一种药物甜菜碱缀合物、其药物组合物及应用.pdf

本发明公开了一种药物甜菜碱缀合物、其药物组合物及应用。该药物组合物包括药物甜菜碱缀合物或药物甜菜碱缀合物和药效学上可接受的载体的组合药用组合物，是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂。该药物组合物是药物甜菜碱缀合物或药物甜菜碱缀合物和助剂制成的脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米。该药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂，毒性低，可用于各种肿瘤高效治疗。

权利要求书
1.  一种药物甜菜碱缀合物，其特征在于，该缀合物为下列通式(1)的缀合物，或所述通式(1)的缀合物与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：

式(1)中，L1是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷基氧基烷基中的任一种；L2是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基/羟基亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷氧基烷基中的任一种；R3、R4是氢、甲基或乙基；X是羧基或磺酸基；
所述R1是：a)药物苯丁酸氮芥、苯达莫司丁、美法仑、阿曲生坦、土槿皮乙酸、舒林砜、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、氯尼达明、齐墩果酸、氨蝶呤、甲氨蝶呤、化合物代号为E7974的哈米特林类似物、灵芝酸、化合物代号为TSU-68的血管内皮生长因子受体抑制剂、化合物代号为CPI-613的硫辛酸类似物、化合物代号为AKR501的血小板生成素受体拮抗剂中的任一种，所述R1的羧基通过酯键与式(1)中-CH2或-CH相连。
或者：b)R1具有如下结构：其中，Y是C1-C16的直链或支链的亚烷烃基、C6-C10的环烷烃基、C6-C10的芳烃基、C1-C6的含双硫键的直链亚烷烃基、结构为的取代基中的任一种；Rx是药物喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑立康、7-乙基-10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟喜树碱、六环喜树碱、化合物代号为G7147211的喜树碱类似物、化合物代号为DX-8951f的喜树碱类似物、化合物代号为Bay38-3441的喜树碱类似物、化合物代号为CKD-602的喜树碱类似物、紫杉醇、多烯紫杉醇、化合物代号为Carbazitaxel的紫杉醇类似物、鬼臼毒素、去甲表鬼臼毒素、柔红霉素、多柔比星、米托恩醌、足叶乙苷、长春新碱、长春碱、长春地辛、高三尖杉酯碱、姜黄素、替尼泊苷、甲地孕酮、甲羟孕酮、曲贝替定、夫拉平度、伊沙匹隆、齐多夫定、司他夫定、拉米夫定、氟铁龙、阿糖胞苷、环胞苷、肌苷二醛、二溴甘露醇、沙奎那韦、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、阿糖胞苷、阿糖腺苷、碘苷、生育酚、 生育三烯酚中的任一种，所述Rx的羟基通过酯键与的羰基相连。

2.  根据权利要求1所述的药物甜菜碱缀合物，其特征在于，所述抗衡离子是阳离子氢离子、钠离子、钾离子、钙离子、铁离子、镁离子、铵离子、锌离子、阴离子氯离子、硫酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、羧酸根离子、碳酸根离子、溴离子、磷酸根离子、甲酸根、乙酸根、柠檬酸根、乳酸根、富马酸根、酒石酸根、葡萄糖酸根离子的任一种或任两种的组合。

3.  一种药物组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1或2所述的药物甜菜碱缀合物或所述的药物甜菜碱缀合物与药效学上可接受的载体。

4.  根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。

5.  根据权利要求3或4的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为粒径10-1000纳米的纳米颗粒，该药物组合物中还包括助剂。

6.  根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的助剂是磷脂、胆甾醇的任一种或两种的组合。

7.  权利要求1或2所述药物甜菜碱缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该方法将所述药物甜菜碱缀合物或其在药学上可接受的盐，与药效学上可接受的载体制备成药剂。

说明书一种药物甜菜碱缀合物、其药物组合物及应用
技术领域
本发明涉及一种具有药效或抗肿瘤作用的药物甜菜碱缀合物和其药物组合物与用途，属于医药技术领域。
背景技术
疏水药物的控制释放是药剂学领域的重要课题。口服疏水性药物常出现吸收效率低下，从而影响药效。特别是，许多抗肿瘤药物呈强烈的疏水性，如喜树碱、紫杉醇、芳香类氮芥等，有效给药一直是一个难题。通过有机溶媒可以适当增加疏水性药物溶解性，但有机溶媒的潜在毒性可能导致对病人的伤害。
将疏水性药物进行化学结构改性，提高疏水性药物的亲水性，是最常见的提高药效的途径。许多疏水性药物通过该途径，达到了提高药效，降低毒副作用的目的。
脂质体是一种新型药物制剂，具有靶向给药功能，在抗癌药物控制释放领域具有重要应用。磷脂是构成脂质体的主要化学成分，由甘油磷酸胆碱相连的取代基因构成的亲水头和长烃基链构成的疏水尾组成。当分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡，形成脂质体。由于天然磷脂疏水尾部多含有不饱和键，对脂质体的稳定性造成了很大的影响，因此对磷脂疏水尾部进行结构修饰可以提高其稳定性。脂质体是疏水性药物的重要载体，可以控制药物的释放，并具有一定靶向功能。脂质体作为疏水性药物载体时，疏水性药物通常在脂质体的双脂质层中。但是，由于脂质体膜的流动性，导致药物易于渗漏出来，使包裹的药物难以发挥良好的药效。此外，用磷脂酰胆碱作为亲水头的药物磷脂化合物合成路线复杂。
甜菜碱是一种两性离子，具有优异的亲水性，并是一种细胞内离子浓度的渗透调节剂。亲水性的甜菜碱两性离子与疏水性的烷基或其它基团构建成的分子是一种两亲性分子，在水中可以组装成胶束、微囊或脂质体等，也是一种疏水性药物载体。
显然，利用已有药物的化学结构活性基团，通过结构改性，发现新的药物，以及通过设计新的甜菜碱结构，提高药物甜菜碱脂质体稳定性，提高药物的亲水性，是非常必要的。
本发明利用2分子的原药药物化学结构部分作为疏水尾和甜菜碱两性离子亲水头通过共价键相连，制备药物甜菜碱缀合物，溶解性显著优于原药；本发明将药物甜菜碱缀合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，因为结构对称性好，药物甜菜碱缀合物脂质体稳定优异，具有可形成液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂的特性，用于肿瘤治疗。这种药物甜菜碱缀合物纳米颗粒不仅是一种前药，也是药物全新的药物释放载体，具有靶向功能；本发明的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒也是一种全新的药物的前药，在体内经酯酶水解发挥药效，具有较低的毒副作用。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种提高药物溶解性，具有抗肿瘤作用，能延长药物释放半衰期，并具有较低毒副作用的药物甜菜碱缀合物，同时提供一种基于该药物甜菜碱缀合物的药物组合物，以及该药物甜菜碱缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术方案：本发明的药物甜菜碱缀合物为下列通式(1)的缀合物，或所述通式(1)的缀合物与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：

