促红细胞生成素受体结合抗体.pdf

本发明涉及结合并激活促红细胞生成素受体的抗体及其抗体片段。本发明也涉及在哺乳动物中使用所述抗体和包含所述抗体的药物组合物调节促红细胞生成素受体内源性活性的方法。

权利要求书
1.  一种分离的抗体或其抗原结合序列，其在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性，其中：
所述抗体的重链可变区由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
所述抗体的轻链可变区由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成，
其中，所述抗体或其抗原结合序列不与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的肽相互作用。

2.  一种分离的在哺乳动物中能结合人促红细胞生成素受体的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区中的CDR1到CDR3的连续序列由SEQ ID NO：58的氨基酸序列组成，所述轻链可变区中的CDR1到CDR3的连续序列由SEQ ID NO：62的氨基酸序列组成。

3.  一种在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的、分离的抗体或其抗原结合序列，其中所述抗体是Ab12，且Ab12具有ATTC编号PTA-5554。

4.  治疗有效量的权利要求3的抗体或其抗原结合序列在制备用于在哺乳动物中刺激红细胞生成的药物中的用途。

5.  治疗有效量的权利要求3的抗体或其抗原结合序列在制备用于通过激活所述受体在哺乳动物中治疗红细胞发育不良的药物中的用途。

6.  治疗有效量的权利要求3的抗体或其抗原结合序列在制备用于通过激活所述受体在哺乳动物中治疗贫血症的药物中的用途。

7.  一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求3的抗体或其抗原结合序列和药学上可接受的赋形剂。

8.  权利要求1-3中任一项所述的抗体的抗原结合片段，其中，所述的片段选自Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段和Fv片段。

说明书促红细胞生成素受体结合抗体
本申请是申请日为2003年10月14日，申请号为200380106079.6的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
申请历史
本申请要求于2002年10月14日提交的美国临时申请系列号60/418,031的优先权，其全文在此并入作为参考。
发明技术领域
本发明涉及识别、结合和优选地激活促红细胞生成素受体的抗体。
发明背景
促红细胞生成素(“EPO”)是一种糖蛋白，其是红细胞生成的主要调节物。具体地说，EPO负责促进红细胞系祖细胞的生长、分化和生存，使成熟红细胞产生。响应于血液和组织中氧水平变化，促红细胞生成素看来似乎可刺激未成熟成红细胞的增殖和分化。其也作为生长因子的功能，刺激红细胞系祖细胞的有丝分裂活性，例如红细胞爆发形成和集落生成单位。也充当分化因子，触发红细胞集落生成单位转化为原成红细胞(参见Erslev，A.，New Eng.R Med.，316：101-103(1987))。
EPO具有约34,000道尔顿的分子量，以-α、β和脱唾液酸基的(asialo)三种形式存在。在怀孕的中期至晚期，EPO在胎儿肝脏内合成。此后，EPO在肾脏内合成，在血液中循环并在尿中排泄。
人尿EPO已得到分离纯化(参见Miyake等.，J Biol.Chem.，252：5558(1977))。此外，用于鉴定、克隆和表达编码EPO基因的方法(参见美国专利第4,703,008号)以及从细胞培养基中纯化重组EPO的方法(参见美国专利第4,667,016号)为本领域公知。
通过结合并激活称为促红细胞生成素受体的细胞表面受体，介导了EPO活性。所述EPO受体属于细胞因子受体超家族，据信含有至少两种不同的多肽，55-72kDa类和85-100kDa类(参见美国专利第6,319,499号，Mayeux等.，J Biol.Chem，266：23380(1991)，McCaffery等.，J Biol.Chem.，264：10507(1991))。另外的研究业已 揭示其它EPO受体多肽复合物具有诸如110、130和145kDa的分子量(参见美国专利第6,319,499号)。
鼠和人EPO受体皆已得到克隆和表达(参见D′Andrea等.，Cell，57：277(1989)；Jones等.，Blood，76：31(1990)；Winkelmann等.，Blood，76：24(1990)；WO 90/08822/美国专利第5,278,065号)。全长人EPO受体是483个氨基酸的跨膜蛋白质，具有约25个氨基酸的信号肽(参见美国专利第6,319,499号)。人受体显示与鼠受体具有约82％的氨基酸序列同源性。同前。
在没有配体的情况下，EPO受体以预成型二聚体形式存在。EPO与其受体的结合导致构象改变，使得胞浆区密切接近。尽管无法充分理解，据信在受体激活中该“二聚化”起作用。EPO受体的激活产生了众多的生物效应。这些活性的一些包括刺激增殖、刺激分化和抑制细胞凋亡(参见美国专利第6,319,499号，Liboi等.，PNAS USA，90：11351(1993)，Koury，Science，248：378(1990))。
EPO受体二聚化和激活之间的关系可用于鉴定不同于EPO的化合物(即，例如抗体)，所述化合物能：(1)使EPO受体二聚化；及(2)激活所述受体。这些化合物可用于治疗患贫血症的哺乳动物，并可用于鉴定具有异常功能EPO受体的哺乳动物。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及结合人促红细胞生成素受体的抗体。在一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区选自：SEQ ID NOS：3、7、11、15、19、31、35、39、43、47、51、55及其片段。在另一个实施方案中，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区选自：SEQ ID NOS：5、9、13、17、21、23、25、27、29、33、37、41、45、49、53、57及其片段。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其能在哺乳动物中结合人促红细胞生成素受体。该抗体包含重链可变区或轻链可变区，所述可变区包含CDR1-CDR3的连续序列。重链可变区的氨基酸序列包含CDR1-CDR3的连续序列，所述连续序列选自：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及其片段。轻链可变区的氨基酸序列包含CDR1-CDR3的连续序列，所述连续序列选自：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68及其片段。
在另一个实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性，但不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用的抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中能激活人促红细胞生成素受体内源性活性的抗体，其中所述抗体或其抗体片段显示了内源性人促红细胞生成素与促红细胞生成素受体结合亲和力100倍范围内的结合亲和力。
还在另一个实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的抗体或其抗体片段。所述抗体或其抗体片段包含至少一种具有SEQ ID NO：3氨基酸序列或其抗体片段的人重链可变区，和/或至少一种具有SEQ ID NO：5氨基酸序列或其抗体片段的人轻链可变区，只要所述抗体或其抗体片段不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
还在另一个实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的抗体或其抗体片段。所述抗体或其抗体片段包含至少一种具有SEQ ID NO：7氨基酸序列或其抗体片段的重链可变区，和/或至少一种具有SEQ ID NO：9氨基酸序列或其抗体片段的轻链可变区，只要所述抗体或其抗体片段不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
该实施方案也包括其它重链可变区，选自：SEQ ID NO：11、15、19、31、35、39、43、47、51和55或任一这些前述SEQ ID NOS的抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段不与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽相互作用。包括于该实施方案中的其它轻链可变区可选自：SEQ ID NO：13、17、21、23、25、27、29、33、37、41、45、49、53和57或任一这些前述SEQ ID NOS的抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段不与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽相互作用。
还在另一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的抗体或其抗体片段，所述抗体包含至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区的氨基酸序列，所述重链可变区/轻链可变区选自：SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19/SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31/SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35/SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39/SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43/SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47/SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51/SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55/SEQ ID NO：57或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段不与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽相互作用。
还在另一个实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的方法。所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的抗体或其抗体片段以激活EPO受体的步骤。所述抗体或其抗体片段不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
还在更进一步的实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中调节人促红细胞生成素受体内源性活性的方法。所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的抗体或其抗体片段以调节哺乳动物中人促红细胞生成素受体内源性活性，而不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
还在更进一步的实施方案中，本发明涉及一种治疗患有通过中和抗促红细胞生成素抗体所导致的单纯红细胞再生障碍的哺乳动物的方法。所述方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的抗体或其抗体片段以激活所述受体，其中所述抗体或其抗体片段不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
还在更进一步的实施方案中，本发明涉及药物组合物。本发明的药物组合物含有治疗有效量的抗体或其抗体片段以及药学上可接受的赋形剂。包含于所述药物组合物中的所述抗体或抗体片段在哺乳动 物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性，但不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的肽相互作用。
还在更进一步的实施方案中，本发明涉及结合并激活促红细胞生成素受体的IgG2抗体或抗体片段。该实施方案的IgG2抗体或抗体片段与任一表位结合并相互作用，所述表位涉及激活EPO受体。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体或任一其抗体片段。所述IgG2抗体可以是嵌合的、人源化的或人抗体。
还在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物中激活人促红细胞生成素受体内源性活性的方法，包含给予哺乳动物治疗有效量的本发明的IgG2抗体或抗体片段以激活所述受体的步骤。
