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1、(10)申请公布号 CN 103396985 A (43)申请公布日 2013.11.20 CN 103396985 A *CN103396985A* (21)申请号 201310342443.4 (22)申请日 2013.08.08 C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 哈尔滨埃文斯干细胞应用技术有限 公司 地址 150025 黑龙江省哈尔滨市利民经济开 发区珠海路 (72)发明人 朱明东 高翔 宋云庆 张小刚 (54) 发明名称 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方 法与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细。
2、胞 分化为肝细胞的方法与应用， 包括肝细胞生长因 子 （HGF） 、 成纤维细胞生长因子 -4 （FGF-4） 和基础 培养基。本发明所述的方法包括如下步骤 ： 选取 第510代的人脐带间充质干细胞， 以5103/cm2 的细胞密度接种于 6 孔培养板中， 过夜培养， 次日 待细胞贴壁， 去除正常生长培养基， 换为肝细胞诱 导分化培养基 （IMDM 培养基中含有 HGF40ng/ml、 FGF-410ng/ml 及 1% 胎牛血清、 100U/ml 青霉素、 100ug/ml链霉素和1g/ml两性霉素） ， 置于37， 5%CO2培养箱中培养 21 天， 每 3 天换液一次。经过 本发明所述方。
3、法的诱导， 人脐带间充质干细胞在 体外可以分化为肝细胞， 为采用细胞替代或者基 因治疗方法治疗多种肝损伤疾病提供了重要的细 胞来源。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103396985 A CN 103396985 A *CN103396985A* 1/1 页 2 1. 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法， 其特征在于所用的培养基含有 肝细胞生长因子 （HGF） 、 成纤维细胞生长因子 -4（FGF-4） 和 IMDM 。
4、基础培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法， 其特征在 于， HGF 的浓度为 40ng/ml， FGF-4 的浓度为 10ng/ml。 3.3、 根据权利要求 1 或 2 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法， 其特 征在于， IMDM 基础培养基中含有 1% 胎牛血清。 4.根据权利要求1或2 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法， 其特征 在于， IMDM 基础培养基中含有 100 U/ml 青霉素、 100 ug/ml 链霉素和 1 g/ml 两性霉素。 5. 根据权利要求 1 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法。
5、， 其特征在 于， 所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面标志分子为通过免疫荧光染色的方法进行检 测， 人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子 CD14、 CD19、 CD34、 CD45 和 HLA-DR， 而强表达 间充质干细胞表面特异性抗原 CD44、 CD73、 CD90 和 CD105。 6. 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 配制诱导培养基 ： 在 IMDM 培养基中添加 40ng/ml 的 HGF、 10ng/ml 的 FGF-4、 1% 的 胎牛血清、 100 U/ml 的青霉素、 100 ug/ml 的链霉素和 1 g/ml 的。
6、两性霉素 ； （2） 选取第 510 代的人脐带间充质干细胞， 以 5103/cm2的细胞密度接种于 6 孔培 养板中， 过夜培养 ； （3） 待细胞贴壁后， 去除正常生长培养基， 换为肝细胞诱导培养基， 置于 37， 5% CO2培 养箱中 ； （4） 每 3 天换液一次， 诱导培养 21 天， 收获诱导后的细胞。 7.一种含有诱导剂HGF和FGF的培养基在诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化中应 用。 权 利 要 求 书 CN 103396985 A 2 1/3 页 3 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种利用诱导剂HGF和FGF联合高效诱导人脐。