式(1)中，L1是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷基氧基烷基中的任一种；L2是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基/羟基亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷氧基烷基中的任一种；R3、R4是氢、甲基或乙基；X是羧基或磺酸基。
所述R1是：a)药物苯丁酸氮芥、苯达莫司丁、美法仑、阿曲生坦、土槿皮乙酸、舒林砜、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、氯尼达明、齐墩果酸、氨蝶呤、甲氨蝶呤、化合物代号为E7974的哈米特林hemiasterlin类似物、灵芝酸、化合物代号为TSU-68的血管内皮生长因子受体抑制剂、化合物代号为CPI-613的硫辛酸类似物、化合物代号为AKR501的血小板生成素受体拮抗剂中的任一种，所述R1的羧基通过酯键与式(1)中-CH2或-CH相连。
或者：b)R1具有如下结构：其中，Y是C1-C16的直链或支链的亚烷烃基、C6-C10的环烷烃基、C6-C10的芳烃基、C1-C6的含双硫键的直链亚烷烃基、结构为的取代基中的任一种；Rx是药物喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康(代号为CPT11，联哌喜树碱)、拓扑立康(9-二甲基氨基-10-羟基喜树碱)、7-乙基-10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟喜树碱(化合物代号为BN80915)、六环喜树碱(代号为Lurtotecan)、化合物代号为G7147211的喜树碱类似物、化合物代号为DX-8951f的喜树碱类似物、化合物代号为Bay38-3441的喜树碱类似物、化合物代号为CKD-602的喜树碱类似物、紫杉醇、多烯紫杉醇、代号为Carbazitaxel的紫杉醇类似物、鬼臼毒素、去甲表鬼臼毒素、柔红霉素、多柔比星、米托恩醌、足叶乙苷、长春新碱、长春碱、长春地辛、高三尖杉酯碱、姜黄素、替尼泊苷、甲地孕酮、甲羟孕酮、曲贝替定、夫拉平度、伊沙匹隆、齐多夫定、司他夫定、拉米夫定、氟铁龙、阿糖胞苷、环胞苷、肌苷二醛、二溴甘露醇、沙奎那韦、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、阿糖胞苷、阿糖腺苷、碘苷、生育酚、生育三烯酚中的任一种，所述Rx的羟基通过酯键与的羰基相连。
本发明药物甜菜碱缀合物的优选方案中，抗衡离子是阳离子氢离子、钠离子、钾离子、钙离子、铁离子、镁离子、铵离子、锌离子、阴离子氯离子、硫酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、羧酸根离子、碳酸根离子、溴离子、磷酸根离子、甲酸根、乙酸根、柠檬酸根、乳酸根、富马酸根、酒石酸根、葡萄糖酸根离子的任一种或任两种的组合，优选氢离子、钠离子、氯离子。
本发明的药物组合物，包括上述的药物甜菜碱缀合物或所述的药物甜菜碱缀合物与药效学上可接受的载体。
本发明的药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明药物组合物的优选方案中，药物组合物为粒径10-1000纳米的脂质体纳米 颗粒，该药物组合物中还包括助剂。
本发明药物组合物的上述优选方案中，助剂是磷脂、胆甾醇的一种或两种的组合。
本发明药物组合物的上述优选方案中，助剂是含有靶向基团的磷脂。
本发明的上述药物甜菜碱缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用，将该药物甜菜碱缀合物或其在药学上可接受的盐，与药效学上可接受的载体制备成药剂。
本发明缀合物可以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明缀合物”包括该缀合物的异构体。
本发明缀合物可存在不对称中心具有S构型或R构型，本发明包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。
本发明还涉及含有作为活性成份的本发明缀合物或本发明缀合物和常规药物助剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-100重量％的本发明缀合物。
本发明缀合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明缀合物或本发明缀合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当的施用形式或剂量形式。
由本发明缀合物制成脂质体纳米颗粒，颗粒粒径10-1000纳米。
由本发明缀合物和助剂制成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米，使用的助剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC，二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC，L-α-磷脂酰胆碱-β-花生四烯酰-γ-硬脂酰，二癸酰基甘油-3-磷酸胆碱DDPC，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱DOPC，2-油酰-1-棕榈酰甘油-3-磷酸胆碱POPC，1-硬脂酰-2-油酰甘油-3-磷酸胆碱SOPC，1-硬脂酰-2-棕榈酰甘油-3-磷酸胆碱SPPC，1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱MSPC，1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱PMPC，1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱PSPC，1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱SMPC，1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱MOPC，1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱POPC，1-油酰-2-棕榈酰甘油-3-磷酸胆碱OPPC，1-油酰-2-硬脂酰甘油-3-磷酸胆碱OSPC，1,2-二月桂酰磷脂酰胆碱DLPC，1,2-二花生四烯酰基磷脂酰胆碱DAPC，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰基-甘油-3-磷酸胆碱PMPC，1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰甘油-3-磷酸胆碱MSPC，1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰甘油-3-磷酸胆碱MPPC，1-棕榈酰-2花生四烯酰-甘油-3-磷酸胆碱PAPC，1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油-3-磷酸胆碱SAPC，1-油酰-2-肉豆蔻酰基甘油-3-磷酸胆碱OMPC，1-棕榈酰基-2-硬脂酰甘油-3-磷酸胆碱HSPC，二芥酰基甘油-3-磷酸胆碱DEPC，1,2-二月桂酰磷脂酰乙醇胺,二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇 胺DMPE，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE，二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE，二芥酰基磷脂酰乙醇胺DEPE，1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺DLPE，1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺POPE，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000(聚乙二醇分子量400-3000)，二硬脂酰磷脂酰聚乙二醇单甲醚(聚乙二醇分子量400-3000)或胆固醇中的一种或多种。助剂还含有一种靶向基团叶酸、半乳糖、抗体、生物素或多肽。