还在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物中调节人促红细胞生成素受体内源性活性的方法，包含给予哺乳动物治疗有效量的本发明的IgG2抗体或抗体片段以调节所述受体的步骤。
还在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患发育不良的哺乳动物的方法，所述方法包含给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的本发明的IgG2抗体或抗体片段以激活所述受体的步骤。
还在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患发育不良的哺乳动物的方法，所述方法包含给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的本发明的IgG2抗体或抗体片段以调节所述受体的步骤。
还在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的本发明的IgG2抗体或抗体片段以及药学上可接受的赋形剂。
最后，本发明涉及分离的和纯化的多核苷酸和氨基酸序列。所述分离的和纯化的多核苷酸序列选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、 SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56及其片段、互补物和简并密码子等价物。
本发明进一步涉及分离的和纯化的氨基酸序列，选自：SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID N0：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68及其片段和互补物。
附图简述
图1显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：69和SEQ ID NO：70)和人抗体Ab12的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：71-74。恒定区的序列单独显示于SEQ ID NO：75。可变链末端位于核苷酸1283。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸1284-1289。恒定区位于核苷酸1290-2826。
图2显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：76和SEQ ID NO：77)和人抗体Ab12的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：78。恒定区的序列单独显示于SEQ ID NO：79。可变链末端位于核苷酸1363。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸1364-1369。恒定区位于核苷酸1370-1618。
图3显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：80和SEQ ID NO：81)和人抗体Ab198的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：82和SEQ ID NOS：72-74。可变链末端位于核苷酸1304。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸1305-1310。恒定区位于核苷酸1311-2847。
图4显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：83和SEQ ID NO：84)和人抗体Ab198的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：78。可变链末端位于核苷酸1351。 可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸1352-1357。恒定区位于核苷酸1358-1606。
图5显示了Ab12与125I标记的EPO对与中国仓鼠卵巢细胞表达的重组EPO受体结合的竞争。
图6显示了使用Ab12和Ab198的EPO依赖性人细胞增殖试验的结果。
图7显示了Ab12在4℃下储存20天后，在诱导F36E细胞增殖中仍有活性。
图8显示了Ab12诱导从人36+祖细胞形成CFU-E(集落生成单位-红细胞系)。
图9显示了用Ab198诱导人红细胞系产生细胞增殖。
图10显示了Ab198诱导短尾猴(cynomologous)骨髓源性红细胞系祖细胞CFU-E集落的形成。
图11显示了Ab12并不与SE-3肽相互作用。Ab71A与SE-3肽相互作用。
图12显示了原代杂交瘤分泌的人Abs诱导F36E细胞的增殖。
图13显示了原代杂交瘤分泌的人Ab上清液与完整EPO受体相互作用，但不与SE-3肽相互作用。
图14显示了不同浓度的Ab12对UT7/EPO细胞增殖的活性。
图15显示了不同浓度的Ab198对UT7/EPO细胞增殖的活性。
图16显示了不同浓度的Ab198(具有或不具有二级羊抗人FC抗体添加物)对UT7/EPO细胞生长和增殖的活性。
图17显示了不同浓度的Ab12(具有或不具有二级羊抗人FC抗体添加物)对UT7/EPO细胞生长和增殖的活性。
图18是在本发明中称为ABT2-SCX-003的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图18A(SEQ ID NO：10)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图18B(SEQ ID NO：11)显示了由图18A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图18C(SEQ ID NO：12)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图18D(SEQ ID NO：13)显示了由图18C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图19是本发明中称为ABT2-SCX-012(在本文中也称为Ab12)的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图19A(SEQ ID NO：2)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图19B(SEQ ID NO：3)显示了由图19A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图19C(SEQ ID NO：4)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图19D(SEQ ID NO：5)显示了由图19C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图20是在本发明中称为ABT2-SCX-022的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图20A(SEQ ID NO：14)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图20B(SEQ ID NO：15)显示了由图20A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图20C(SEQ ID NO：16)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图20D(SEQ ID NO：17)显示了由图20C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图21是在本发明中称为ABT2-SCX-054的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图21A(SEQ ID NO：18)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图21B(SEQ ID NO：19)显示了由图21A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图21C(SEQ ID NO：20)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图21D(SEQ ID NO：21)显示了由图21C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图22是在本发明中称为ABT2-SCX-060的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图22A(SEQ ID NO：10)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图22B(SEQ ID NO：11)显示了由图22A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图22C(SEQ ID NO：22)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图22D(SEQ ID NO：23)显示了由图22C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图23是在本发明中称为ABT2-SCX-102的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图23A(SEQ ID NO：10)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图23B(SEQ ID NO：11)显示了由图23A所示的核苷酸序列编码的氨 基酸序列，图23C(SEQ ID NO：24)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图23D(SEQ ID NO：25)显示了由图23C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图24是在本发明中称为ABT2-SCX-135的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图24A(SEQ ID NO：10)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图24B(SEQ ID NO：11)显示了由图24A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图24C(SEQ ID NO：26)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图24D(SEQ ID NO：27)显示了由图24C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图25是在本发明中称为ABT2-SCX-145的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图25A(SEQ ID NO：10)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图25B(SEQ ID NO：11)显示了由图25A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图25C(SEQ ID NO：28)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图25D(SEQ ID NO：29)显示了由图25C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图26是在本发明中称为ABT2-SCX-198(在本文中也称为Ab198)的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图26A(SEQ ID NO：6)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图26B(SEQ ID NO：7)显示了由图26A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图26C(SEQ ID NO：8)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图26D(SEQ ID NO：9)显示了由图26C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图27是在本发明中称为ABT2-SCX-254的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图27A(SEQ ID NO：30)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图27B(SEQ ID NO：31)显示了由图27A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图27C(SEQ ID NO：32)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图27D(SEQ ID NO：33)显示了由图27C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图28是在本发明中称为ABT2-SCX-267的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图28A(SEQ ID NO：34)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图28B(SEQ ID NO：35)显示了由图28A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图28C(SEQ ID NO：36)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图28D(SEQ ID NO：37)显示了由图28C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图29是显示了根据本发明产生的抗EPOr mAbs的重链可变区氨基酸序列比对的表格，显示了它们相关的胚系可变区序列和鉴定的骨架区以及互补决定区。