7、带间充质干细胞分化为 肝细胞的方法和应用。 背景技术 0002 肝脏疾病是危害全世界人民健康的疾病， 尤其我国是病毒性肝炎的高发区， 由病 毒性肝炎导致的重症肝炎死亡率可达 50%70% 或更高。肝移植是终末期肝病有效的治疗 手段， 虽然劈离式、 活体劈离式等各种肝移植术可以最大限度的利用供肝， 但其操作复杂、 患者需终生免疫， 临床应用受到了极大的限制 ； 并且由于肝源的缺乏， 使得一部分患者在等 待中死亡 ； 而对于肝脏细胞体外分离培养方法、 肝细胞再生及在肝脏损伤修复中的作用都 尚待进一步的阐明。因此， 寻求非肝源干细胞并促进其向肝细胞定向分化是亟待解决的重 要问题。 0003 肝组织工。
8、程的首要问题是寻找来源充足并有稳定的肝特异性功能的种子细胞。 成 熟肝脏细胞具有诸多不足而不能成为满意的细胞来源， 例如， 从肝功能衰竭获取肝脏细胞 难度较大、 异基因肝脏细胞可能产生免疫排斥反应、 体外培养易失去活性与功能等。 在过去 30 年中， 研究者们发现肝干 / 祖细胞不但存在于原前肠胚层而且来源于囊胚内细胞群 ； 既 可自胎儿、 新生儿、 成体肝脏分离出， 也可存在于肝外组织。 0004 近年来， 干细胞疗法成为组织胚胎学、 医学伦理学等方面最为关注的焦点之一， 又 由于成体干细胞可塑性和横向分化的发现， 干细胞临床应用成为当今干细胞组织工程、 再 生医学解决重要疾病的研究方向， 。
9、于是， 人们希望从间充质干细胞中找到解决肝脏疾病的 治疗方案。 0005 高浓度的肝细胞生长因子 （HGF) 可以体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞， 并表 达 ALB、 CK18、 CK8 等。同时， 大鼠和人的多能成体前体细胞在添加有 HGF 或成纤维细胞生长 因子 -4（FGF-4） 的培养基中进行培养， 均可向肝细胞方向分化。 0006 本发明建立了一种新的诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的方法， 联合使用 肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子 -4， 与目前的常用诱导方法相比， 极大的提高了诱 导效率， 有助于为细胞移植治疗肝损伤提供更多更具活性的的种子细胞来源。 发明内容 0007 。
10、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种有效的诱导人脐带 间充质干细胞分化为肝细胞的方法。 0008 本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法 的应用。 0009 为了实现上述发明目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种诱导人脐带间充质干细 胞向肝细胞分化的方法， 包括以下步骤 ： （1） 配制诱导培养基 ： 在 IMDM 培养基中添加 40ng/ml 的 HGF、 10ng/ml 的 FGF-4、 1% 的 说 明 书 CN 103396985 A 3 2/3 页 4 胎牛血清、 100 U/ml 的青霉素、 100 ug/ml 的链霉素和 1 g。
11、/ml 的两性霉素 ； （2） 选取第 510 代的人脐带间充质干细胞， 以 5103/cm2的细胞密度接种于 6 孔培 养板中， 过夜培养 ； （3） 待细胞贴壁后， 去除正常生长培养基， 换为肝细胞诱导培养基， 置于 37， 5% CO2培 养箱中 ； （4） 每 3 天换液一次， 诱导培养 21 天， 收获诱导后的细胞。 0010 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： （1） 所用的人脐带间充质干细胞来源于免疫系统尚未发育完善的新生儿脐带， 所以人 脐带间充质干细胞作为组织工程的种子细胞在进行移植后引起免疫排斥机率相对较小， 而 且由于脐带传统上作为医疗废弃物， 所以脐带间充质干。
12、细胞的来源也具有易获得性。 0011 （2） 所用诱导方法同时使用了HGF和FGF-4两种生长因子， 并且优化了组合作用浓 度， 达到了诱导效率的最佳化。本发明是一种高效的将人脐带间充质干细胞诱导分化为肝 细胞的方法， 为治疗肝脏损伤提供了稳定可靠的移植细胞的来源。 附图说明 0012 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0013 图 1 是免疫荧光技术分析肝细胞特异性蛋白的表达， 其中 a、 c、 e 为诱导组， b、 d、 f 为诱导组。 0014 图 2 是 Real-time PCR 分析肝细胞特异性基因 mRNA 的表达。 具体实施方式 0015 一、 人脐带间充质。