本发明的药物组合物脂质体纳米颗粒，是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明的通式(1)的药物甜菜碱缀合物以及这些缀合物所形成的药学上可接受的含有抗衡离子的盐，具有良好的水溶性，具有抗肿瘤作用，能延长药物释放半衰期，并具有较低的毒副作用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明的药物甜菜碱缀合物为通式(1)的缀合物，或通式(1)的缀合物与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐，式(1)结构中含有亲水头部分，使药物甜菜碱缀合物水溶性显著优于原药，具有低毒性和优异的药效或抗肿瘤活性。
式(1)中R1是原药的取代基，通过酯键与甜菜碱亲水头相连，由酯酶等水解该酯键，一分子药物甜菜碱缀合物释放出两个分子原药，从而使药物甜菜碱缀合物的抗肿瘤药效达到原药的2倍或以上；R1的2个取代基具有疏水作用，相互协同，直接构成稳定的脂质体，是脂质体结构的一部分，克服了通用脂质体包裹疏水药物时药物易于泄漏的缺点，同时提高药物包裹的效率。
本发明的药物甜菜碱缀合物水解后还同时释放甜菜碱部分，在机体内发挥细胞渗透调节剂的作用，并可以提供烷基基团用于体内代谢。
本发明的药物甜菜碱缀合物可以采用薄膜法等非常容易地自组装成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米，稳定性好；
本发明的药物甜菜碱缀合物可以与磷脂组成复合体系，采用薄膜法等非常容易地自组装成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米，稳定性好；
本发明的药物甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒的脂质体结构与细胞膜结构具有相似性，易于被细胞吞噬，并释放活性药物分子，发挥药效或抗肿瘤作用；
本发明的药物甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒具有被动靶向作用，而原药均不具备这种特性；
本发明的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒是一种全新的药物释放载体，也是一种前药，具有离子敏感性，通过盐浓度可调节细胞毒性；
本发明的缀合物或本发明的缀合物和常规药物载体的药物组合物，含有0.1-100重量％的本发明缀合物，具有低毒性和优异的抗肿瘤活性；
本发明的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒，可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂，可在水、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等水相体系下形成脂质体；
本发明的药物甜菜碱缀合物脂质体结合含有靶向基团的助剂，具有主动靶向作用；
本发明所涉及式(1)的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒制备工艺简单；
本发明所涉及式(1)的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒也是一种全新的前药，在体内经酯酶水解发挥药效，能延长药物释放半衰期，并具有较低的毒副作用，抗肿瘤作用显著优于原药。
附图说明
图1苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的合成路线
图2苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的HPLC图
图3苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的质谱图
图4苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的氢核磁共振谱图(500MHz,DMSO:CDCl31:1)
图5苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的碳核磁共振图(125MHz,DMSO:CDCl31:1)
图6苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质颗粒体的粒径分布和Zeta电位
图7苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的透射电镜图
图8喜树碱甜菜碱缀合物的合成路线
图9喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物的合成路线
图10紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物的合成路线
图11鬼臼毒素甜菜碱缀合物的合成路线
图12双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物的合成路线
图13全反式维甲酸甜菜碱缀合物的合成路线
图14全反式维甲酸磺酸甜菜碱缀合物的合成路线
图15苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的的细胞毒性图，其中图15(a)为MCF-7细胞，图15(b)为HeLa细胞，图15(c)为HepG-2细胞，数据表示为平均数±SD(n＝6)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的的技术方案做进一步详细说明。
本发明的药物甜菜碱缀合物，为下列通式(1)的缀合物，或所述通式(1)的缀合物与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：

式(1)中，L1是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷基氧基烷基中的任一种；L2是C1-C6的直链或支链的亚烷烃基/羟基亚烷烃基、C1-C6的直链的亚烷氧基烷基中的任一种；R3、R4是氢、甲基或乙基，其中R3与R4可以相同，也可以不同；X是羧基或磺酸基。
所述R1是药物苯丁酸氮芥、苯达莫司丁、美法仑、阿曲生坦、土槿皮乙酸、舒林砜、9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、氯尼达明、E7974、灵芝酸、齐墩果酸、氨蝶呤、甲氨蝶呤、化合物代号为E7974的哈米特林hemiasterlin类似物、灵芝酸、化合物代号为TSU-68的血管内皮生长因子受体抑制剂、化合物代号为CPI-613的硫辛酸类似物、化合物代号为AKR501的血小板生成素受体拮抗剂中的任一种，所述R1的羧基通过酯键与式(1)中-CH2或-CH相连。
或者：b)R1具有如下结构：其中，Y是C1-C16的直链或支链的亚烷烃基、C6-C10的环烷烃基、C6-C10的芳烃基、C1-C6的含双硫键的直链亚烷烃基、结构为的取代基中的任一种；Rx是药物喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康(化合物代号为CPT11，联哌喜树碱)、拓扑立康(9-二甲基氨基-10-羟基喜树碱)、7-乙基-10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树 碱、二氟喜树碱(化合物代号为BN80915)、六环喜树碱(化合物代号为Lurtotecan)、化合物代号为G7147211的喜树碱类似物、化合物代号为DX-8951f的喜树碱类似物、化合物代号为Bay38-3441的喜树碱类似物、化合物代号为CKD-602的喜树碱类似物、鬼臼毒素、去甲表鬼臼毒素、柔红霉素、多柔比星、米托恩醌、足叶乙苷、长春新碱、长春碱、长春地辛、高三尖杉酯碱、姜黄素、替尼泊苷、甲地孕酮、甲羟孕酮、曲贝替定、夫拉平度、伊沙匹隆、齐多夫定、司他夫定、拉米夫定、氟铁龙、阿糖胞苷、环胞苷、肌苷二醛、二溴甘露醇、沙奎那韦、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、阿糖胞苷、阿糖腺苷、碘苷、生育酚、生育三烯酚中的任一种，所述Rx由药物的羟基通过酯键与羰基相连。