图30是显示了根据本发明产生的抗EPOr mAbs的轻链可变区氨基酸序列比对的表格，显示了它们相关的胚系可变区序列和鉴定的骨架区以及互补决定区。
图31是比较在不同浓度下，γ-1Ab12单克隆抗体(Mab)和γ-2Ab12Mab对F36e人红白血病细胞系的红细胞生成活性的图。
图32是显示了用载体、Epogen(5U)或Ab12抗体(5或50μg)的多剂量给药法处理的转基因小鼠中网织红细胞百分数和红细胞比容百分数的增加的图。
图33是显示了用不同浓度的AranespTM或Ab12的周剂量给药法(超过3周)处理的转基因小鼠中网织红细胞百分数的增加的图。
图34是显示了用不同浓度的AranespTM或Ab12的单或周剂量给药法处理的转基因小鼠中网织红细胞百分数的增加的比较图。
图35是在本发明中称为ABT2-SCX-390的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图35A(SEQ ID NO：38)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图35B(SEQ ID NO：39)显示了由图35A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图35C(SEQ ID NO：40)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图35D(SEQ ID NO：41)显示了由图35C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图36是在本发明中称为ABT2-SCX-412的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图36A(SEQ ID NO：42)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图 36B(SEQ ID NO：43)显示了由图36A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图36C(SEQ ID NO：44)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图36D(SEQ ID NO：45)显示了由图36C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图37是在本发明中称为ABT2-SCX-430/432的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图37A(SEQ ID NO：46)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图37B(SEQ ID NO：47)显示了由图37A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图37C(SEQ ID NO：48)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图37D(SEQ ID NO：49)显示了由图37C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图38是在本发明中称为ABT2-SCX-467的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图38A(SEQ ID NO：50)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图38B(SEQ ID NO：51)显示了由图38A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图38C(SEQ ID NO：52)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图38D(SEQ ID NO：53)显示了由图38C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图39是在本发明中称为ABT2-SCX-484的细胞系表达的人抗EPO-R抗体的重链和轻链可变区核苷酸和氨基酸序列的一系列代表，图39A(SEQ ID NO：54)显示了编码重链可变区的核苷酸序列，图39B(SEQ ID NO：55)显示了由图39A所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，图39C(SEQ ID NO：56)显示了编码轻链可变区的核苷酸序列，以及图39D(SEQ ID NO：57)显示了由图39C所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图40是显示了根据本发明产生的抗EPOr mAbs的重链可变区氨基酸序列比对的表格，显示了它们相关的胚系可变区序列和鉴定的骨架区以及互补决定区。
图41是显示了根据本发明产生的抗EPOr mAbs的轻链可变区氨基酸序列比对的表格，显示了它们相关的胚系可变区序列和鉴定的骨架区以及互补决定区。
图42显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：86和SEQ ID NO：87)和人抗体Ab390的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：88和SEQ ID NOS 72-74。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-2006。
图43显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：89和SEQ ID NO：90)和人抗体Ab390的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：91。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-718。
图44显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：92和SEQ ID NO：93)和人抗体Ab412的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：94和SEQ ID NOS 72-74。可变链末端位于核苷酸469。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸470-475。恒定区位于核苷酸476-2012。
图45显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：95和SEQ ID NO：96)和人抗体Ab412的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：97。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-718。
图46显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：98和SEQ ID NO：99)和人抗体Ab432的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：100和SEQ ID NOS 72-74。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-2006。
图47显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：101和SEQ ID NO：102)和人抗体Ab430的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：103。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-718。
图48显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：104和SEQ ID NO：105)和人抗体Ab467的重链氨基酸序 列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：106和SEQ ID NOS 72-74。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-2006。
图49显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：107和SEQ ID NO：108)和人抗体Ab467的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：109。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-718。
图50显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：110和SEQ ID NO：111)和人抗体Ab484的重链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：112和SEQ ID NOS 72-74。可变链末端位于核苷酸469。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸470-475。恒定区位于核苷酸470-2012。
图51显示了分离的和纯化的多核苷酸(顶链和底链分别为SEQID NO：113和SEQ ID NO：114)和人抗体Ab484的轻链氨基酸序列。所述氨基酸序列包含SEQ ID NOS：115。可变链末端位于核苷酸463。可变/恒定连接区(下划线)位于核苷酸464-469。恒定区位于核苷酸470-718。
发明详述
定义
本文中使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”指属于多克隆、单克隆、嵌合和人或人源化种类的单链、双链和多链蛋白质及糖蛋白。术语“抗体”也包括合成的及其基因工程变体。
本文中使用的术语“抗体片段”指Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段，也指对于至少一个所期望表位具有特异性的抗体的任何部分。
本文中使用的术语“γ-2”、“γ-2同种型”或“IgG2”指免疫球蛋白G(IgG)亚类2，也指其任一抗体片段。IgG分子的四种亚类为本领域技术人员所充分鉴定并众所周知(参见例如，MolecularBiology of the Cell，第2版，Bruce Alberts等.，1989)。可获得识别所有人同种型(IgA、IgG、IgD、IgE和IgM)及人免疫球蛋白亚同种型(IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的一系列单克隆抗体。
本文中使用的术语“人源化抗体”指源自非人抗体(即鼠)的保持或基本上保持亲本抗体抗原结合特性，但在人中具有较低免疫原性的抗体。
本文中使用的术语“人抗体”指具有源自人胚系免疫球蛋白序列的序列的抗体，例如源自具有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(如，小鼠)、人噬菌体展示文库或人B细胞的抗体。
本文中使用的术语“表位”指决定能特异性结合抗体或T细胞受体的任何蛋白质。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性基团组成，通常具有特定的三维结构特征，和特定的带电特性。
本文中使用的术语“内源性”指相对于来自外部的产物或活性，在身体或细胞中出现的产物或活性。
本文中使用的术语，多核苷酸“源自”或“特异于”指定序列指包含大约至少6个核苷酸、优选至少约8个核苷酸、更优选至少约10-12个核苷酸、以及甚至更优选至少约15-20个核苷酸的连续序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列相应于所指定核苷酸序列的区域，即与之同一或互补。所述序列可互补或同一于一种序列，所述一种序列特异于为本领域公知技术所确定的特定多核苷酸序列。来自所述序列的区域可源自，包括但不限于，编码特定表位的区域，及非翻译和/或非转录区域。
所得到的多核苷酸勿需从物理上源自研究所感兴趣的核苷酸序列，可产生自任何方法，包括，但不限于，化学合成、复制、逆转录或转录，即基于该多核苷酸所源自区域的碱基序列所提供的信息。同样地，其可表示为原始多核苷酸的有义向或反义向。此外，相应于指定序列的组合可以本领域公知的方法进行改造以符合预期用途。
