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1、(10)申请公布号 CN 103555726 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555726 A (21)申请号 201310479972.9 (22)申请日 2013.10.14 C12N 15/117(2010.01) A61K 31/711(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 孙黎 周志侠 孙铂光 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称。
2、 一种含有未甲基化CpG的DNA序列 （CpG-DNA） 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及免疫学领域， 具体的说是一种在 牙鲆中具有免疫刺激效应的含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列及其在抗病毒中的应用。含有未甲基化 CpG的DNA序列 （CpG-DNA） 为牙鲆中具有免疫刺激 效应的CpG-DNA序列， 由序列表SEQ ID No.1中的 碱基序列所示。本发明的 CpG DNA 能够使鱼类 抵御肿大细胞病毒的侵染。本发明的 CpG DNA 可以作为疫苗佐剂使用， 能够增强疫苗的特异性 免疫效应。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 (19)中华人。
3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 (10)申请公布号 CN 103555726 A CN 103555726 A 1/1 页 2 1. 一种含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列， 其特征在于 ： 含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列 （CpG-DNA） 为牙鲆中具有免疫刺激效应的CpG-DNA序列， 由序列表SEQ ID No.1中的碱基序 列所示。 2. 一种权利要求 1 所述的含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列的应用， 其特征在于 ： 所述 CpG-DNA 序列可制备成抗病毒因子的药物。 3. 按权利要求 2 所述的含有未甲基化 。
4、CpG 的 DNA 序列， 其特征在于 ： 所述 CpG-DNA 序 列可制备成抗肿大细胞的病毒因子的药物。 4. 一种权利要求 1 所述的含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列的应用， 其特征在于 ： 所述 CpG-DNA 序列作为疫苗佐剂。 权 利 要 求 书 CN 103555726 A 2 1/3 页 3 一种含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列 （CpG-DNA） 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及免疫学领域， 具体的说是一种在牙鲆中具有免疫刺激效应的含有未甲 基化 CpG 的 DNA 序列及其在抗病毒中的应用。 背景技术 0002 CpGDNA 是含有未甲基化 CpG 的 。
5、DNA 序列， 是原核生物 DNA 序列的一种特征。在 进化过程中， 脊椎动物获得了针对 CpGDNA 的免疫识别系统， 以此对微生物病原入侵做出 保护性免疫反应， 包括通过与 Toll 样受体家族成员 9 作用， 激活 Th1 诱导的细胞免疫和体 液免疫等。已有研究表明， CpGDNA 具有种属特异性， 不同物种中有效的 CpGDNA 序列不 同， 并且不同CpGDNA在同一物种中诱发的免疫应答亦不同。 牙鲆是我国重要的养殖海水 鱼类， 近年来其养殖业不断受到微生物病害影响。虽然现阶段发现了能在牙鲆中诱发抗细 菌感染的 CpGDNA。但对于能在牙鲆中诱发显著抗病毒感染的 CpGDNA 并没有。
6、相关的报 道。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种在牙鲆中具有免疫刺激效应的含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列及其在抗病毒中的应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0005 一种含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列， 含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列 （CpG-DNA） 为 牙鲆中具有免疫刺激效应的 CpG-DNA 序列， 由序列表 SEQ ID No.1 中的碱基序列所示。 0006 含有未甲基化 CpG 的 DNA 序列的应用， 所述 CpG-DNA 序列可制备成抗病毒因子的 药物。所述 CpG-DNA 序列可制备成抗肿大细胞的病毒因子的药物。。
7、 0007 含有未甲基化CpG的DNA序列的应用， 其特征在于 ： 所述CpG-DNA序列作为疫苗佐 剂。 0008 本发明具有如下优点 ： 0009 1. 能够抑制病毒侵染。本发明的 CpG DNA 能够使鱼类抵御肿大细胞病毒的侵 染。 0010 2. 具有疫苗佐剂效应。本发明的 CpG DNA 可以作为疫苗佐剂使用， 能够增强疫 苗的特异性免疫效应。 具体实施方式 0011 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述， 而 非以任何形式对本发明进行限制。 0012 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法 ： 0013 1. 质粒提取、 DNA(PCR。
