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1、(10)申请公布号 CN 103571806 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103571806 A (21)申请号 201310560298.7 (22)申请日 2013.11.12 C12N 9/10(2006.01) (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘 区大学路 100 号 (72)发明人 陈山 刘玫 梁赢 张义平 姚晓麦 浦媛媛 邹青松 黄磊 谢政 相萍萍 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 (54) 发明名称 双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的 方法 (57) 摘要 本发。
2、明公开了一种双水相萃取快速分离纯化 右旋糖酐蔗糖酶的方法， 发明人通过添加聚乙二 醇和外源性葡聚糖构建 PEG/Dextran 双水相体 系， 从而建立了本发明的方法。 该法解决了目前采 用硫酸铵沉淀法、 膜分离法等分离右旋糖酐蔗糖 酶的方法存在酶活回收率低、 操作困难、 单一方法 分离纯度低等问题。本发明绿色环保、 安全高效、 操作简单， 耗时短 , 可适用于短时间内快速分离 纯化右旋糖酐蔗糖酶。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103571806 A。
3、 CN 103571806 A 1/1 页 2 1. 一种双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： (1) 用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液 ； (2) 向步骤 (1) 的粗酶液中添加聚乙二醇和外源性葡聚糖构建 PEG/Dextran 双水相体 系 ； (3) 将步骤 (2) 的 PEG/Dextran 双水相体系低温静置分层和高速离心分离 ； (4) 将步骤 (3) 分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶。 2. 根据权利要求 1 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于步骤(1)按以下操作进行 ： 将肠膜明串珠。
4、菌CICC21724在43号固体培养基斜面试管中复 活后， 接种至 43 号固体培养基 ； 待长出茁壮的单菌落后， 挑取 2 环单菌落接种至种子培养 基 ； 待菌种繁殖至对数期时， 以2%的接种量接种于产酶培养基， 培养20-26h ； 然后将培养液 在 12000r/min、 4、 20min 的条件下离心去除菌体， 收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶 液。 3. 根据权利要求 2 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于 ： 所述 43 号固体培养基配方为蔗糖 130g/L、 蛋白胨 2.0g/L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/ L、 琼脂20。
5、.0g/L， pH7.0-7.2 ； 所述种子培养基配方为蔗糖50g/L、 酵母膏10g/L、 蛋白胨10g/ L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/L， pH6.8 ； 所述产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、 酵母膏 12.5g/ L、 牛肉膏 20g/L、 KH2PO41.0g/L、 Na2HPO43.6g/L， pH7.0-7.2。 4. 根据权利要求 2 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于 ： 所述固体培养基培养菌种的条件为 253； 所述种子培养基和产酶培养基培养菌种的 条件为 253、 15050r/min， 装液量是所盛容器标准容。
6、量的 20%。 5. 根据权利要求 1 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于步骤(2)中PEG/Dextran双水相体系构成为 ： 粗酶液20mL， 加入一定浓度的PEG溶液和外 源性Dextran溶液， 用无菌水补足至体系总质量为40g ； 所述PEG的分子量为6000， PEG6000 的质量终浓度为 15% ； 所述外源性 Dextran 的分子量为 1 万、 4 万或 7 万， Dextran-T10 的质 量终浓度为 0.8% 2.4%， Dextran-T40 的质量终浓度为 0.8% 2.4%， Dextran-T70 的质量 终浓度为 0.4% 2.。
7、0%。 6. 根据权利要求 5 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于步骤 (2) 中盛放 PEG/Dextran 双水相体系采用 50mL 的 Beckman 离心管。 7. 根据权利要求 6 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于步骤 (3) 按以下操作进行 ： 构建 PEG/Dextran 双水相体系后， 均匀混合， 置于 4的冰箱 中静置1h， 然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、 4条件下离心20min后， 倒掉上相， 将 下相用 0.02mol/L pH5.4 的醋酸钠缓冲液稀释定容至 15mL。 8. 根据权利要求 1。