抗衡离子可以采用阳离子，也可以采用阴离子，具体选用氢离子、钠离子、钾离子、钙离子、铁离子、镁离子、铵离子、锌离子、氯离子、硫酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、羧酸根离子、碳酸根离子、溴离子、磷酸根离子、甲酸根、乙酸根、柠檬酸根、乳酸根、富马酸根、酒石酸根、葡萄糖酸根离子的任一种或任两种的组合，优选氢离子、钠离子、氯离子。
本发明的药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明的药物组合物，是粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒，由具有通式(1)结构的药物甜菜碱缀合物自组装构成。
由具有通式(1)结构的药物甜菜碱缀合物与磷脂共同自组装构成粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒。
本发明的药物甜菜碱缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用，将所述药物甜菜碱缀合物或其在药学上可接受的盐，与药效学上可接受的载体制备成药剂。可将本发明缀合物或本发明缀合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当的施用形式或剂量形式。通常本发明药物组合物含有0.1-100重量％的本发明缀合物。
本发明缀合物或含有它的药物组合物给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓 剂、冻干粉针剂等。
本发明缀合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明的药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体，例如稀释剂、吸收剂、湿润剂、粘合剂、崩解抑制剂、润滑剂等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明缀合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明缀合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
将本发明缀合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
由本发明缀合物和助剂制成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米，使用的助剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱等磷脂或胆固醇中的一种或多种。助剂还含有一种靶向基团叶酸、半乳糖、抗体、生物素或多肽。
从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明缀合物表现良好的抗肿瘤活性。试验表明本发明缀合物的体内毒性，小于原药。因此可作为抗肿瘤药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。
从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明缀合物脂质体纳米颗粒表现良好的抗肿瘤活性。试验表明本发明缀合物的体内毒性远小于原药。因此可作为抗肿瘤药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。
本发明的药物甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒的制备方法，是由本发明缀合物药物甜菜碱缀合物或本发明缀合物与助剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法、或高压均质法等方法制备。
本发明利用2分子的疏水性原药取代基作为疏水尾和甜菜碱亲水头通过共价键相连，制备药物甜菜碱缀合物，溶解性显著优于疏水性原药；本发明将药物甜菜碱缀合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，具有可形成液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂的特性，用于肿瘤治疗。这种药物甜菜碱缀合物纳米颗粒不仅是一种前药，也是原药全新的药物释放载体，具有靶向功能；本发明的药物甜菜碱缀合物及其脂质体纳米颗粒也是一种全新的前药，也是药物载体，在体内经酯酶水解发挥药效，能延长药物释放半衰期，并具有较低的毒副作用。
以下为制备过程中使用的部分试剂代号：
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DCC 二环己基碳化二亚胺
CDI N,N'-羰基二咪唑
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMSO 二甲亚砜
TFA 三氟乙酸
DBU 1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一-5-烯
EDCI N,N'-硫代羰基二咪唑
HOBT 1-羟基苯并三唑
Triisopropylsilane 三异丙基硅烷
Et3N 三乙胺。
实施例
实施例1
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图1)
苯丁酸氮芥(1.818g,6mmol)和CDI(1.236g,6mmol)溶于20mL二氯甲烷中，25℃搅拌2h，过滤。向滤液中加入3-二甲氨基-1,2-丙二醇(0.119g，1mmol)，DBU(0.244g，0.2mmol)，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸干溶剂，得产物1。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检测(λ＝254nm))；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z 690.4。
取产物1(0.692g，1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺DIEA(0.516g，4mmol)，25℃搅拌20min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯(0.585g,3mmol)，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，0.1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:4，紫外检测(λ＝254nm))；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z 807.3。