本文中使用的术语“为......所编码”指对多肽序列编码的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有至少3-5个氨基酸、更优选至少8-10个氨基酸、以及甚至更优选至少15-20个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列来自为该核酸序列所编码的多肽。也包括与为所述序列所编码的多肽可看作具相同免疫性的的多肽序列。因此，“多肽”、“蛋白质”或“氨基酸”序列与本发明的抗体具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。此外，本发明的抗体与本发明的抗体的多肽或氨基序列可具有至少约60％、 70％、75％、80％、85％、90％或95％的相似性。本发明抗体的氨基酸序列可选自：SEQUENCE ID NOS：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57，优选的本发明抗体的氨基酸序列选自：SEQ IDNOS：3、5、7、9、51和53。
本文中使用的术语“重组多肽”、“重组蛋白质”或“重组技术产生的多肽”，在本文中上述术语可互换使用，描述了根据其来源或处理方式与其在自然状态下相关联的多肽的全部或部分无关的多肽和/或连接到非与其在自然状态下相连的多肽相连的多肽。重组或编码多肽或蛋白质勿需翻译自指定的核酸序列。其也可以任何方法产生，包括化学合成或重组表达系统表达。
本文中使用的术语“合成肽”指任意长度氨基酸的多聚形式，其可通过本领域众所周知的方法化学合成得到(参见美国专利4,816,513、5,854,389、5,891,993和6,184,344)。
本文中使用的术语“多核苷酸”指任意长度核苷酸的多聚形式，核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此，所述术语包括双链和单链DNA，及双链和单链RNA。也包括变体，诸如多核苷酸的甲基化物或加帽及修饰形式。术语“多核苷酸”、“寡聚体”、“寡核苷酸”和“寡(oligo)”在本文中可互换使用。
本文中使用的术语“纯化的多核苷酸”指基本上游离的感兴趣的多核苷酸或其片段，如含有小于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的与所述多核苷酸天然相关的蛋白质。用于纯化感兴趣的多核苷酸的技术为本领域众所周知，包括例如，用促溶剂破裂含有所述多核苷酸的细胞，通过离子交换层析、亲和层析以及依据密度的沉降法将所述多核苷酸与蛋白质分离。
本文中使用的术语“纯化的多肽”或“纯化的蛋白质”指基本上游离的感兴趣的多肽或其片段，如含有小于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％与所述感兴趣的多肽天然相关的细胞成分。用于纯化感兴趣的多肽的方法为本领域公知。
本文中使用的术语“分离的”指离开其原始环境(如，如果其天然存在，则为天然环境)的物质。例如，在活的动物中出现的天然存 在的多核苷酸或多肽是未分离的，但上述多核苷酸或DNA或多肽，在天然系统中分离自某些或全部的共存物质，是分离的。上述多核苷酸可以是载体和/或上述多核苷酸或多肽可以是组合物，以及由于所述载体或组合物不是其天然环境的一部分，其仍然是分离的。
本文中使用的术语“多肽”和“蛋白质“可互换使用，并指至少一种通过共价和/或非共价键连接的氨基酸分子链。所述术语不指特定长度的产物。因此，肽、寡肽和蛋白质皆包括于多肽的定义中。所述术语包括多肽的翻译后修饰，包括，但不限于，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白质片段、类似物、突变或变异的蛋白质、融合蛋白等也包括于多肽的含义中。
本文中使用的术语“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其它表示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的上述术语指可用作为或已用作为重组载体或其它转化DNA的受体，包括已被转染的原始细胞的最初后代。
本文中使用的术语“复制子”指任何遗传成分，例如质粒、染色体或病毒，其作为细胞中多核苷酸复制的独立单元。
本文中使用的术语“可操作地连接”指一种状态，其中所描述成分以一种允许它们以预期方式行使功能的关系存在。因此，例如，控制序列“可操作地连接”编码序列以这样一种方式连接，即在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。
本文中使用的术语“载体”指一种复制子，其中连接有另一种多核苷酸区段，例如使复制和/或所述附着区段表达发生的。
本文中使用的术语“控制序列”指对于影响其所连接的编码序列表达必需的多核苷酸序列。基于不同的宿主生物体，所述序列具有不同种类。在原核生物中，上述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子，以及在某些情况下，包括增强子。所述术语“控制序列”因此意在包括最低限度的其存在对于表达必需的所有成分，以及也包括其存在是有利的附加成分，例如，前导序列。
术语“转染”指外源多核苷酸导入原核或真核宿主细胞，与用于导入的方法无关。所述术语“转染”指多核苷酸稳定或瞬时导入，以及包括多核苷酸的直接摄入、转化、转导和f-接合(f-mating)。一旦 导入至宿主细胞中，外源多核苷酸可保持作为非整合复制子，例如质粒，或可选地，可整合入宿主基因组。
本文中使用的“处理”指预防和/或治疗。
本文中使用的术语“纯化的产物”指已分离自与所述产物通常相关的细胞成分或分离自可存在于感兴趣的样品中的其它类型细胞的产物的制剂。
本文中使用的术语“促红细胞生成素(EPO)受体的激活”指一种或多种EPO受体经历的导致信号转导入带受体细胞内部的分子进程。最后，该信号产生一种或多种细胞生理学改变。EPO受体的激活通常导致带有EPO受体的细胞增殖或分化，例如，但不限于，红细胞系祖细胞。许多事件与EPO受体的激活相关，例如，但不限于，受体的二聚化。
抗体的结构单元是一种四聚体。每个四聚体是由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的可变区。链的羧基末端部分定义了主要负责抗体效应器功能的恒定区。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε重链并定义为抗体同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG免疫球蛋白进一步分为分别具有γ-1、γ-2、γ-3和γ-4重链的四种亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。大多数可用于治疗的人、嵌合或人源化抗体是IgG1抗体类型，包括用于治疗乳腺癌的赫赛汀(Herceptin)、用于治疗非霍奇金淋巴瘤的Rituxan以及用于治疗风湿性关节炎的Humira和Remicade(参见Glennie，M.J.等.，Drug Discovery Today，8：503(2003))。
在轻链和重链中，可变区和核定区连接是通过“J”区与重链连接，也包括“D”区。每对轻/重链的可变区形成抗原结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点，除双功能或双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。双功能或双特异性抗体是具有两对不同重/轻链和两个不同结合位点的人工杂种抗体。双功能或双特异性抗体可使用本领域公知的常规技术进行生产。
抗体的链结构显示了相同的一般结构：三个超变区，也称为互补决定区或CDRs与相对保守的骨架区(FR)连接。来自每对两条链的CDRs通过骨架区得到排列，能与特定表位结合。从N-末端到C- 末端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
美国专利第6,319,499号公开了能结合并激活促红细胞生成素受体(EPO-R)的抗体。在该专利中明确鉴定的抗体是Mabs 71和73。Mab71结合称为“SE-3”的肽，该肽具有氨基酸序列PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)(参见实施例3)。SE-3位于人EPO-R的氨基酸残基49-78上。根据美国专利第6,319,499号所述，当EPO-R的该区域(即氨基酸残基49-79)与诸如Mab71的交联剂结合，导致EPO受体的激活。美国专利第6,319,499号实施例6陈述了较其它受测试的肽，Mab71结合“显著数量的SE-3肽”。该实施例进一步陈述了“显示Mab71与含有或重叠残基49-78的人EPO-R区结合”的情形。Mabs71和73是鼠抗体。尽管啮齿动物和人抗体都提供了精确的靶特异性，人抗体能更有效地与身体的天然防御相互作用，且不引起与啮齿动物抗体相同程度的抗抗体应答(Winter，G.和Milstein，C.Nature 349：293(1991))。此外，人IgG亚类具有不同柔性(Roux，K.H.等.，J.Immunol.159：3372(1997))，且该差异也超出了啮齿动物IgG同种型，因为啮齿动物IgG同种型不同于它们的人相似物。因为蛋白质柔性可影响抗体-抗原识别(Jimenez，R.，等.Proc.Natl.Acad Sci.USA，100：92(2003))，人IgG2同种型引发的抗原识别机制截然不同于鼠抗体的那些。鼠IgG同种型通常不同于人的那些。
在一个实施方案中，本发明涉及结合促红细胞生成素受体抗体或抗体片段。所述结合促红细胞生成素受体抗体或抗体片段包含至少一种重链，所述重链具有选自：SEQ ID NOS：3、7、11、15、19、31、35、39、43、47、51、55和其片段的氨基酸序列。在第二个实施方案中，所述结合促红细胞生成素受体抗体或抗体片段包含至少一种轻链，所述轻链具有选自：SEQ ID NOS：5、9、13、17、21、23、25、27、29、33、37、41、45、49、53、57和其片段的氨基酸序列。
在第三个实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中能结合人促红细胞生成素受体的分离的抗体。更具体地，所述抗体包含重链可变区或轻链可变区，所述可变区包含了CDR1-CDR3的连续序列。重链可变区的氨基酸序列包含选自：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61及其片段的CDR1-CDR3连续序列。轻链可变区的氨基酸序列包含选自：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68及其片段的CDR1-CDR3连续序列。此外，本发明涉及包含重链可变区或轻链可变区的分离的抗体，所述可变区包含至少一个CDR。更具体地，所述抗体包含重链可变区，所述可变区包含至少一种选自：SEQ ID NO：11氨基酸残基99-112、SEQ ID NO：3氨基酸残基26-35、SEQ ID NO：3氨基酸残基50-65、SEQ ID NO：3氨基酸残基98-105、SEQ ID NO：19氨基酸残基26-35、SEQ ID NO：19氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：19氨基酸残基99-105、SEQ IDNO：31氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：31氨基酸残基99-105、SEQID NO：39氨基酸残基26-35、SEQ ID NO：39氨基酸残基50-65、SEQID NO：39氨基酸残基98-105、SEQ ID NO：43氨基酸残基26-37、SEQ ID NO：43氨基酸残基52-67、SEQ ID NO：43氨基酸残基100-107、SEQ ID NO：47氨基酸残基26-35、SEQ ID NO：47氨基酸残基50-65、SEQ ID NO：51氨基酸残基26-35、SEQ ID NO：51氨基酸残基50-65、SEQ ID NO：51氨基酸残基98-105、SEQ ID NO：55氨基酸残基26-37和SEQ ID NO：55氨基酸残基52-67的CDR，或包含轻链可变区，所述可变区包含至少一种选自：SEQ ID NO：13氨基酸残基24-34、SEQ ID NO：13氨基酸残基50-56、SEQ ID NO：5氨基酸残基89-97、SEQ ID NO：27氨基酸残基24-34、SEQ ID NO：9氨基酸残基50-56、SEQ ID NO：33氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：33氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：41氨基酸残基24-34、SEQ ID NO：41氨基酸残基89-97、SEQ ID NO：45氨基酸残基24-34、SEQ ID NO：45氨基酸残基50-56、SEQ ID NO：45氨基酸残基89-97、SEQ ID NO：49氨基酸残基89-97和SEQ ID NO：57氨基酸残基24-34的CDR。
在第四个实施方案中，本发明涉及结合并激活促红细胞生成素受体的抗体或抗体片段。本发明的抗体结合至少一种与激活EPO受体相关的表位(实施例4)。不象本领域公知的能结合并激活促红细胞生成素受体的其它抗体或抗体片段，例如描述于美国专利第6,319,499号的抗体，本发明的抗体并不与称为SE-3的肽相互作用。令人惊奇地，本发明的抗体是红细胞生成抗体，即使该抗体不与SE-3肽结合。 因此，本发明的人抗体与至少一种较美国专利第6,319,499号所描述的抗体不同的人EPO受体表位相互作用。
在第五个实施方案中，本发明涉及结合并激活促红细胞生成素受体的IgG2抗体或抗体片段。该实施方案的IgG2抗体或抗体片段与任何激活EPO受体相关表位结合并相互作用。