8、 所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 其特征在 于步骤 (4) 中透析选用分子量为 7000Da 的透析袋。 权 利 要 求 书 CN 103571806 A 2 1/4 页 3 双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法 技术领域 0001 本发明属于生物分离工程技术领域， 尤其涉及一种双水相萃取快速分离纯化右旋 糖酐蔗糖酶的方法。 背景技术 0002 右旋糖酐蔗糖酶 （Dextransucrase， 系统分类号 EC2.4.1.5） 属于糖酐水解酶 70 家 族 (Family70)， 由肠膜明串珠菌发酵获得， 是一种催化蔗糖合成右旋糖酐的糖基转移酶， 催 化合成的右旋糖酐。
9、可作为血浆代用品， 在食品、 医药、 化工等行业均具有广泛的应用。 但是， 肠膜明串珠菌发酵得到的右旋糖酐蔗糖酶含有多种杂质， 与产物葡聚糖混合在一起， 以致 粗酶液非常粘稠， 给酶的分离纯化造成了极大的困难。 0003 目前， 有多种方法可用于右旋糖酐蔗糖酶的分离纯化， 如硫酸铵沉淀法、 超滤、 有 机溶剂沉淀法、 色谱分离等。 硫酸铵沉淀法在很大程度上损伤了右旋糖酐蔗糖酶的活性， 当 用质量浓度超过80%的硫酸铵处理时， 酶活回收率不超过10%。 超滤法虽具有较高的酶活回 收率， 但粗酶液粘度高， 易造成膜堵塞， 膜通量下降较快， 不适合工业化应用。 有机溶剂沉淀 法的沉淀特异性高于硫酸铵。
10、沉淀法， 且沉淀不用脱盐， 过滤较为容易， 但是容易引起酶的变 性失活。色谱分离一般与其他纯化方法 （如超滤、 盐析、 葡聚糖酶降解） 等结合使用， 虽然它 能得到纯度较高的酶， 但易造成酶污染、 酶活损失严重、 处理量少， 只能用于实验室规模， 很 难进行工业化生产。 0004 双水相萃取是指两种亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相， 利用被 分离物在两相中分配系数不同而实现分离的技术， 该法具有易分相、 价格低廉、 萃取高效温 和、 无毒、 萃取物活性损失小、 除杂能力强、 萃取率高、 可连续操作、 安全方便等优点， 可广泛 的用于蛋白质、 酶、 核酸、 氨基酸、 多肽、 细胞器等。
11、产品的分离和纯化。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、 快速高效的双水相萃取快速分离 纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法， 以提高右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率、 节约纯化时间。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案 ： 双水相萃取快速分离纯化右旋 糖酐蔗糖酶的方法， 包括以下步骤 ： 0007 (1) 用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液 ； 0008 (2) 向步骤 (1) 的粗酶液中添加聚乙二醇 （PEG） 和外源性葡聚糖 (Dextran) 构建 PEG/Dextran 双水相体系 ； 0009 (3) 将步骤 (2) 的 PEG/。
12、Dextran 双水相体系低温静置分层和高速离心分离 ； 0010 (4) 将步骤 (3) 分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 0011 步骤(1)按以下操作进行 ： 将肠膜明串珠菌CICC21724在43号固体培养基斜面试 管中复活后， 接种至43号固体培养基 ； 待长出茁壮的单菌落后， 挑取2环单菌落接种至种子 培养基 ； 待菌种繁殖至对数期时， 以 2%(v/v) 的接种量接种于产酶培养基， 培养 20-26h ； 然 说 明 书 CN 103571806 A 3 2/4 页 4 后将培养液在 12000r/min、 4、 20min 的条件下离心去除菌体， 收集上。
13、清液即得右旋糖酐 蔗糖酶粗酶液。 0012 43 号固体培养基配方为蔗糖 130g/L、 蛋白胨 2.0g/L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/ L、 琼脂 20.0g/L， pH7.0-7.2 ； 种子培养基配方为蔗糖 50g/L、 酵母膏 10g/L、 蛋白胨 10g/L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/L， pH6.8 ； 产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、 酵母膏 12.5g/L、 牛肉 膏 20g/L、 KH2PO41.0g/L、 Na2HPO43.6g/L， pH7.0-7.2。 0013 固体培养基培养菌种的条件为 253 ； 种子培养。
14、基和产酶培养基培养菌种的条 件为 253、 15050r/min， 装液量是所盛容器标准容量的 20%。 0014 步骤 (2) 中 PEG/Dextran 双水相体系构成为 ： 粗酶液 20mL， 加入一定浓度的 PEG 溶液和外源性 Dextran 溶液， 用无菌水补足至体系总质量为 40g ； PEG 的分子量为 6000， PEG6000 的质量终浓度 （w/w）为 15% ； 外源性 Dextran 的分子量为 1 万、 4 万或 7 万， Dextran-T10 的质量终浓度 （w/w）为 0.8% 2.4%， Dextran-T40 的质量终浓度 （w/w）为 0.8% 2.4%。
15、， Dextran-T70 的质量终浓度 （w/w） 为 0.4% 2.0%。 0015 步骤 (2) 中盛放 PEG/Dextran 双水相体系采用 50mL 的 Beckman 离心管。 0016 步骤 (3) 按以下操作进行 ： 构建 PEG/Dextran 双水相体系后， 均匀混合， 置于 4 的冰箱中静置 1h， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉 上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL。 0017 步骤 (4) 中透析选用分子量为 7000Da 的透析袋。 0018 针对目前右旋。