取产物2(0.807g，1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入10mLTFA和1mL三异丙基硅烷(Triisopropylsilane)，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物-3粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇/65:25)的产物苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物(DCBC)。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为97.2％谱图(图2)，产率约为51％，MS:[M+H]+m/z 750.2(质谱图3)，1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1，图4):δ7.04(4H,d),6.65(4H,d),4.48-3.95(7H,m),3.77(8H,d),3.64(8H,d),3.40(6H,d),2.52(4H,t),2.41(4H,t),1.89(4H,m).13C NMR(125MHz,DMSO-d6:CDCl31:1，图5):δ183.82,153.96,137.01,133.48,117.60,75.54,71.86,67.23,64.10,59.13,56.82,49.24,45.18,37.81,37.26,30.67。
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物溶于生理盐水中，冻干得到含有抗衡离子氯离子和钠离子的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物白色固体粉末。
实施例2
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体微球的制备、理化性质
取实施例1的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物0.1g溶于20mL的氯仿，60℃旋蒸干溶剂，加入10mL PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，震摇10min得苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体微球水溶液。苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质颗粒体的粒径分布和Zeta电位见图6，形态结构见图7苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的透射电镜图。
实施例3
喜树碱甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图8)
喜树碱0.5g，己二酸酐2.5g，DMAP 0.1g，三乙胺(Et3N)1.5g，溶于二甲亚砜DMSO中，加热回流反应，反应12h；0.1M稀盐酸洗涤3遍，过滤稀盐酸层，取滤饼。加入CDI 1.0g，溶于20mL二氯甲烷中，25℃搅拌2h，过滤。向滤液中加入3-二甲胺基-1,2-丙二醇(0.12g)，DBU(0.25g)，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物1。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检测λ254nm)；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,1037.4。
中间产物10.4g溶于20mL二氯甲烷中，加入DIEA 0.4g，25℃搅拌20min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯0.5g，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物-2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:3，紫外检测λ254nm)。
取中间产物20.26g溶于20mL二氯甲烷中，加入10mL TFA和1mL三异丙基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇/65:25)的产物喜树碱甜菜碱缀合物。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为95％，产率约为58％，MS:[M+H]+1095.4，1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):δ7.59-8.03(10H,m),6.74(2H,s),5.18(1H,m),4.74-4.76(4H,d),3.36-4.45(10H,m),3.30(6H,s),2.35(8H,t),1.96(4H,t),1.64(8H,m),0.90(6H,t)。
喜树碱甜菜碱缀合物溶于0.1M磷酸钠水溶液中，冻干得到含有抗衡离子钠离子和硫酸根离子的喜树碱甜菜碱缀合物固体粉末。
实施例4
喜树碱甜菜碱缀合物脂质体的制备
由实施例3得到的喜树碱甜菜碱缀合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH 7.4)60℃起膜震荡，得喜树碱甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示，平均粒径180nm。
实施例5
喜树碱甜菜碱缀合物脂质体的制备
由实施例3得到的喜树碱甜菜碱缀合物0.5mmol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.5mmol，胆固醇1mmol,加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH 7.4)60℃起膜，得喜树碱甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示，平均粒径240nm。
实施例6
喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图9)
喜树碱1.0g，亚二硫基二乙酸酐2.5g，DMAP 0.3g，三乙胺1.5g，加入DMSO为反应溶剂，加热回流反应，反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤稀盐酸层，取滤饼。加入CDI 1.2g，溶于20mL三氯甲烷中，25℃搅拌3h，过滤。向滤液中加入3-二甲胺基-1,2-丙二醇0.4g，DBU 0.6g，加热回流反应24h。反应液用三氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物1。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检测λ254nm)；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,1109.2。
中间产物10.6g溶于20mL三氯甲烷中，加入DIEA 0.5g，25℃搅拌30min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯0.6g，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:3，紫外检测λ254nm)。
取中间产物20.45g溶于20mL三氯甲烷中，加入10mL TFA和1mL三异丙基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为 三氯甲烷:甲醇/80:20)的产物喜树碱亚二硫基二乙酸酯甜菜碱缀合物。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为96％，产率约为62％，MS:[M+H]+m/z,1167.2，1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):δ7.59-8.03(10H,m),6.74(2H,s),5.18(1H,m),4.74-4.76(4H,d),3.36-4.45(10H,m),3.30(6H,s),3.52(8H,s),1.96(4H,t),0.90(6H,t)。
实施例7
喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体A的制备