此外，为BIAcore所证实的结果示于实施例1中，本发明的抗体显示了内源性人促红细胞生成素与促红细胞生成素受体结合亲和力100倍范围内的对促红细胞生成素受体的结合亲和力。已报道了由两种EPO上非等价受体结合位点产生的EPO受体对EPO高(～1nM)和低(～1μM)亲和力(参见Philo，J.S.等.，Biochemistry，35：1681(1996))。
本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(参见美国专利第6,020,153号)或人或人源化抗体或其抗体片段。本发明也涉及任一前述抗体的合成的或基因工程改造的变体(参见美国专利第6,331,415号)。无论如何，优选地，本发明的抗体是人或人源化抗体。人或人源化抗体的优点是它们潜在地减少或消除在宿主受体中抗体的免疫原性，从而允许生物利用度的增加和不利免疫反应可能性的减少，因此潜在地使多种抗体的给予成为可能。
人源化抗体包括嵌合或CDR-移植抗体。同样，人抗体可使用动物基因工程菌株生产，其中动物抗体基因表达为人抗体基因表达所抑制并功能性置换。
用于制备人源化和人抗体的方法为本领域公知。一种用于制备人抗体的方法使用了诸如转基因小鼠的转基因动物。这些转基因动物包含插入到它们自己基因组中的产生人抗体实质部分的基因组，以致在抗体生产过程中无法产生这些动物自己的内源性抗体。用于制备上述转基因动物的方法为本领域公知。上述转基因动物可使用技术或通过使用“微小基因座(minilocus)”方法进行制备。用于制备XenomiceTM的方法描述于美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、6,114,598号和6,075,181号中。用于制备使用“微小基因座(minilocus)”方法的转基因小鼠的方法描述于美国专利第5,545,807号、5,545,806号和5,625,825号中。也参见国际公开号WO93/12227。
使用技术，可通过用感兴趣的抗原免疫小鼠(Abgenix，Fremont，California)而获得人抗体。从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(例如B细胞)。这些回收的细胞可与骨髓样细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系可得到筛选和选择以鉴定产生特异于感兴趣抗原的抗体的杂交瘤细胞系。可选地，所述抗体可在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。更具体地，编码特定抗体的序列可克隆自产生所述抗体的细胞，并可用于合适的哺乳动物宿主细胞。
对于将多核苷酸导入宿主细胞而言，可通过任何公知的方法进行转化，包括，例如在病毒或病毒载体中包装所述多核苷酸并用病毒或病毒载体转导宿主细胞，或通过本领域公知的转染方法，诸如描述于美国专利第4,399,216号、4,912,040号、4,740,461号和4,959,455号中的那些。例如，一种或多种编码重链的基因可在细胞中表达，以及一种或多种编码轻链的基因可在另一个细胞中表达。然后，使用本领域公知的技术将产生的重链和轻链融合在一起以形成本发明的抗体。可选地，可使用内切核酸酶连接编码部分重链和轻链的基因以重建编码每条链的基因。接着，上述基因可在细胞中表达以产生本发明的抗体。
基于要被转化的宿主选择转化方法。用于在哺乳动物细胞中导入异源多核苷酸的方法为本领域众所周知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转柒、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸包入脂质体胶囊内和直接微注射DNA分子。
可用作为表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域众所周知，包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞、诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞、诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母细胞等。
也可使用CDR移植的方法制备人源化抗体。上述人源化抗体为本领域众所周知。一般来说，通过获得编码结合EPO受体的抗体的重链可变和轻链可变序列的核酸序列，鉴定重链可变和轻链可变序列中互补决定区或“CDR”，以及将CDR核酸序列移植到人骨架核酸 序列上以产生人源化抗体(参见，例如，美国专利第4,816,567号和第5,225,539号)。
选择适合于体内给药的人骨架，意味着其不显示免疫原性。例如，可通过之前在体内使用上述抗体以及对氨基酸相似性研究的经验来决定上述选择。
用于克隆核酸的方法为本领域公知。这些方法包括使用适当的引物通过多聚酶链式反应(PCR)扩增要被克隆的抗体序列。适于扩增抗体核苷酸序列的引物和特异性鼠重链可变和轻链可变序列为本领域公知。
一旦鉴定了要被人源化的克隆抗体序列的CDRs和FRs，鉴定编码CDRs的氨基酸序列并将相应的核酸序列移植到所选择的人FRs上。可使用公知的引物和接头进行该移植，引物和接头的选择为本领域公知。
在CDRs移植到所选择的人FRs上后，产生的“人源化”重链可变和轻链可变序列得到表达以产生结合EPO受体的人源化Fv或人源化抗体。通常而言，人源化重链可变和轻链可变序列作为融合蛋白表达，具有人恒定区结构域序列，因此获得了结合EPO受体的完整抗体。但是，所产生的人源化Fv抗体并不含有所述恒定序列。优选人恒定序列融合到人源化可变区。
使用本发明抗体结合并优选激活的EPO受体优选是哺乳动物EPO受体，最优选是人EPO受体。本发明也涉及所述EPO受体类似物的使用，诸如描述于美国专利第5,292,654号中的那些。人EPO受体可购自R&D Systems(Minneapolis，Minnesota)。
(1)结合并激活EPO受体，(2)不与具有PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的肽相互作用；以及(3)显示了内源性人EPO与EPO受体结合亲和力100倍范围内的结合亲和力的两个(2)抗体实例是称为Ab12和Ab198的人抗体。Ab12和Ab198是使用本文中所述的XenoMax技术(参见实施例1)开发的人抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本文所述抗体多核苷酸和多肽序列。优选地，上述多核苷酸编码每条重链和轻链的可变区和恒定区，尽管其它组合也为本发明所涉及。
本发明也涉及源自与这些多核苷酸互补的公开的多核苷酸和核酸序列的寡核苷酸片段。所述多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在。以DNA、eDNA、基因组DNA、核酸类似物及合成DNA形式存在的多核苷酸也包括在本发明的范围内。所述DNA可以是双链或单链的，如果是单链的，可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。所述编码多肽的编码序列可以与本文所提供的编码序列是相同的，或可以是与该编码序列不同的编码序列，由于遗传密码的冗余性或简并性，本文中提供了DNA以编码相同多肽。
优选地，所述多核苷酸编码本发明的至少一种重链可变区和至少一种轻链可变区。上述多核苷酸的实例显示于SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56及其片段、互补物和简并密码子等价物。例如，SEQ ID NO：2编码Ab12的重链(可变区)和SEQ ID NO：4编码Ab12的轻链(可变区)。SEQ ID NO：6编码Ab198的重链(可变区)和SEQ ID NO：8编码Ab198的轻链(可变区)。
本发明也包括含有修饰的多核苷酸变体，诸如多核苷酸缺失、取代或添加，以及产生自多核苷酸序列变体的任何多肽修饰。本发明的多核苷酸也可具有一种编码序列，所述编码序列是本文中所提供的编码序列天然存在的变体。
如果在多核苷酸和所述序列之间具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％同一性，预计所述多核苷酸可认为与本文所提供的序列杂交。
本发明进一步涉及编码本发明抗体的多肽及该多肽片段、类似物和衍生物。本发明的多肽可以是重组多肽、天然纯化的多肽或合成多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是其中一种或多种氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的一种物质，上述取代的氨基酸残基可以是或可以不是为遗传密码所编码的一种物质；或其可以是其中一种或多种氨基酸残基包括取代基团的一种物质；或其可以是其中多肽与另一种化合物融合的一种物质，所述另一种化合物诸如一种增加所述多肽半衰期(的化合物例如，聚乙二醇)；或其可以是其中额外的氨基酸融合到所述多肽的一种物 质，所述额外的氨基酸诸如一种前导或分泌序列或一种用于纯化所述多肽的序列或一种前蛋白序列。上述片段、衍生物和类似物都在本发明的范围内。
本发明的多肽可具有与本文所述抗体相同的氨基酸序列，或由于一个或多个氨基酸取代的微小变化而不同的氨基酸序列。所述变化可以是通常在约1-5个氨基酸范围内的“保守改变”，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，如用异亮氨酸取代亮氨酸或用丝氨酸取代苏氨酸。与此相反，变化可包括非保守改变，如用色氨酸取代甘氨酸。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者。可用本领域众所周知的计算机程序来创建用于确定哪个或多少氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不改变生物学或免疫学活性的指导，例如DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wisconsin)。
优选地，所述多核苷酸编码本发明抗体的至少一种重链可变区或至少一种轻链可变区。更优选地，所述多肽编码本发明抗体的至少一种重链可变区和一种轻链可变区。上述多肽的实例是具有显示于SEQID NOS：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、46、47、49、51、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68的氨基酸序列的那些及其片段。特别地，Ab12的重链具有显示于SEQ ID NO：3的氨基酸序列，轻链具有显示于SEQ ID NO：5的氨基酸序列。Ab198的重链具有显示于SEQ ID NO：7的氨基酸序列，轻链具有显示于SEQ IDNO：9的氨基酸序列。
本发明也提供了包括本发明多核苷酸的载体，用本发明载体基因工程的宿主细胞以及通过重组技术本发明抗体的产生方法。
宿主细胞是用诸如克隆载体或表达载体的载体基因工程的(转染、转导或转化)。所述载体可以质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式存在。所述工程的宿主细胞可在改良的以适于激活启动子、选择转染细胞等的常规营养培养基中培养。所述培养条件，例如温度、pH等等，是那些先前宿主细胞选择用于表达所使用的条件，对于本领域技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可用于产生多肽，并由此产生本发明的抗体。本发明的多核苷酸序列可包括于多种表达载体的任何一种中，具体而 言，用于表达多肽的载体或质粒。上述载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，酵母质粒，源自质粒和噬菌体DNA组合的载体，诸如牛痘、腺病毒、鸡痘病毒和伪狂犬病的病毒DNA。另一方面，任何其它质粒或载体只要其在宿主中可复制并存活就可使用。
通过不同的方法可将合适的DNA序列插入到载体中。一般而言，通过本领域公知的方法将DNA序列插入到合适的限制性内切核酸酶位点。表达载体中的多核苷酸序列可操作地与合适的表达控制序列(即启动子)连接以指导mRNA合成。上述启动子的实例包括，但不限于，LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、λ噬菌体PL启动子和其它已知用于控制原核或真核细胞或它们的病毒中基因表达的启动子。所述表达载体也包含用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。所述载体也可包括用于扩增表达的合适的序列。例如，所述载体可含有增强子，其是病毒来源的刺激转录的DNA序列，例如源自诸如SV40的猿病毒、多瘤病毒、牛乳头状瘤病毒或莫洛尼肉瘤病毒的那些，或是基因组来源的。所述载体也优选包含复制起点。可构建所述载体以包含外源复制起点，上述复制起点可源自SV40或不同的病毒来源，或为宿主细胞染色体复制机制。
此外，所述载体优选包含用于转染宿主细胞选择的标记基因，例如二氢叶酸还原酶或诸如G-418(遗传霉素，一种新霉素衍生物)或潮霉素的抗生素，或弥补诸如胸苷激酶、次黄嘌呤转磷酸核糖激酶、二氢叶酸还原酶等的缺乏的宿主细胞遗传损伤的基因。
适合用于本发明的载体为本领域公知。任何质粒或载体可用于本发明中，只要其在宿主中可复制并存活。可使用的载体的实例包括适合哺乳动物宿主和基于病毒复制系统的那些，例如猿病毒40(SV40)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳头状瘤病毒、乳头状瘤多型空泡形病毒BK突变株(BKV)或小鼠和人巨细胞病毒(CVM)。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是诸如哺乳动物细胞的高等真核细胞，或诸如酵母细胞的低等真核细胞，或所述宿主细胞可以是诸如细菌细胞的原核细胞。优选地，所述宿主细胞提供了适合活性抗体生产的环境，因为功能性四聚体抗体分子的生物合成需要正确的新生多肽链折叠、糖基化 和组装。合适的宿主细胞的实例，包括哺乳动物细胞，例如COS-7细胞、Bowes黑色素瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、胎肺细胞L-132和诸如骨髓瘤和淋巴瘤细胞的淋巴来源的哺乳动物细胞。可用包含单独编码H-链多核苷酸序列的载体、另一种单独编码轻链的载体(例如通过使用先前讨论的两种不同载体)转染所述宿主细胞。优选地，用两种不同载体转柒所述宿主细胞。
