《杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103555589 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555589 A (21)申请号 201310428019.1 (22)申请日 2013.09.22 CGMCC No.6626 2012.09.25 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 河北省农林科学院植物保护研究所 地址 071000 河北省保定市北市区东关大街 437 号 (72)发明人 杜立新 曹伟平 宋健 冯书亮 王金耀 (74)专利代理机构 保定。
2、市燕赵恒通知识产权代 理事务所 13121 代理人 周献济 (54) 发明名称 杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种针对林业重要害虫， 特 别针对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有高毒 杀能力的白僵菌新菌株 XWY-1。毒力测试表 明， XWY-1 菌株对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲 具有极高的毒力， 因而， 可以将本发明白僵菌 （Beauveriabassiana） XWY-1 制成杀虫剂， 用于林 业害虫的防治， 从而降低农药的使用量， 减少环境 污染， 保护天敌， 具有重要的经济价值和应用前 景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明。
3、书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103555589 A CN 103555589 A 1/1 页 2 1. 白僵菌 （Beauveria bassiana） XWY-1， 保藏号为 CGMCC No.6626。 2. 含有权利要求 1 所述菌株的微生物杀虫剂。 3. 权利要求 1 所述菌株或权利要求 2 所述微生物杀虫剂在林业害虫防治中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述害虫为鞘翅目害虫。 5. 根据权利要求 4 所述的。
4、应用， 其特征在于， 所述害虫为鞘翅目叶甲科害虫。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 所述害虫为榆蓝叶甲。 权 利 要 求 书 CN 103555589 A 2 1/4 页 3 杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物新菌株及其应用， 具体地说是一种白僵菌及其在林业害虫 防治中的应用。 背景技术 0002 白僵菌 （Beauveria bassiana） 是一类寄生昆虫的病原真菌， 以粘附在虫体表皮或 肠胃， 快速繁殖， 造成害虫死亡， 并以分生孢子造成害虫流行感染。白僵菌是我国研究时间 最长、 应用面积较大的真菌杀虫剂。从上个世纪 60 年。
5、代起， 国内开始研究利用白僵菌防治 林业害虫松毛虫和农业害虫玉米螟， 至 70 年代， 开发出固相培养和液固两相生产方法和应 用技术， 并陆续建厂生产白僵菌粗产品， 大面积防治松毛虫和玉米螟。 目前， 针对松毛虫、 天 牛、 小蠹虫、 象甲及木蠹蛾等重要林业害虫进行了较多的白僵菌研究及应用工作， 尚未有白 僵菌防治林业害虫榆蓝叶甲的研究报道。 0003 榆蓝叶甲属鞘翅目叶甲科， 又名榆绿叶甲、 榆毛胸茧叶甲、 榆蓝金花虫。榆蓝叶甲 以成虫和幼虫危害榆树叶片， 严重发生时可将叶片食成网状， 甚至将树冠叶片全部食光 ； 成 虫还有进入公共场所、 居民家中扰民的习性 ； 榆蓝叶甲化蛹前大量老熟幼虫群。
6、集树干分叉 处和树皮缝隙间， 影响环境卫生， 影响树木的树势和景观效果。上世纪六七十年代榆蓝叶 甲曾在我国爆发， 造成榆树在我国几乎绝种。叶甲类害虫对有机磷、 有机氯、 菊脂类农药较 为敏感， 此类药物虽然能够取得短期效果， 但同时也带来一些弊端， 如增强害虫抗药性、 污 染环境、 杀伤鸟类、 造成害虫再度猖獗的恶性循环， 不能达到对害虫种群的有效控制。因此 为了减少常规化学农药对城市环境的污染及对居民健康的影响， 榆蓝叶甲防治需要安全有 效、 保护天敌的生物农药， 筛选对榆蓝叶甲有高致病性的白僵菌是防治榆蓝叶甲的有效的 方法之一。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种针对林业重要害虫，。
7、 特别针对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶 甲具有高毒杀能力的白僵菌新菌株。 0005 本发明所提供新菌株是白僵菌 （Beauveria bassiana） XWY-1， 该菌株已于 2012 年 9 月 25 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北 辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC No.6626。 0006 XWY-1 菌株是 2010 年河北省农林科学院植物保护研究所在河北雄县甘薯田采集 到的白色感病昆虫上分离得到的。将分离到的 XWY-1 菌株接种在 SDAY（蛋白胨 10 g， 酵母 10 g， 葡萄糖40 g，。