由实施例6得到的喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，得喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体A纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示，平均粒径228nm。
喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体B的制备
由实施例6得到的喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物0.5mmol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.5mmol，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)-叶酸(聚乙二醇分子量400-3000)0.1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20mlPBS(pH 7.4)60℃起膜，得到的喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体B纳米颗粒溶液，赋予脂质体靶向作用。粒径分析显示，平均粒径310nm。冷冻干燥得到喜树碱亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体B粉末状纳米颗粒。
实施例8
紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图10)
紫杉醇0.8g，亚二硫基二乙酸酐2g，DMAP 0.3g，三乙胺1.5g，加入DMSO为反应溶剂，加热回流反应，反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤稀盐酸层，取滤饼。加入CDI 1.0g，溶于20mL三氯甲烷中，25℃搅拌3h，过滤。向滤液中加入3-二甲胺基-1,2-丙二醇0.3g，DBU 0.5g，加热回流反应24h。反应液用三氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物1。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检测λ254nm)；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,2120.6。
中间产物10.56g溶于20mL三氯甲烷中，加入DIEA 0.5g，25℃搅拌30min， 向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯0.5g，加热回流反应24h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:3，紫外检测λ254nm)。
取中间产物20.40g溶于20mL三氯甲烷中，加入10mL TFA和1mL三异丙基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为三氯甲烷:甲醇/80:20)的产物紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物。HPLC检测纯度，质谱确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为94％，产率约为58％，MS:[M+H]+m/z 2178.6。
实施例9
紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体的制备
由实施例8得到的紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，得紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示平均粒径190nm。
实施例10
鬼臼毒素甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图11)
鬼臼毒素0.5g，丁二酸酐3g，DMAP 0.1g，三乙胺3g，加入三氯甲烷为反应溶剂，回流反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤稀盐酸层，取滤饼；加甲醇溶解，4℃放置12h，过滤，取滤饼，干燥，得到鬼臼毒素-4-丁二酸单酯。加入CDI 1.0g，溶于20mL三氯甲烷中，25℃搅拌2h，过滤。向滤液中加入3-二甲胺基-1,2-丙二醇0.3g，DBU 0.5g，加热回流反应24h。反应液用三氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物1。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检测λ254nm)；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,1113.4。
中间产物10.35g溶于20mL三氯甲烷中，加入DIEA 0.4g，25℃搅拌20min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯0.5g，加热回流反应24h。反应液用三氯甲烷稀释至50mL，1M盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得中间产物2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:3，紫外检测λ254nm)。
取中间产物20.20g溶于20mL二氯甲烷中，加入10mL TFA和1mL三异丙 基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至50mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为三氯甲烷:甲醇/70:30)的产物鬼臼毒素甜菜碱缀合物。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为96％，产率约为45％，MS:[M+H]+m/z 1171.4，1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):6.66(4H,s),δ6.52(4H,s),6.07(4H,d),5.31(2H,d),5.18(1H,m),4.76(2H,d),4.13-4.45(8H,m),3.83(18H,s),3.30-3.61(10H,m),2.80(2H,t),2.64(8H,m)。
实施例11
鬼臼毒素甜菜碱缀合物脂质体的制备
取实施例10的鬼臼毒素甜菜碱缀合物0.5mmol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.5mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，得鬼臼毒素甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析显示平均粒径160nm。
实施例12
双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物的合成(路线见图12)
20-马来酰亚胺丙酸紫杉醇(20-maleimido-paclitaxel)的合成:紫杉醇0.2g(8.6mg)，3-马来酰胺丙酸0.04g(1.0mg)，DCC 0.1(4.1mg)10mL于无水二氯甲烷中室温反应12h.过滤分离，蒸发除去有机溶剂，固体分散在10mL CH3OH:H2O(50:50V/V)含0.1％三氟甲酸.柱分离得到20-马来酰亚胺丙酸紫杉醇0.14g。MS:[M+H]+m/z964.35。1H NMR(CDCl3)ppm:1.82(s,1H,1-OH)；5.68(d,1H,H-2)；3.80(d,1H,H-3)；2.45(s,3H,4-OAc)；4.97(d,1H,H-5)；2.54(m,1H,Ha-6)；1.98(m,1H,Hb-6)；4.43(m,1H,H-7)；2.40(d,1H,7-OH)；6.28(s,1H,H-10)；2.23(s,3H,10-OAc)；6.19(t,1H,H13)；2.20–2.30(band,2H,H14)；1.24(s,3H,Me-16)；1.14(s,3H,Me-17)；1.68(s,3H,Me-18)；1.93(s,3H,Me-19)；4.32(d,1H,Ha-20)；4.21(d,1H,Hb-20)；5.47(d,1H,H-20)；6.06(dd,1H,H-30)；6.98(d,1H,30-NH)；7.62–8.13(m,5H,C2-OBz)；7.32–7.52(m,5H,C30-Ph)；7.49–7.77(m,5H,C30-NBz)and 2.75(t,2H)；3.84(t,2H)；6.51(s,2H)。