将所述载体导入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔实现(L.David等.，Basic Methods in Molecular Biology第2版，Appleton和Lang，Paramount Publishing，East Norwalk，Conn.(1994))。
为了获得本发明的抗体，一种或多种编码本发明抗体的轻链和重链可变区及轻链和重链恒定区的多核苷酸序列应当整合入载体中。编码本发明抗体的轻链和重链的多核苷酸序列可整合入一种或多种载体中，接着整合入所述宿主细胞中。
表达Ab12和Ab467的细胞系(Transfected derivative of human renalderived 293 cell line：293.12；Transfected derivative of human renal derived 293 cellline：293.467)根据布达佩斯条约的规定，于2003年9月30日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110，并获得PTA-5554和PTA-5555的保藏号。为了本领域技术人员的方便，提供了这些保藏物，但并非限定上述保藏物对于实施本发明是必需的，考虑到本发明所公开的内容，也不是限定等价的实施方案不在本领域技术范围内。这些保藏物的公众可用性并不是许可同意在本发明或任何其它专利中制造、使用或销售所保藏的物质。所保藏物质的核酸序列并入本发明公开内容中作为参考，如果与任何本文所述序列冲突的话，可作为对照。
本发明的抗体具有许多用途。一般而言，所述抗体可用于治疗任何可用促红细胞生成素或其生物学活性变体活类似物治疗的病症。例如，本发明的抗体用于治疗表现为低红细胞水平和/或减少的血红蛋白水平的病症(如贫血症)。此外，本发明的抗体可用于治疗表现为在血液或组织中减少或低于正常水平氧的病症，例如，低氧症或慢性组织缺氧和/或表现为不充分的血液循环或减少的血流量的疾病。本发明的抗体也可用于促进伤口愈合或用于保护由脑/脊髓损伤、中风等所产生的神经细胞和/或组织的损伤。用本发明抗体可治疗的病症 的非限制性实例包括贫血症，例如化学疗法所导致的贫血症、癌症相关的贫血症、慢性病的贫血症、HIV相关的贫血症、骨髓移植相关的贫血症等，心力衰竭、缺血性心脏病和肾衰竭。同样地，本发明包括治疗任一上述疾病或病症的方法，所述方法包含给予哺乳动物治疗有效量所述抗体的步骤。优选地，所述哺乳动物是人。
本发明的抗体也可用于鉴定和诊断具有功能失调EPO受体的哺乳动物。具有功能失调EPO受体的哺乳动物表现为诸如贫血症的病症。优选地，所述被鉴定和诊断的哺乳动物是人。此外，本发明的抗体可用于治疗患红细胞发育不良哺乳动物中的贫血症。红细胞发育不良可能是由于患者在用重组促红细胞生成素治疗期间中和抗促红细胞生成素抗体的形成而产生的(Casadevall，N.等.，n.Eng.J.Med.346：469(2002))。所述方法包括给予患所述发育不良和需要治疗的哺乳动物治疗有效量本发明抗体的步骤。
在本发明另一个实施方案中，本发明的EPO受体抗体和抗体片段也可用于检测EPO受体(如，在生物样品中，例如组织标本、完整细胞或其提取物)，使用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明提供了一种用于在生物样品中检测EPO受体的方法，包含将生物样品与本发明的抗体或抗体片段接触，检测任一抗体(或抗体部分)，从而在所述生物样品中检测EPO受体。用可检测的物质直接或间接标记所述抗体或抗体片段，以便于检测结合或未结合的抗体或抗体片段。可利用多种本领域技术人员众所周知的免疫测定方法(例如竞争性测定、直接或间接夹心免疫测定等)。
合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶；合适的辅基复合体的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含治疗有效量的本发明抗体以及药学上可接受载体或赋形剂的药物组合物。在本文中使用的 “药学上可接受载体”或“药学上可接受赋形剂”包括任何及全部生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗透剂和吸收延迟剂等。药学上可接受载体或赋形剂的实例包括一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合物。在许多情况下，在所述组合物中应优选包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇的多元醇或氯化钠。也包括能增加所述抗体或抗体部分的贮存期限或效力的药学上可接受物质，例如润湿剂或小量诸如润湿剂或乳化剂的辅助物质、防腐剂或缓冲液。任选地，可包括崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如海藻酸钠等。除了赋形剂之外，所述药物组合物可包括一种或多种如下成分：诸如血清白蛋白的载体蛋白、缓冲液、粘合剂、增甜剂和其它调味剂；着色剂和聚乙二醇。
本发明的化合物可以多种形式存在。它们包括，例如，液态、半固态和固态剂型，例如液态溶液(如可注射和能注入溶液)、分散液或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式依赖于预期的给药方式和疗法。通常，优选的组合物是以可注射或能注入溶液的形式存在，例如类似于用于其它抗体进行人被动免疫的那些的组合物。所述优选的给药方式是肠胃外给药(如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内给药)。在一个优选的实施方案中，所述抗体通过静脉输注或注射进行给药。在另一个优选的实施方案中，所述抗体或抗体片段通过肌肉内或皮下注射给药。
其它适合用于药物组合物的给药途径包括，但不限于，直肠、经皮、阴道、转化粘液质或肠内给药。
在制造和贮存条件下，治疗组合物通常应当是无菌和稳定的。组合物可配制为溶液、微乳剂、分散液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。无菌注射液的制备可通过将所需数量的活性化合物(即抗体或抗体片段)掺入至合适的溶剂中，所述溶剂具有上述列出成分的一种或组合，如果需要，接着进行过滤灭菌而实现。一般而言，分散液的制备可通过将活性化合物掺入至无菌载体中而实现，所述载体包含基本分散剂和其它来自那些上述列举的所需成分。就用于制备无菌注射液的无菌粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥以产生活性组分加上来自先前其灭菌过滤溶液的任何附加所需成分。可 保持适当的溶液流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过维持分散液中所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂。通过在组合物中包含诸如单硬脂酸盐和明胶的延迟吸收剂可导致可注射组合物的延迟吸收。
本发明的抗体和抗体片段可以本领域公知的多种方法给予，尽管对于许多疗法而言，优选的给药途径/方式是静脉注射或输注。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式基于所需结果的不同而不同。在某些实施方案中，所述活性化合物的制备可使用保护化合物抗快速释放的载体，例如控制释放成分，包括埋植剂、透皮贴剂和微囊递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙二醇二乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。许多用于制备上述成分的方法是取得专利权的或通常为本领域技术人员公知的(参见，如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，编辑.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978)。
在某些实施方案中，本发明的抗体和抗体部分可以口服给予，例如，使用惰性稀释剂或可吸收的食用载体。所述化合物(如果需要，和其它成分)也可包被在硬或软壳的胶囊中，压制为片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等。为给予本发明的抗体或抗体片段，可通过其它肠胃外给药法，其可能需要用物质包被化合物、或将所述物质与化合物共给予以免所述化合物失活。
补充的活性物质亦可掺入至所述化合物中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段与一种或多种附加的治疗剂共配制和/或共给予。例如，本发明的EPO受体抗体或抗体片段可与一种或多种附加的能结合其它靶的抗体(如，能结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)或一种或多种细胞因子共配制和/或共给予。此外，一种或多种本发明的可与两种或更多种前述治疗剂联合给药。上述联合治疗可有利于使用较低剂量的所要给予的治疗剂，因此避免了与不同单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
在本文中使用的术语“治疗有效量”指其给予能产生疗效的抗体或抗体片段的量。精确剂量可通过本领域技术人员来确定。本领域公知，基于年龄、体重、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和病症 严重程度的剂量调节是必需的且可为本领域技术人员通过常规实验方法所确定。治疗有效量也是一种其中抗体或抗体片段的治疗有益效果优于任何毒性或有害效果的量。“与预防相关的有效量”指在剂量上和需要达到所需预防效果的时期内的有效量。通常地，因为在受试者疾病发作前或早期阶段使用预防剂量，所以预防有效量可以小于治疗有效量。
可调整给药方案以提供最佳的所需响应(如，治疗或预防响应)。例如，可给予快速灌注剂量，在全程中给予几次分份剂量或根据紧急治疗情况的需求按比例地减少或增加剂量。以单位剂量形式配制肠胃外组合物的特别有利之处在于可易于给药和取得剂量一致性。本文中使用的剂量单位形式指适合作为单剂量用于要被测试的哺乳动物受试者的物理上分离的单位；每个单位包含通过计算以产生所需的治疗效果而预先确定数量的活性化合物和所需的药物载体。本发明对剂量单位形式的规格标准是规定自和直接基于：(a)所述活性化合物的独特特性和所要达到的特定治疗或预防效果和(b)本领域配药法的内在局限性，即上述用于治疗的活性化合物的个体敏感性。
本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的一个实例的非限制范围是0.1-20mg/kg，更优选1-10mg/kg。应当注意剂量值可随着病症类型和所要减轻的严重程度的变化而变化。还应当了解，对于任何特定的受试者而言，特定的给药方案应当根据个体需要和执行或指导所述组合物给药人士的专业判断而随时调整，在本文中所列的剂量范围仅作为例证无意于限制权利要求的组合物的范围或使用。
作为实施例，而非限制，现在将给出本发明的实施例。
实施例1：人促红细胞生成素受体抗体的产生
抗原制备。使用两种不同方法将用于免疫动物的抗原与通用的T细胞表位(TCE)(J.Immunol.，148(5)：1499(1992))偶联。含有等量的两种方法所制备物质的混合物用作为免疫原。
1)2.3mg二硫苏糖醇(DTT)和200mcg半胱氨酸偶联的TCE(J.Immunol.，148(5)：1499(1992))在室温下混合30分钟。通过离心经由Sephadex G10(Pharmacia，Upsala，Sweden)层析柱除去DTT。向还原的半胱氨酸偶联的TCE中加入200mcg重悬于磷酸盐(PBS)缓冲液(8.1mM Na2HPO4，1.6mM NaH2PO4，136mM NaCl， 2.6mM KCl，pH 7.4)中的人EpoR(R&D Systems，Minneapolis，MN)可溶胞外域和33mcg磺基琥珀酸亚胺基4-(N-马来酸亚氨甲基)-环己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)，并在4℃下混合过夜。通过离心经由截止分子量为10kDa的Centricon柱(Millipore，Bedford，MA)除去未反应的EpoR。
2)人EpoR(R&D Systems，Minneapolis，MN)可溶胞外域(200mcg)重悬于PBS中并与4mcg TCE-BPA(对苯酰苯丙氨酸)混合，在紫外光(362nM)下在室温下温育45分钟。通过离心经由截止分子量为10kDa的Centricon柱(Millipore，Bedford，MA)除去未反应的EpoR。
动物免疫。通过用上述偶联到TCE的可溶的EpoR免疫小鼠(XG2，Abgenix，Inc.，Fremont，CA和Vancouver，BC)产生本发明的单克隆抗体，包括Ab12和Ab198(在本文中也分别称为AB-ABT2-XG2-012和AB-ABT2-XG2-198)。使用20mcg抗原并以1∶1v/v与完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma，StLouis，MO)混合对每只小鼠进行初次免疫接种。使用20mcg以1∶1v/v混合有不完全弗氏佐剂(IFA)的抗原进行随后的免疫接种。具体而言，每只动物开始在尾部免疫，接着在0、14、28和42天通过腹膜内注射进行免疫。