8、 琼脂15 g， 蒸馏水1 000 mL， 自然pH） 平板培养基上， 观察菌落形态特征、 产孢特征等。结果显示在 SDAY 培养基上培养 7 天， 菌落初期白色茸状， 产孢时乳白色， 孢子 层厚且均匀， 中心至边缘呈丘状凸起， 具同心纹。菌丝具分枝分隔， 透明、 光滑， 有时成簇生 长。产孢细胞浓密簇生于短而膨大的柄细胞上， 产孢细胞上部 “之” 字形， 顶端渐变细长 ； 分 生孢子为近球形， 单细胞， 孢子大小为 1.1-2.21.5-2.7m。从以上特征看， 菌株 XWY-1 为 说 明 书 CN 103555589 A 3 2/4 页 4 球孢白僵菌。XWY-1 菌株菌落照片如图 1 。
9、所示， XWY-1 菌株孢子及菌丝照片如图 2 所示。 0007 进一步的分析结果表明， 与 XWY-1 菌株 ITS 序列最为接近的为球孢白僵菌， 其 ITS 序列同源性为 99%， 结合 XWY-1 菌株的形态学特点， 将该菌株鉴定为球孢白僵菌。 0008 对 XWY-1 菌株进行毒力测试， 发现该菌株浓度 1108孢子 /mL 的孢悬液对榆蓝 叶甲 1 龄、 2 龄、 3 龄幼虫、 成虫、 蛹 7 天的校正死亡率分别为 92.3%、 86.4%、 82.3%、 79.8%、 38.5%。XWY-1 菌株在第 57 天对榆蓝叶甲 2 龄幼虫的 LC50 分别为 3.14107、 8.051。
10、06、 7.57105孢子 /mL， 对榆蓝叶甲成虫的 LC50 为 2.46107孢子 /mL。因此， XWY-1 菌株对榆 蓝叶甲不同龄期的幼虫和成虫均有很高的杀虫活性。 0009 上述毒力测试表明， XWY-1 菌株对鞘翅目叶甲科害虫榆蓝叶甲具有极高的毒力， 因 而， 可以将本发明白僵菌 （Beauveria bassiana） XWY-1 制成杀虫剂， 用于林业害虫的防治， 从而降低农药的使用量， 减少环境污染， 保护天敌， 具有重要的经济价值和应用前景。 附图说明 0010 图 1 为 XWY-1 菌株菌落照片 ； 图 2 为 XWY-1 菌株孢子及菌丝照片 ； 图 3 为 XWY-。
11、1 菌株感染的榆蓝叶甲幼虫 ； 图 4 为 XWY-1 菌株感染的榆蓝叶甲成虫。 具体实施方式 0011 实施例 1 ： XWY-1 菌株获取的工作流程 田间采集自然感病僵虫直接分离纯化菌株接种榆蓝叶甲幼虫测定杀虫毒力获 得高毒力菌株XWY-1菌株形态、 孢子形态、 鉴定提取菌株DNA， 以真菌ITS序列通用引物 扩增菌株 DNA， 将获得的扩增序列测序并在 GenBank 中对比确定菌株 XWY-1 为球孢白僵 菌。 0012 实施例 2 ： XWY-1 菌株的筛选分离过程 XWY-1 菌株是 2010 年河北省农林科学院植物保护研究所在河北雄县甘薯田调查时采 集到的白色感病昆虫上分离得到的。
12、。将白色感病昆虫带回实验室后保湿处理， 待其体表产 生孢子时， 将孢子接种在 SDAY（蛋白胨 10 g， 酵母 10 g， 葡萄糖 40 g， 琼脂 15 g， 蒸馏水 1 000 mL， 自然 pH） 平板培养基上培养至产生分生孢子， 收集分生孢子， 冷冻干燥后 4备用。 0013 实施例 3 ： 菌株培养及孢悬液配制 将 XWY-1 菌株接种于 SDAY 平板培养基上， 251恒温光照 （14L 10D） 培养。形成 分生孢子后用0.05%(v/v)无菌吐温80水溶液收集孢子， 经磁力搅拌器搅拌30 min， 将孢子 完全均匀打散后经 4 层无菌纱布过滤， 获得纯孢子悬浮液， 以血球计数。
13、板计数并配制成梯 度浓度的孢悬液， 用于致病力测定。 0014 实施例 4 ： XWY-1 菌株对榆蓝叶甲的杀虫活性 XWY-1 菌株对榆蓝叶甲成虫、 幼虫及蛹的杀虫活性测定 ： 饲养塑料盒用次氯酸钠 100 倍 液浸泡1 h， 晾干。 挑取大小一致、 健康活泼的榆蓝叶甲试虫， 将不同浓度的XWY-1孢悬液分 别喷洒于试虫体表， 并用滤纸吸去多于水分， 以 0.05（V/V） 吐温 -80 水悬液处理作为对 照， 置于 261、 光周期 14 h ： 10 h（L ： D） 条件下饲养， 将新鲜榆叶用脱脂棉保湿饲喂试 说 明 书 CN 103555589 A 4 3/4 页 5 虫。每处理 3。
14、0 头试虫， 设 3 次重复， 施药后定期调查死亡虫数， 并及时更换饵料。数据统计 分析应用 SPSS 18.0 软件进行数据处理。 0015 从表 1、 2、 3 中可以看出， XWY-1 菌株对榆蓝叶甲幼虫及成虫均有较高毒力， 浓度 1108孢子 /mL 的孢悬液对榆蓝叶甲 1 龄、 2 龄、 3 龄幼虫、 成虫、 蛹 7 天的校正死亡率分别 为 92.3%、 86.4%、 82.3%、 79.8%、 38.5%。XWY-1 在第 57 天对榆蓝叶甲幼虫的 LC50 分别为 3.14107、 8.05106、 7.57105孢子 /mL， 对榆蓝叶甲成虫的 LC50 为 2.46107孢子。
15、 /mL。 可以看出， XWY-1 菌株对榆蓝叶甲不同龄期的幼虫和成虫均有很高的杀虫活性。图 3 为榆 蓝叶甲幼虫感染 XWY-1 菌株的情况 ； 图 4 为榆蓝叶甲成虫感染 XWY-1 菌株的情况。 0016 实施例 5 ： XWY-1 菌株的 ITS 序列扩增与序列测定 在铺有灭菌玻璃纸的SDAY培养基上刮取XWY-1菌丝体放入研钵中， 加液氮后研磨成粉 末， 转移到 10 mL 的离心管中， 加入 1 mL 的 DNA 抽提液 0.1g/2mL， 抽提液配方 ： Tris-HCl （pH 7.5） 0.2 mol/L， NaCl 0.5mol/L， SDS 1%， 漩涡振荡混匀， 加入 。