20-马来酰亚胺丙酸紫杉醇0.12g溶于二氯甲烷中，加入二巯基乙酸-N,N-二甲基-1,2-丙二醇酯0.06g，45℃下搅拌反应24小时，柱分离得到产物双-(20-紫杉醇-丁二 酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯-N,N-二甲胺0.096g。产物溶于20mL二氯甲烷中，加入DIEA(0.5g)，25℃搅拌20min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯(0.5g)，加热回流反应24h。反应液用盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，产物溶于20mL二氯甲烷中，加入10mLTFA和1mL三异丙基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至30mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇/80:20)的产物双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物0.032g。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为95.6％，MS:[M+H]+m/z 2336.78。1H NMR(CDCl3)ppm:1.82(s,2H)；5.68(d,2H)；3.80(d,2H)；2.45(s,6H)；4.97(d,2H)；2.54(m,2H)；1.98(m,2H)；4.43(m,2H)；2.40(d,2H)；6.28(s,2H,H-10)；2.23(s,6H)；6.19(t,2H)；2.20–2.30(band,4H)；1.24(s,6H)；1.14(s,6H)；1.68(s,6H)；1.93(s,6H,Me-19)；4.32(d,2H)；4.21(d,2H)；5.47(d,2H)；6.06(dd,2H)；7.62–8.13(m,10H)；7.32–7.52(m,10H)；7.49–7.77(m,10H)and 2.75(t,4H)；3.84(t,4H)；6.51(s,4H)；4.6(m,1H),4.45(m,1H),4.2(m,1H),3.40(s,4H),3.77(m,2H),3.19(m,1H),2.94(m,1H),2.4(s,2H),1.4-1.7(m,2H),0.9(s,6H).
实施例13
双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物脂质体的制备
取实施例12的双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物0.2mmol，二月桂酸磷脂酰胆碱0.2mmol，胆固醇0.1mmol,加入三氯甲烷10ml，60℃旋蒸溶剂；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，得双-(20-紫杉醇-丁二酰亚胺丙酸硫代乙酸)-1,2-丙二醇酯甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析显示平均粒径220nm。
实施例14
全反式维甲酸甜菜碱缀合物的合成(合成路线见图13)
全反式维甲酸(2g)和CDI(2.0g)溶于20mL二氯甲烷中，25℃搅拌2h，过滤。向滤液中加入3,3-二甲氨基-1,2-丙二醇(1.2g)，DBU(1g)，加热回流反应24h。反应液用稀盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物1双-全反式维甲酸-3,3-二甲氨基-1,2-丙二醇酯。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:1，紫外检 测(λ＝254nm))；质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,685.49。
取产物1(0.8g)溶于20mL二氯甲烷中，加入DIEA(0.5g)，25℃搅拌20min，向反应体系中缓慢加入溴乙酸叔丁酯(0.5g)，加热回流反应24h。反应液用盐酸洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物2。TLC检测反应过程(展开剂为甲醇:二氯甲烷/1:4，紫外检测λ254nm)。
取产物2(0.5g)溶于20mL二氯甲烷中，加入10mLTFA和1mL三异丙基硅烷，25℃反应2h。反应液用二氯甲烷稀释至30mL，饱和NaHCO3洗涤3遍，Na2SO4干燥，旋转蒸发干溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇/80:20)的产物全反式维甲酸甜菜碱缀合物0.34g。HPLC检测纯度，质谱和核磁共振确定产物结构。通过HPLC检测可得纯度为98.1％，产率约为70％，MS:[M+H]+m/z743.50，1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):δ6.51(8H,s),6.23(2H,s),5.77(2H,s),5.18(1H,m),4.39(2H,d),4.35(2H,s),3.48(2H,d),3.30(6H,s),1.96(4H,t),1.71(18H,s),1.65(4H,m),1.57(4H,t),1.21(12H,s).13C NMR(125MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):δ165.01,153.32,139.35,137.91,134.12,129.46,122.52,114.26,717.22,69.74,68.23,66.12,46.92,43.21,36.62,33.22,25.16,17.38,16.62。
实施例15
全反式维甲酸甜菜碱缀合物脂质体的制备
由实施例14得到的全反式维甲酸甜菜碱缀合物0.5mmol，0.5mmol胆固醇，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶剂；加入20ml PBS(pH 7.4)60℃起膜，得全反式维甲酸甜菜碱缀合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示，平均粒径160nm。
实施例16
全反式维甲酸磺酸甜菜碱缀合物的合成(路线见图14)
由实施例14得到的产物1双-全反式维甲酸-3,3-二甲氨基-1,2-丙二醇酯0.5g溶于20mL二氯甲烷中，加入丙磺酸内酯0.3g,25℃搅拌反应6h，旋转蒸发除溶剂，得产物粗产品。粗产品通过硅胶柱纯化(流动相为二氯甲烷:甲醇/20:80)的产物全反式维甲酸磺酸甜菜碱缀合物0.33g，产率65％。质谱确定产物结构。MS:[M+H]+m/z,807.50。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6:CDCl31:1):δ6.51(8H,s),6.23(2H,s),5.77(2H,s),5.18(1H,m),4.39(2H,d),3.48(2H,d),3.30(6H,s),3.24(2H,d),2.55(2H,d),2.29(1H,m),1.96(4H,t),1.71(18H,s),1.65(4H,m),1.57(4H,t),1.21(12H,s).
