B6(相对迁移率分别 为 35.46%2.33% 和 46.89%10.56%) 。 0039 迁移试验 胰蛋白酶消化并收集细胞, 含 10% FBS 的 DMEM 培养液洗涤 3 次, 无血清的 DMEM 培养液 重悬 (细胞数 2.5105/mL) 。均匀加入 100 L 细胞悬液至上室, 同时加入适宜浓度的药 物溶液 ; 下室加入含 10% FBS 的 DMEM 培养液 600 L。同时, 用同样细胞数的 96 孔板进行 MTT实验以检测细胞数量变化。 37, 5% CO2培养24 h后, 。

38、取出上室, 用棉签擦去上室细胞, 4% 多聚甲醛固定 30 min, 0.2% 结晶紫染液染色 10 min, 蒸馏水洗三遍, 显微镜 (200) 下 随机选取 9 个视野摄片并计数 ; 每组平行设 3 个小孔, 实验重复 3 次。最终, 细胞的迁移能 力用迁移率评价, 迁移率 = 迁移细胞数 / 等浓度下 MTT 总细胞数 100%。各组迁移率与对 照组迁移率的比值即相对迁移率。结果如图 4 所示。图 4A 显示, B3 与 B4 组迁移至下室的 细胞数最少 (P0.001) 。 0040 侵袭试验 Matrigel (BS Biosciences) 5 mL 置于 4 过夜解冻, 用 4 。

39、预冷的无血清 DMEM 培养液按照 DMEM : Matrigel=3:1 稀释, 取稀释的 Matrigel 50 L 加入预冷的 Transwell 上室, 37 温育 4 h 使凝胶形成。以下操作同 2.4 所述 (上室接种细胞量为 5105 /100 L)。最终, 细胞的侵袭能力用侵袭率评价, 侵袭率 = 侵袭细胞数 / 等浓度下 MTT 总细胞 数 100%。各组侵袭率与对照组侵袭率的比值即相对侵袭率。 0041 结果如图 5 所示。经药物处理后, C6 细胞穿过重组人工基底膜的细胞数明显少于 说 明 书 CN 104208061 A 8 7/7 页 9 对照组, 侵袭能力受到抑制,。

40、 差异具有统计学意义 (P0.05) 。其中, B3 与 B4 (相对侵袭率分 别为 40.78%3.72% 和 20.36%5.84%) 对侵袭的抑制作用明显强于原料药小檗碱 (相对迁 移率为 56.17%4.00%) 。 0042 以上数据均应用 SPSS 13.0 统计学软件分析。均值检验采用方差分析,P 0.05 为差异有统计学意义。 0043 强迁移与侵袭能力是制约恶性胶质瘤患者获得长生存期的关键因素。然而, 目前 的大量细胞毒性药物不仅不能有效地抑制胶质瘤的迁移与侵袭, 相反耐药性、 骨髓抑制效 应限制了其临床应用。发明人发现本发明提供的小檗碱亲脂性衍生物, 增加小檗碱的亲脂 性的。

41、同时可增强其对 C6 胶质瘤细胞的增殖、 迁移与侵袭的抑制作用。 0044 3. 小檗碱衍生物的线粒体靶向性 取对数生长期的 C6 及 U87 细胞, 以 4105个 / 皿接种在激光共聚焦显微镜专用玻 底培养皿中培养 24h。除去培养基, 分别加入含 1M 的小檗碱, 9-O- 十二烷基小檗碱 或 9-O- 十六烷基小檗碱的培养液, 孵育 24h。吸去上清液, PBS(pH 7.4) 洗涤三次, 用 Mitotracker Green FM (500nM)染色30min, 冰冷PBS洗涤三次, 激光共聚焦显微镜下观察 并拍照。 0045 在激光共聚焦下观察到, 在 C6( 图 6 A) 和 。

42、U87( 图 6 B) 胶质瘤细胞中小檗碱及其 亲脂性衍生物能选择性聚集于线粒体。C6 和 U87 胶质瘤细胞的线粒体通过 mitotracker green 进行染色定位 (呈绿色) , 且在小檗碱及其衍生物 (呈黄色) 孵育 24 小时后进行激光共 聚焦观察。在所有叠加图 (combined) 中显示 , 黄色与绿色有很好的亚细胞共定位, 叠加后 显示为黄绿色。 0046 在 C6 细胞中, 小檗碱较为均匀地分布在整个细胞中 (包括细胞质和细胞核) , 荧 光强度较弱, 显示了较弱的线粒体靶向性。比较而言, 小檗碱衍生物 B3 和 B4 荧光分布与 mitotracker 绿色荧光基本上完。

43、全重合, 在细胞核部分基本没有荧光, 显示了较小檗碱更强 的线粒体靶向性。在 U87 细胞中 , B3 和 B4 不仅准确地定位到细胞线粒体中, 且荧光强度 较强, 表明其大量地分布到了线粒体, 显示了比在 C6 细胞中更强的线粒体靶向性。 说 明 书 CN 104208061 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104208061 A 10 2/4 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 104208061 A 11 3/4 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 104208061 A 12 4/4 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104208061 A 13 。

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