16、200 L Tris 饱和酚， 65水浴 30min， 每隔 5-10 min 混匀一次 ； 变凉之后， 加入 1 mL 的酚 : 氯仿 : 异戊醇 （体积 比 25:24:1） ， 轻摇混匀， 12000r/min， 4离心 5 min ； 重复一次上面步骤 ； 将上清液转移到 一新离心管， 向该离心管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇， -20放 30 min， 12000 r/min 离 心 10 min 收集沉淀， 75 % 酒精冲洗， 超净台吹风干燥， 加入适量的 TE 溶解沉淀即得到 DNA。 加入 3 L 的 RNA 酶， 37水浴 1 h ； 加 500 mLddH2O， 加入 。
17、400 L 氯仿 / 异戊醇 （24:1） ， 12000 r/min 离心 10 min， 取上清， 重复两次。重复上面的步骤， 沉淀 DNA， 溶于 30 l TE 中， -20保存， 备用。 0017 所用引物为真菌 ITS 区通用引物 （正向引物 ITS-4 ： 说 明 书 CN 103555589 A 5 4/4 页 6 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3， 反向引物 ITS-5 ： 5 -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3） ， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增的 50 L 反应体系包括 ： 40 L 无菌水， 1 L DNA 模板。
18、， 5 L 10PCR Buffer， 0.5 L Taq DNA 聚合酶 （5 U/L） ， 1 L10mmol/mL dNTP， 1.5 L10 mmol/mL ITS-4， 1.5 L10 mmol/L ITS-5。 PCR 反应条件 ： 95 4 min， 94 1 min， 54 1 min， 72 2 min， 35 个循环， 72延伸 2 min。PCR 产物 3 L， 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测。北京华大基因完成测序。测序后， 将 ITS 序列与 Genebank 数据库中的相关菌株进行同源性 BLAST 比对。 0018 ITS 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 。
19、0019 对所测得的 ITS 序列与 GenBank 中已知序列对比， 结果表明， 与该菌株 ITS 序列最 为接近的为球孢白僵菌， 其ITS序列同源性为99%， 结合XWY-1菌株的形态学特点， 将该菌株 鉴定为球孢白僵菌。 说 明 书 CN 103555589 A 6 1/1 页 7 序列表 河北省农林科学院植物保护研究所 杀叶甲科害虫的白僵菌菌株及其应用 1 1 555 DNA 白僵菌 （Beauveria bassiana） 1 ccggtactct acgcggaggg acattaccga gttttcactc cctaaccctt ctgtgaacct 60 acctatcgtt。
20、 gcttcggcgg actcgcccca gcccggacgc ggactggacc agcggcccgc 120 cggggacctc aaactcttgt attccagcat cttctgaata cgccgcaagg caaaacaaat 180 gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 240 cgcgataagt aatgtgaatt gcagaatcca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 300 cgcccgccag cattctggcg ggcatgcc。
21、tg ttcgagcgtc atttcaaccc tcgacctccc 360 cttggggggg tcggcgttgg ggaccggcag cacaccgccg gccctgaaat ggagtggcgg 420 cccgtccgcg gcgacctctg cgcagtaata cagctcgcac cggaaccccg acgcggccac 480 gccgtaaaac acccaacttc tgaacgttga cctcgaatca ggtaggacta cccgctgaac 540 ttaagcatat caaaa 555 序 列 表 CN 103555589 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103555589 A 8 2/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103555589 A 9 3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 103555589 A 10 。