实施例17
药物甜菜碱缀合物的溶解性比较
将原药或药物甜菜碱缀合物溶于20℃水中，搅拌溶解，测量溶解度，结果见表1：
表1.原药或药物甜菜碱缀合物的溶解度
原药或本发明的药物甜菜碱缀合物溶解度苯丁酸氮芥10.5g/L苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物(实施例1)68g/L喜树碱1.3mg/L喜树碱甜菜碱缀合物(实施例3)12g/L紫杉醇0紫杉醇亚二硫基二乙酸甜菜碱缀合物(实施例8)6g/L鬼臼毒素0.12g/L鬼臼毒素甜菜碱缀合物(实施例10)34g/L全反式维甲酸0全反式维甲酸甜菜碱缀合物(实施例14)31g/L
可以看出，所有药物甜菜碱缀合物的溶解度均远大于原药。
药理实验
实施例18
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体微球的抗肿瘤活性(MTT法)
MCF-7人乳腺癌细胞(或HeLa人宫颈癌细胞或HepG-2人肝癌细胞)细胞以8×103个/孔的接种量接种于96孔培养板，5％CO2、37℃培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的实施例2的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体微球溶液各10μL，使最终筛选的药物终浓度分别为5、25、100、250、500μg/mL，继续培养24h后；分别加入50μLMTT温育4h，弃去培养基，加入150μLDMSO，在平板摇床上摇匀，酶标仪495nm读板，根据测得的吸光度值计算抑制率。同时，以苯丁酸氮芥为对照(以0.1％DMSO水溶液溶解)。数据表示为平均数±SD(n＝6)。
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的的细胞毒性见图15。结果显示，对三种肿瘤细胞，苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的致死率高于对照苯丁酸氮芥，显示前者优异的抗肿瘤 活性。
实验例19
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物磷脂质体在小鼠体内毒性试验
动物：ICR小鼠，雄性，18-22g，购自维通利华实验动物技术有限责任公司。
实施例2的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物磷脂质体的体内毒性试验的结果(表2)表明，其最大耐受剂量大于100mg/kg，表明其毒性远小于苯丁酸氮芥。
表2 小鼠体内毒性试验结果
缀合物最大耐受剂量(MTD，mg/kg)苯丁酸氮芥46苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体＞100
实验例20
MTT法人癌细胞杀伤试验
药品及试剂：小牛血清为南京生兴生物技术有限公司产品；DMSO分析纯；RPMI1640为GIBCO产品。
仪器：BIORAD 680型酶标仪。
收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基配制成1×10-4/mL细胞悬液，于96孔培养板内接种，每空100μL(含1000个肿瘤细胞)，置37℃，5％CO2温箱内培养24小时后加药，实验设空白对照及溶剂对照，受试样品设4个浓度，每浓度3个平行孔，置37℃，5％CO2温箱内培养4天。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/mL，RPMI1640配制)100μL，37℃孵育4小时。弃去上清液，每孔加入MTT溶液150μL，溶解颗粒，轻度振荡后，用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长450nm下测定OD值。
结果计算：以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC50)。
本发明药物甜菜碱缀合物对人肿瘤细胞株的抗肿瘤活性结果见表3.从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明缀合物的半数抑制浓度均小于原药，说明其活性优于原药，大约是原药的一半，可能是因为药物甜菜碱缀合物含有两个原药分子结构单元。
表3.本发明药物甜菜碱缀合物对人肿瘤细胞株的抗肿瘤活性结果

MCF-7：人乳腺癌细胞；Hep G2：人肝癌细胞；A2780：人卵巢癌细胞；HCT-8：人结肠癌细胞；A549：人肺腺癌细胞；EC-304：人血管内皮正常细胞；ND：未试验。
实验例21
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体细胞毒性的微环境盐浓度依赖性实验
采用实施例20相似的方法，以含不同氯化钠浓度的PBS缓冲液作为培养液(含不同浓度的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物磷脂质体或苯丁酸氮芥)，测量实施例2的苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的对HepG-2细胞的IC50(培养时间24小时)，并用苯丁酸氮芥为对照。结果表明：氯化钠浓度为0.9％的体系，苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的IC50为300微克/毫升左右，氯化钠浓度为1.0％和1.1％的体系中，IC50低至为200微克/毫升左右。在上述氯化钠浓度范围内，苯丁酸氮芥的IC50高达380微克/毫升。结果显示，苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体对细胞毒性作用对盐浓度非常敏感，盐浓度高有利于苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体进入细胞，发挥药效，显示甜菜碱脂质体的渗透调节作用。
实验例22
苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体的稳定性实验
模拟胃液和肠液体系，苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体和苯丁酸氮芥分别分散于盐酸(pH 1.0)和缓冲液PBS(pH 7.4)中37℃24h,采用高效液相色谱HPLC和激光粒度仪DLS分析。结果显示，24小时后，盐酸中苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体仅降解3％，PBS中降解10％；苯丁酸氮芥在盐酸中仅降解2％，PBS中降解率则高达98％。此外，DLS结果显示，盐酸(pH 1.0)和PBS(pH 7.4)中苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体粒径没有明显变化。结果表明，苯丁酸氮芥甜菜碱缀合物脂质体稳定性远远高于苯丁酸氮芥。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。