8、) 产物纯化、 DNA 片段从凝胶中回收、 细菌基因组 DNA 提取皆 使用 “天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司” 的相应试剂盒。 说 明 书 CN 103555726 A 3 2/3 页 4 0014 2. 质 粒、 DNA 连 接 液 转 化 进 入 大 肠 杆 菌 皆 用 Hanahan 方 法 （Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001） ； 0015 3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于 “纽英伦生物技术有限公司” ， 北。
9、京。 0016 4. 所有寡核苷酸合成皆由 “上海生工生物工程技术服务有限公司” 合成。 0017 实施例 1 0018 牙鲆特异性 CpG DNA 序列具序列表 SEQ ID No.1 中的碱基序列。 0019 序列表 SEQ ID No.1 为 ： 0020 GGCGCGCGTCGCGCGCTA 0021 （a） 序列特征 ： 0022 长度 ： 18 0023 类型 ： 核苷酸序列 0024 链型 ： 单链 0025 拓扑结构 ： 线性 0026 （b） 分子类型 ： DNA 0027 （c） 假设 ： 否 0028 （d） 反义 ： 否 0029 （e） 最初来源 ： 人工设计 003。
10、0 实施例 1 0031 CpG DNA 作为抗病毒因子的应用 0032 1） 病毒悬液的制备。将肿大细胞病毒 RBIV-C1（具体制备方法见 Zhang M， Xiao Z， Hu Y， Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream， Oplegnathus fasciatus(Temminck43:55664） 于 PBS 中稀释至 5x106copies/ml， 即为病毒悬液。 0033 所述 PBS 组成成分按重量百分比计 ： 0.8%NaCl， 0.02%KCl， 0.358%Na2HPO4.。
11、12H2O， 0.024%NaH2PO4， 98.798蒸馏水。 0034 2） 将 10 条牙鲆 （每条重约 8g） 随机分为 2 组， 每组 5 条。将这 2 组分别命名为 A 和 B 组。将 A 组的每条鱼肌肉注射 100ul 含有 10ug CpG DNA 的 PBS， 将 B 组 ( 对照组 ) 的每条鱼注射 100ul PBS。1 天后将 A 和 B 组鱼每条腹腔注射 100ul 上述步骤 1） 的病毒悬 液。在感染后第 3d 和 5d， 取鱼脾脏组织， 提取 DNA， 用绝对定量 PCR 法检测组织中病毒含量 （具体方法见上述参考文献） 。 结果表明A组鱼在感染后3d和5d的病毒。
12、数 （分别为1.1x103/ mg 和 3.8x103/mg） 皆显著 （P0.01） 低于 B 组鱼的病毒数 （1.8x104/mg 和 4.3x104/mg） 。因 此， CpG DNA 具有明显的抗病毒效应。 0035 实施例 2 0036 CpG DNA 作为疫苗佐剂的应用 0037 步骤 1） 疫苗免疫注射 0038 将 DNA 疫 苗 质 粒 pCN86（其 构 建 过 程 见 Zhang M， Hu Y， Xiao Z， Sun Y， Sun L.Construction and analysis of experimental DNA vaccines against mega。
13、locytivirus.Fish Shellfish Immunol.2012;33:11928.） 在 PBS 中稀释至 200ug/ 说 明 书 CN 103555726 A 4 3/3 页 5 ml。将 CpG DNA 在 PBS 中稀释至 200ug/ml。将 pCN86 与 CpG DNA 稀释液等体积混合， 即为 pCN86+CpG DNA 混合液。将 pCN86 与 PBS 等体积混合， 即为 pCN86 疫苗液。将 15 条 牙鲆 （同上） 随机分为 3 组， 每组 5 条。将这 3 组分别命名为 A、 B 和 C。将 A 组的每条鱼肌 肉注射 0.1mlpCN86 疫苗液， 。
14、将 B 组的每条鱼肌肉注射 0.1ml pCN86+CpG DNA 混合液， 将 C 组 ( 对照组 ) 的每条鱼肌肉注射 0.1ml PBS。 0039 步骤 2) 病毒悬液的制备， 参见实施例 1 中相应的记载。 0040 步骤 3） 攻毒感染和免疫保护效应检测 0041 在上述步骤 1） 免疫后第 30 天， 将 3 组的每条鱼腹腔注射 100ul 上述步骤 2） 的病 毒悬液。 在以后的20天中， 每天观察并记录各组鱼的死亡情况。 20天后， 统计各组鱼的总死 亡数目 ： A 组， 20 条 ； B 组， 11 条 ； C 组， 28 条。利用下列公式计算相对免疫保护效率 (RPS) ： 0042 RPS=100x(1 免疫组鱼的总死亡百分比 / 对照组鱼的总死亡百分比 ) 0043 由此得出免疫 pCN86 和 pCN86+CpG DNA 混合液组鱼的 RPS 分别为 29% 和 61%， 其 中免疫 pCN86+CpG DNA 混合液组鱼的 RPS 显著 （P0.01） 高于免疫 pCN86 组。因此， CpG DNA 显著提高了疫苗 pCN86 的免疫保护效应。 0044 结论 ： 本发明的 CpG DNA 既具有抗病毒效应也具有疫苗佐剂效应。 说 明 书 CN 103555726 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 103555726 A 6 。