EpoR的生物素化。300mcgEpoR(Abbott CHO细胞，源自ref#RB69084：4)重悬于990mcL PBS pH 8.6中，加入100mcg溶于DMSO(二甲基亚砜)的生物素-NHS(Pierce，Rockford，111)，在室温(RT)下温育40分钟。通过离心经由5kDa Centricon柱，用PBSpH 7.4洗柱数次以除去游离的生物素和缓冲液，接着重悬于适当体积中以使终浓度为600mcg/mL。
用于收获的动物的选择。通过ELISA测定抗EpoR抗体的滴度。将0.7mcg/ml生物素EpoR(上述的)包被在抗生物素蛋白链菌素培养板上(Sigma，St Louis，MO)，在室温下保持1小时。除去含有未结合生物素EpoR的溶液，接着所有培养板用dH2O洗5次。来自EpoR免疫动物或首次用于实验的动物的血清在2％牛奶/PBS中滴定，从最初的1∶100稀释度至1∶2稀释度，进行两次重复实验。最后一个孔为空白，培养板用dH2O洗5次。加入羊抗 人IgG Fc特异性辣根过氧化物酶(HRP)(Pierce，Rockford，IL)缀合的抗体，终浓度为1mcg/mL，在室温下保持1小时。培养板用dH2O洗5次。外加TMB发色底物(KPL，Gaithersburg，MD)对培养板显影30分钟，通过添加1M磷酸终止ELISA。获得自动物的特异性滴度通过在450nm下的光密度得到测定，并显示于表1中。该滴度代表血清稀释度的倒数，因此更高的数量就代表着对EpoR更强的体液免疫应答。
表1
  小鼠标识符  滴度  11  1600  12  12800  13  51200  14  102400  15  102400  16  0  17  102400  18  3200  19  102400  20  2560
基于表1中的血清学数据，选择动物14用于收获。
B细胞的培养和选择。培养来自收获的动物的B细胞，那些分泌EpoR特异性抗体的细胞基本上得到分离，如Babcook等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848(1996)所描述的。如上所述进行测定血清滴度的ELISA，用于鉴定EpoR特异性孔。用生物素EpoR筛选以500细胞/孔培养的50个培养板，以鉴定抗原特异性孔。数据显示于表2中，证明了存在701个ODs明显大于背景(0.05)的孔。
表2
  光密度  阳性数量  0.1  701  0.2  273  0.3  163  0.4  130  0.5  102  0.6  91  0.7  76  0.8  70  0.9  67  1.0  65  2.0  25  3.0  7
这些数据显示了频率十分低的命中，并显示了对于抗原特异性而言孔是单克隆的。用生物素EpoR对这些701个阳性孔进行重筛选，发现137个孔(在下表3中以粗体显示)重复作为真实的抗原特异性孔，具有明显大于背景(0.05)的ODs。
表3
  光密度  阳性数量  0.1  207  0.15  137  0.2  110  0.3  94  0.4  85  0.5  79  0.6  71  0.7  63  0.8  57  0.9  53  1.0  50  2.0  32  3.0  13
激动剂活性测定。将Epo响应细胞系的增殖用作为激动剂筛选的基础。接着，使用人红白血病细胞系UT-7/Epo(Abbottref#.RB29454-174)对这些137个孔的激动剂活性进行筛选。将12.5mcL上清液加入到96孔培养板一半区域中，每孔1x105个细胞，加入RPMI 1640(10％FCS)，以达到50mcL终体积。孔尺寸为典型的96孔培养板的一半面积。目测鉴定增殖并与培养液中细胞比较， 包含人Epo的滴定，或无Epo作为对照基线。具有增殖活性的11个孔得到鉴定。
EpoR特异性溶血空斑试验。进行该试验需要许多专门的试剂。
这些试剂制备如下：
绵羊红细胞(SRBC)的生物素化：SRBC贮存于RPMI培养液中作为25％母液。通过抽取1.0ml母液于15-ml falcon试管中，旋压细胞并除去上清液，获得了250ul SRBC压紧细胞片。接着，在50ml试管中将细胞片重悬于4.75ml pH 8.6PBS。在一个单独的50ml试管中，将2.5mg磺基-NHS生物素加入到45ml pH 8.6PBS中。一旦生物素完全溶解，加入5ml SRBCs，将试管在室温下旋转1小时。SRBCs在3000g下离心5分钟，除去上清液，用25mls pH 7.4 PBS洗涤。重复3次洗涤循环，接着将4.75ml免疫细胞培养液(含10％FCS的RPMI 1640)加入到250ul生物素化-SRBC(B-SRBC)细胞片中，轻轻地重悬B-SRBC(5％B-SRBC母液)。母液贮存在4℃直到需要使用。
B-SRBC的抗生物素蛋白链菌素(SA)包被：将1ml 5％B-SRBC母液转移至新的微量离心管中。在微型夏普列斯超速离心机(microfuge)中以8000rpm(6800rcf)脉冲旋转使B-SRBC细胞沉淀成为颗粒状，除去上清液，细胞片重悬于1.0ml pH 7.4PBS，重复离心。重复2次洗涤循环，接着，将B-SRBC细胞片重悬于1.0ml pH7.4PBS中，以达到5％(v/v)的终浓度。加入10ul 10mg/ml抗生物素蛋白链菌素(CalBiochem，San Diego，CA)母液，混合试管并在室温下旋转20分钟。重复洗涤步骤，SA-SRBC重悬于1ml pH 7.4 PBS(5％(v/v))。
SA-SRBC的EpoR包被：用10ug/ml的生物素化EpoR包被SA-SRBC，混合并在室温下旋转20分钟。如上，用1ml pH 7.4 PBS洗涤SRBC两次。将EpoR包被的SRBC重悬于RPMI(+10％FCS)中至终浓度5％(v/v)。
通过免疫荧光检验法(IF)测定EpoR-SRBC的品质：将10ul 5％SA-SRBC和10ul 5％PTH包被的SRBC分别加入到新的1.5ml微量离心管中，离心管中含有40ul PBS。将鼠抗EpoR抗体(R&D SystemsCat.#.MAB307)加到每个SRBCs样品中，浓度达到20ug/ml。将试 管在室温下旋转25分钟，接着用100ul PBS洗涤细胞3次。将细胞重悬于50ul PBS中，并与40mcg/mL Alexa488(Molecular Probes，Eugene，OR)缀合的Gt-抗小鼠IgG Fc抗体温育。将试管在室温下旋转25分钟，接着用100ul PBS洗涤，将细胞重悬于10ul PBS中。将10ul的染色的细胞点在清洁的玻璃载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，在荧光下观察，打分为0-4的任意标度。
血浆细胞的制备：收获通过先前试验鉴定的单一微量细胞培养孔的内容物，其含有分泌感兴趣免疫球蛋白的B细胞克隆。使用100-1000ul自动移液器，通过添加37C R PMI(+10％FCS)回收孔内容物。通过移液重悬细胞，接着转移至新的1.5ml微量离心管中(终体积大约为500-700ul)。在室温下，细胞在微型夏普列斯超速离心机上以1500rpm(240rcf)离心2分钟，接着试管旋转180度并以1500rpm旋转2分钟。除去结冰的培养液，将免疫细胞重悬于100ul RPMI(10％FCS)中，接着离心。重复用RPMI(10％FCS)洗涤，将细胞重悬于60ul RPMI(FCS)中，贮存在冰上备用。
噬菌斑测定：预先准备具有硅氧烷边缘的载玻片(2x3英寸)，使之在室温下保藏过夜。在使用该载玻片前，用大约5ul SigmaCoat(Sigma，Oakville，ON)均匀地擦拭玻璃表面，使之干燥，接着用力擦拭。将60ul细胞样品加到60ul每个EpoR包被的SRBC(5％v/v母液)、配制于含10％FCS的RPMI中的4x豚鼠补体(Sigma，Oakville，ON)母液，和4x增强血清母液(在含10％FCS的RPMI中，1∶900)中。将混合液(3-5ul)点在制备的载玻片上，并用未稀释的石蜡油覆盖斑点。载玻片在37℃下最少温育45分钟。
噬菌斑测定结果：通过使用MAB307检测包被的免疫荧光显微术定性检测的包被应当是十分高的(4/4)，相比而言，二级检测试剂仅为(0/4)。使用MAB307抗体对仅包被有抗生物素蛋白链菌素的红细胞检测，没有检测到信号(0/4)。接着，这些红细胞被用于鉴定来自表4中所鉴定的14个孔的抗原特异性血浆细胞。在显微操作以拯救抗原特异性血浆细胞后，在单个血浆细胞上通过RT-PCR，编码可变区基因的基因得到拯救。
表4

表达。在单个血浆细胞分离后，抽提mRNA，进行逆转录酶PCR以产生cDNA。使用多聚酶链式反应特异性扩增编码可变重链和轻链的cDNA。将可变重链区克隆至IgG2表达载体。通过将人IgG2恒定区克隆至pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点以产生该载体。将可变轻链区克隆至IgK表达载体。通过将人IgK恒定区克隆至pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位点以产生该载体。接着，将适当配对的重链和轻链表达载体共脂质转染入60mm培养皿中，该培养皿中为70％汇合的人胚肾293细胞，让转染的细胞持续分泌重组抗体24小时。从HEK 293细胞中收获上清液(3mL)，用特异性检测人IgG的夹心ELISA来证明完整抗体(AB-ABT2-XG2-012和AB-ABT2-XG2-198)的分泌物(表5，第4栏)。用ELISA通过重组抗体与生物素化EpoR的结合来评估 AB-ABT2-XG2-012和AB-ABT2-XG2-198的特异性，(表5，第5栏)。
表5
  孔标识符  单细胞编号  分泌物  结合  11G10  ABT2-SCX-254  1∶4  1∶8  21D1  ABT2-SCX-054  ＞1∶64  ＞1∶64  25C3  ABT2-SCX-135  1∶4  1∶4  29G8  ABT2-SCX-003  ＞1∶64  ＞1∶64  33G8  ABT2-SCX-012  ＞1∶64  ＞1∶64  37A11  ABT2-SCX-022  ＞1∶64  ＞1∶64  43H12  ABT2-SCX-198  ＞1∶64  ＞1∶64  16F7  ABT2-SCX-267  ＞1∶64  ＞1∶64  24C3  ABT2-SCX-060  ＞1∶64  ＞1∶64  24F8  ABT2-SCX-102  ＞1∶64  ＞1∶64  34D4  ABT2-SCX-145  ＞1∶64  ＞1∶64
对抗原特异性抗体分泌物而言，ELISA按如下进行。用2mg/mL羊抗人IgG H+L O/N包被对照培养板。对于结合培养板而言，将生物素-EpoR(0.7mcg/mL)包被在抗生物素蛋白链菌素96孔培养板(Sigma，St Louis，MO)上，在室温下保持1小时。培养板用dH2O洗5次。来自未稀释的微脂质转染上清液对7个孔的重组抗体以1∶2滴定。培养板用dH2O洗5次。加入HRP缀合的羊抗人IgG Fc特异性抗体，终浓度至1ug/mL，在室温下保持1小时，用于分泌物和结合ELISA。培养板用dH2O洗5次。添加TMB发色底物(KPL，Gaithersburg，MD)对培养板显影30分钟，通过添加1M磷酸终止ELISA。分析每块ELISA培养板以测定在450nm下每个孔的光密度。
AB-ABT2-XG2-012和AB-ABT2-XG2-198的纯化。对于大规模生产而言，将重链和轻链表达载体(2.5ug每条链/皿)脂质转染入10个100mm培养皿中，培养皿中为70％汇合的HEK 293细胞。转染细胞在37℃下温育4天，收获上清液(6mL)，并用6mL的新鲜培养液置换。在第7天，分离上清液，并与最初的收获物混合(120mL，总共来自10个培养皿)。使用蛋白Sepharose(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)亲和层析(1mL)从上清液中纯化ABT2-XG2-012 和ABT2-XG2-198抗体。用500mcL 0.1M pH 2.5甘氨酸将抗体从蛋白-A柱上洗脱下来。洗脱液在pH 7.4 PBS中透析并过滤灭菌。使用非还原SDS-PAGE分析抗体以评估纯度和产率。
重组抗体的激动剂活性。使用UT-7/Epo细胞检测这些重组抗体刺激Epo响应细胞的增殖，根据如上所述的激动剂活性测定方法，通过在490nm下测量MTS试剂(Promega，Madison，WI)对增殖定量。与培养液中无抗体的细胞比较，ABT2-SCX-012和ABT2-SCX-198引起增殖，显示如下(分别于图14和15)。
抗人Fc的影响。ABT2-SCX-012和ABT2-SCX-198的激动剂活性有可能是基于自聚集。为了求证该观点，我们通过添加抗人Fc二抗诱导了聚集，使用UT-7/Epo细胞测定了对ABT2-SCX-012和ABT2-SCX-198激动剂活性的影响。显示如下，二抗的添加不影响ABT2-SCX-198的活性(图16)，但抑制了ABT2-SCX-012的活性(图417)。
因为添加二级抗体抑制了ABT2-SCX-012的活性，所以我们推测该抗体的聚集干扰其活性，因此ABT2-SCX-012基于聚集而具有激动剂活性是不太可能的。但是，ABT2-SCX-198的结果却更难以解释。缺乏能暗示ABT2-SCX-198是完全聚集的结果，因此添加二级抗体并不能进一步影响其活性。可选地，也缺乏能暗示通过应用二抗ABT2-SCX-198活性而不受构象限制微扰的结果。
ABT2-SCX-012和ABT2-SCX-198的序列分析。对抗体ABT2-SCX-012和ABT2-SCX-198的可变重链和可变轻链测序以确定它们的DNA序列。对于抗EpoR抗体而言，完整的序列信息显示于图1、2中，图18-30显示了重链γ和κ轻链的每个可变区的核苷酸和氨基酸序列。图1和2提供了全长序列，包括恒定区。