13、干细胞制备。 0016 无菌条件下取得人脐带， 6 小时内分离细胞。0.25% 碘伏浸泡 3 min 后， 用生理 盐水洗去表面及血管内血凝块 （尽量完全将血块去除以减少血细胞污染） ， 借助手术镊子将 脐带撕开， 去除血管， 挑取华尔通胶质 （又称脐带基质） ， 剪成12 mm3 大小得组织块， 并均 匀加到 24 孔板里， 用含有 10% (v/v) FBS， 5 ng/ml bFGF， 216 g/ml 谷氨酸盐， 2 mg/ml NaHCO3， 100 U/ml青霉素， 100 g/ml链霉素， 1 g/ml两性霉素B的L-DMEM培养液培养， 混匀板里组织块， 置 CO2 培养箱 （。
14、37， 5% CO2） 中培养。期间不能摇晃培养板。大约 10 天 后， 用倒置显微镜观察细胞， 可见有梭形细胞从组织块中游离出来。待原代细胞长满至 90% 时传代， 先去除 （尽量除尽） 板中组织块， PBS 洗一次， 再用 0.25% 的胰蛋白酶和 EDTA 的混合 消化液于 37培养箱中消化 2 5 min， 倒置显微镜下观察， 见到细胞皱缩， 聚集并开始有 部分悬浮时， 立即加入含有 10% FBS 的 L-DMEM 培养液中止消化， 用移液器将细胞吹打至悬 浮， 转至离心管中， 1054 rpm 离心 5 min， 取沉淀的细胞， 用生长培养液吸打混匀后计数， 以 1 2105 接种。
15、至 25 cm2 的培养瓶中 （从第二代起以 3105 接种） ， 2 3 天换液， 待细胞 长满 95% 时， 照上述方法进行传代。 0017 二、 人脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞。 0018 选取第510代的间充质干细胞， 以5103/cm2的细胞密度接种于6孔或24孔培 养板中， 过夜培养， 次日待细胞贴壁， 弃正常生长培养基， 换为肝细胞方向诱导分化培养基 IMDM 培养基 （即含 1% 胎牛血清、 100 U/ml 青霉素、 100 ug/ml 链霉素、 HGF 40ng/ml、 FGF-4 说 明 书 CN 103396985 A 4 3/3 页 5 10ng/ml 和 1。
16、 g/ml 两性霉素的 IMDM 培养液） 置 37， 5% CO2培养箱中培养 21 天， 每 3 天 换液一次。 0019 三、 免疫荧光技术鉴定肝细胞方向分化。 0020 诱导培养基培养21天后， 0.25胰蛋白酶消化， 分化诱导培养基重悬后以1104/ cm2分化接种于 24 孔培养板中， 置 37， 5% CO2培养箱中过夜培养， 以正常生长培养基中培 养的未分化细胞作为阴性对照。 0021 （1） 次日弃培养基， 500 l PBS 冲洗三次， 4% 多聚甲醛室温固定 15 分钟。 0022 （2） 500 l PBS 再冲洗三次， 0.1% Triton X-100 渗透 10 。
17、分钟。 0023 （3） 500 l PBS 再冲洗三次， 滴加 1% 羊血清于 37 封闭 30 分钟。 0024 （4） 500 lPBS 再冲洗三次， 加鼠抗人单克隆抗体 -fetoprotein (AFP)， albumin (ALB) 和 cytokeratin 18 (CK-18) 于 37孵育 1 小时。 0025 （5） 500 l PBS 再冲洗三次， 加 FITC 或 PE 标记的二抗于 37闭光孵育 1 小时。 0026 （6） 500 l PBS 再冲洗三次， 加 DAPI 于 37反应 5 分钟染细胞核。 0027 （7） 500 l PBS 再冲洗二次， 加 500 l PBS 后细胞置荧光显微镜下观察并拍摄 图片。 0028 四、 Real Time PCR 技术鉴定肝细胞方向分化。 0029 用实时定量聚合酶链式反应 （Real-Time PCR） 技术鉴定， 分为人脐带间充质干细 胞总RNA抽提、 总RNA定量与分析、 总RNA的反转录和实时定量聚合酶链式反应 （Real-Time PCR） 等步骤。 说 明 书 CN 103396985 A 5 1/2 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103396985 A 6 2/2 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 103396985 A 7 。