对可变重链序列分析以确定VH家族、D区序列和J区序列。接着将序列翻译以确定一级氨基酸序列(图29)，并与胚系VH、D和J区序列比较以评估体细胞高度突变。所有抗EpoR抗体γ链的一级氨基酸序列显示于图16中。胚系序列显示在上方，突变用新的氨基酸序列标明。未改变的氨基酸用破折号(-)标明。分析轻链，类似于测定V和J区，并鉴定任何来自胚系κ序列的体细胞突变(图30)。显示了ABT2-SCX-012的重链利用了VH 4-59(DP-71)、DIR4rc和 JH4a区段，同时显示了其轻链利用了VkI(A30)和Jk1基因区段。显示了ABT2-SCX-198的重链利用了VH3-30(V3-30)、D4-23和JH6b基因区段，同时显示了其轻链利用了VkI(L5)和Jk3基因区段。
实施例2：Ab12与125I标记的EPO对CHO细胞表达的重组EPO受体结合的竞争
在试验前72小时，表达全长重组人EPO受体的CHO细胞以5×105细胞/孔置于24孔培养板中。在试验日，95ul Ab12、Ab198或Epo按规定浓度(示于图5)稀释于RPMI 1640，0.5％BSA，1mM NaN3和5ul(6ng)125I-EPO(Amersham Cat.#IM178，Arlington Heights，IL486ci/mM)中，添加到孔中。在37℃下温育1.5小时，用冷HBSS洗孔3次，使用0.5ml 0.1N NaOH收获。在Micromedic ME Plus γ计数器中对样品计数，结果显示对于与促红细胞生成素受体结合而言，Abs12和198与EPO竞争。
实施例3：Biacore研究
该研究描述如下，在Biacore 2000上进行，使用Biacontrol 3.1版软件(Biacore，Uppsala，Sweden)。将抗体直接固定在芯片表面，接着注射不同浓度的受体以进行结合分析。
抗体的固定化
使用Biacore软件包中的常规固定化程序进行抗体的固定化。在补充的乙酸缓冲液中将抗体稀释到10ug/mL，以预筛选用于固定化的合适的pH。对于固定化来说，抗体在合适的乙酸缓冲液(10mMpH 4.0乙酸)中稀释，并在三种不同蛋白质水平(500，1000和1500RU)下，使用标准的EDC化学作用直接偶联到芯片表面。用EDC对第四种流动的细胞模拟偶联，对羧基基团加帽，并提供了作为阴性对照的背景表面。
结合研究
通过在芯片表面(500RU固定的蛋白质)连续注射不同浓度的可溶人EPO受体进行结合研究。在补充的HBS-EP缓冲液[HBS缓冲液-10mM HEPES pH＝7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20(v/v)，Biacore]中，使用稀释到所需浓度(10-200nM)的受体，使用电泳缓冲液(HBS-EP)进行结合分析。在30uL/min的 流速下进行试验。受体注射3分钟后，接着解离15分钟。同时也注射流动的细胞以创建阴性对照。所有注射重复3次。
模型拟合
数据利用BiaEvaluation 3.0.2软件包(Biacore)进行对模型的拟合。来自试验注射的数据点通过将数据点减去同时在阴性对照表面上出现的得到校正。将校正的数据与1∶1(Langmuir)结合模型以及由BiaEvaluation软件包所得的二价结合物模型拟合。从与Langmuir结合模型的拟合中直接计算解离常数。对于二价分析物模型而言，使用动力学解离和动力学结合常数(kd和ka)的计算值间接计算解离常数。
表6
  抗体  kD  Ab12  17.5nM  Ab198  13.9nM
实施例4：EPO依赖性人细胞增殖试验
人红白血病细胞系的储用培养物，F36E细胞保持在含有10％胎牛血清和1单位/毫升的重组人促红细胞生成素的RPMI 1640培养液中。在试验前，培养细胞过夜，在不含有EPO的生长培养液中密度为4.0-5.0×105细胞/毫升。回收细胞，洗涤并以1.0×106细胞/毫升的密度重悬于试验培养液(RPMI 1640+10％FBS)中，将50uL细胞加到96孔微量培养板的孔中。将50uL试验培养液中的Ab12、Ab390、Ab412、Ab467、Ab484、Ab430/432和Ab198或EPO标准(重组人EPO(rHuEPO))分别加到孔中，将培养板在潮湿的保温箱于37℃，5％CO2气氛中温育。72小时后，20μL Promega CellTiter 96试剂(根据制造商的说明书进行制备，Madison，Wisconin)加到所有孔中。培养板于37℃，5％CO2气氛中温育4小时，使用全自动定量绘图酶标仪(microplate reader)(Wallac Victor1420 Multilabel Counter，Wallac Company，Boston，MA)在490nm处测定光密度。结果显示于图6中。所有Abs都刺激F36E细胞系的增殖。最大增殖活性类似于用EPO作对照所观察到的结果，显示为随着浓度增加的钟形曲线。图7中的结果证明了Ab12，在4℃下贮存20天后，具有诱导F36E细胞增殖的活性。增殖活性类似于用EPO 作对照所观察到的结果，具有较基本摩尔等价物不同的约10倍的最大效应。
实施例5：人CD36+CFUe测定
对获得自Poietics(Biowhittaker(Walkersville，MD))的冷冻的人CD36+红细胞系组细胞解冻，在IMDM-2％FBS中密度为104细胞/毫升。将0.3ml细胞(0.3ml)加到试管中，该试管含有2.4mlMethocult(StemCell Technologies，Vancouver，Canada，Cat.#04230)，0.3ml干细胞生长因子(Sigma，St.Louis，Missouri Cat.#S7901，100ug/ml)和0.3ml EPO(R&D Systems)、Ab12或IMDM-2％FBS。混合后，将1.1ml Methocult悬浮液加到35mm非组织培养物处理的无菌皮氏培养皿中，在37℃，5％CO2下温育2周。用显微镜鉴定克隆。结果显示于图8中。特别地，Ab12诱导从人CD36+组细胞形成CFU-E集落。通过显微镜鉴定的集落是红色的。该集落的尺寸和数量较用EPO作对照所观察到的那些减少了，大概是由于减少的增殖信号的缘故。
实施例6：液体培养物中红细胞生成活性的证实
使用指导CD34+组细胞分离试剂盒(Miltenyi，Auburn，CA)从人外周血中富集CD34+细胞。回收的细胞用α-培养液洗涤2次，重悬于悬浮培养液(补充有30％FCS、1％去离子BSA、10-5M巯基乙醇、10-6M地塞米松、0.3mg/mL人hollo转铁蛋白和10ng/mL人重组干细胞因子的α-培养液)中。细胞以1×104细胞/毫升密度移至两个相同的6孔微量培养板中，微量培养板含有浓度范围从0.1-100ng/mL的测试抗体。培养板在37℃和5％CO2下温育2周。回收来自每个孔的两份样品用于细胞计数，并用联苯胺染色(参考文献Fibach，E.，1998 Hemoglobin，22：5-6，445-458)。
结果显示于图9中。具体而言，Ab198诱导了源自祖细胞的人红细胞系生成细胞以剂量依赖方式的增殖。增殖细胞的数量和表达血红蛋白的百分数，通过用联苯胺染色指示，与EPO处理的对照比较再次减少，大概是由于减少的增殖信号的缘故。
实施例7：短尾猴骨髓CFUe测定
从短尾猴中获得骨髓并用PBS以1∶2稀释。3ml稀释的骨髓在6ml的淋巴细胞分离剂(Gibco(Invitrogen)，Carlsbad，CA Cat. #1001967)上分层，以2700rpm离心20分钟，回收淡黄色层，在10mlIMDM-2％FBS中稀释。将细胞离心并以106细胞/毫升重悬于IMDM-2％FBS中。将细胞(0.3ml)加到试管中，该试管含有2.4mlMethocult(StemCell Technologies，Vancouver，Canada，Cat.#04230)、0.3ml干细胞生长因子(Sigma，Cat.#S7901，100ug/ml)、0.3ml EPO(R& D Systems，Minneapolis，Minnesota)、测试抗体(Ab198)或IMDM-2％FBS。混合后，将1.1ml Methocult悬浮液加到35mm非组织培养物处理的无菌皮氏培养皿中，在37℃、5％CO2下温育2周。用显微镜鉴定集落。试验结果显示于图10中，证实了Ab198诱导CFU-E集落的形成(尽管于用EPO作对照所观察到的结果比较，许多集落减小了)。
实施例8：用ELISA测定与SE-3肽的结合
96孔聚苯乙烯培养板(Dynatec(Elk Grove Village，IL)Immunolon 4)用80ul 5ug/ml的可溶EPO受体(sEPOR)(R&DSystems(Minneapolis，MN)Cat.#307-ER/LF)包被，或SE-3肽(PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHWAPTARGAV)(描述于美国专利第6,319,499号)稀释于0.015M Na2CO3、0.035M pH 9.4 NaHCO3中，在室温下保持2小时并在4℃下过夜。培养板用100ul溶于PBS中的5％BSA(Gibco(Invitrogen(Carlsbad，CA))Cat.#10010)在室温下封闭30分钟。在除去封闭溶液后，向孔中加入50ul Ab12，Ab12以5ug/ml溶于含1％BSA的PBS中，培养板在室温下温育2小时。培养板用含PBS/0.05％Tween 20的Skatron 400培养板洗液洗涤3次，向孔中加入50ul稀释于PBS/0.25％BSA/0.05％Tween 20中的二抗。对于Ab12而言，使用1∶1000稀释的羊抗人IgG(Fc)-HRP(Caltag(Burlingame，CA)Cat.#H10507)，对于Ab 71A(获得自美国典型培养物保藏中心HB11689，也描述于美国专利第6,319,499号)而言，使用1∶5000稀释的羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP(JacksonLaboratories(West Grove，PA)Cat.#115-035-164)。室温温育1小时后，如前所述，培养板洗涤3次，向每个孔中加入50ul OPD显影试剂(Sigma #P9187)。通过向孔中添加50ul 1N HCl终止颜色显影，在Victor 1420 Multi-Label计数器上在490nm处测量光密度。
图11显示了Ab12不与SE-3肽相互作用(即结合)。Ab 71A与SE-3肽相互作用(即结合)，Abs 12和71A都与固定化促红细胞生成素受体相互作用。
实施例9：EPO依赖性增殖测定
原代杂交瘤上清液在试验培养液中稀释，测试它们刺激F36E人红白血病细胞增殖的能力，如实施例5所描述。5种原代上清液的结果显示于图12中。这些样品刺激F36E细胞的增殖。
实施例10：用ELISA测定杂交瘤上清液与SE-3肽的结合
测试42种原代杂交瘤上清液与固定化EPO受体或SE-3肽的结合能力，如实施例10所描述。图13显示了尽管所有的杂交瘤上清液都测试与固定化EPO受体相互作用，但是仅有样品16与SE-3肽相互作用，高于背景水平。
实施例11：γ-1 Ab12对γ-2 Ab12红细胞生成活性的比较
进行增殖测定(如实施例4所描述)以比较γ-1 Ab12和γ-2 Ab12对F36e人红白血病细胞的红细胞生成活性。结果显示于图31中。如图31所显示，γ-2 Ab12较γ-1 Ab12在刺激F36E细胞系增殖方面更有效。
实施例12：Ab12对体内红细胞生成的影响
(a)mEpoR-/-、hEopR+转基因小鼠的构建：如Liu，C.等.，Jounalof Biological Chemistry，272：32395(1997)和Yu，X.，等.，Blood，98(2)：475(2001)中所描述，产生仅生成人EpoR(hEpoR+，单等位基因)而无内源性小鼠EpoR(mEpoR-/-，双等位突变)的转基因小鼠。繁育已确定生育用于体内红细胞生成研究的小鼠的群体。
(b)多剂量给药法：在最初的试验中，对动物施以Ab12多剂量给药法以测定是否抗体能引起网织红细胞计数和/或％红细胞比容的增加。5种转基因小鼠(mEpoR-/-，hEpoR+，用溶在0.2ml载体(含有0.1％牛血清白蛋白[BSA]的磷酸盐缓冲液[PBS])中的5μg或50μg Ab12皮下注射。对照动物也以同样方式用相等体积的载体单独注射，或用含有5U(Thousand Oaks，CA)的载体注射。所有动物根据如下时间表给药3周：
  第1周  第2周  第3周
  星期一，星期二，星期三，星期五  星期一，星期三，星期五  星期一，星期三
在第4天取样抽血(第1周星期四)用于测定网织红细胞计数，在第19天取样抽血(第3周星期五)用于测定红细胞比容。使用本领域众所周知的方法进行网织红细胞计数和红细胞比容测定。如图32所显示，Ab 12引起了接受5或50μg Ab 12抗体的动物中网织红细胞计数和％红细胞比容统计学上的显著增加(较对照而言)。
(c)周剂量给药法：为评估是否在多剂量给药法中所观察到的结果在动物接受更少剂量Ab 12时仍可观察到，用不同浓度(0.5、2.5、5.0、50和250μg)的Ab 12或对照，AranespTM(ThousandOaks，CA)，一种的更具活性变体，在第1、8和15天注射(如上述(b)所描述)转基因小鼠以及在第4和19天抽血，用于分别测定网织红细胞和红细胞比容。对照动物仅接受单剂量载体或人IgG2同种型对照。图33显示了尽管仅在更低浓度测试，Ab 12仍引起统计学上的显著增加(较载体和同种型对照而言)。
(d)单剂量对周剂量给药法：为测定是否单剂量Ab12在3周后能影响红细胞生成，给转基因小鼠服用Ab12(50μg)，每次间隔一周，持续3周，或服用单剂量Ab 12(150μg)，在第19天抽血用于测定红细胞比容百分数。对照动物仅接受载体，单剂量的AranespTM(900ng)或每次间隔一周注射的3次总剂量的AranespTM(300ng x3)。图34显示了较载体对照而言，Ab12的两种剂量给药法都引起红细胞比容百分数统计学上的显著增加。与此相反，AranespTM的单剂量给药法并不具有该结果。
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经由在前描述和实施例以说明本发明。在前描述意在作为非限制性说明，因为按其观点许多变化对本领域技术人员而言结果是显而易见的。
可对描述于本文中的本发明的组合物、方法的操作和安排进行改变而不背离本发明的概念和范围。