16、糖酐蔗糖酶制备过程中存在的问题， 发明人通过添加聚乙二醇和外 源性葡聚糖构建 PEG/Dextran 双水相体系， 从而建立了本发明双水相萃取快速分离纯化右 旋糖酐蔗糖酶的方法。 该法萃取高效温和， 最佳萃取条件下， 右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 可达95.99%， 比活力为29.90U/mg， 纯化倍数为1.86倍 ； 所得右旋糖酐蔗糖酶中只含有葡聚 糖 （对酶活有一定的保护和稳定作用） ， 杂质少， 可用于酶法合成右旋糖酐的研究和生产。同 时， 本发明萃取耗时短， 操作简单， 可适用于快速分离右旋糖酐蔗糖酶。 具体实施方式 0019 以下各实施例所用培养基及培养条件如下 ： 0020 固体培。
17、养基配方为蔗糖 130g/L、 蛋白胨 2.0g/L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/L、 琼脂 20.0g/L， pH7.0-7.2 ； 种子培养基配方为蔗糖 50g/L、 酵母膏 10g/L、 蛋白胨 10g/L、 KH2PO40.3g/L、 Na2HPO41.4g/L， pH6.8 ； 产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、 酵母膏 12.5g/L、 牛肉 膏 20g/L、 KH2PO41.0g/L、 Na2HPO43.6g/L， pH7.0-7.2。 0021 固体培养基培养菌种的条件为 253 ； 种子培养基和产酶培养基培养菌种的条 件为 253、 15050r/m。
18、in， 装液量是所盛容器标准容量的 20%。 0022 实施例 1 0023 将肠膜明串珠菌 CICC21724 在 43 号固体培养基斜面试管中复活后， 接种至 43 号 固体培养基 ； 待长出茁壮的单菌落后， 挑取 2 环单菌落接种至种子培养基 ； 待菌种繁殖至 对数期时， 以 2%(v/v) 的接种量接种于产酶培养基， 培养 20-26h ； 然后将培养液在 12000r/ min、 4、 20min 的条件下离心去除菌体， 收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。 0024 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量浓度 50% 的 说 明。
19、 书 CN 103571806 A 4 3/4 页 5 PEG6000 溶液和 1.60mL 质量浓度 20% 的 Dextran-T10 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 为 15% 和 0.8%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖。
20、酶的酶活回收率 为 79.61%， 比活力为 25.90U/mg， 纯化倍数为 1.61 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 0025 实施例 2 0026 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例 1。 0027 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量浓度 50% 的 PEG6000 溶液和 4.80mL 质量浓度 20% 的 Dextran-T10 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 为 15% 和 2.4%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG。
21、/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 为 66.81%， 比活力为 20.23U/mg， 纯化倍数为 1.26 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 0028 实施例 3 0029 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
22、同实施例 1。 0030 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量浓度 50% 的 PEG6000 溶液和 1.28mL 质量浓度 25% 的 Dextran-T40 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 为 15% 和 0.8%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mo。
23、l/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 为 89.90%， 比活力为 32.58U/mg， 纯化倍数为 1.48 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 0031 实施例 4 0032 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例 1。 0033 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量浓度 50% 的 PEG6000 溶液和 3.20mL 质量浓度 20% 的 Dextran-T40 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 。
24、为 15% 和 2.0%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 为 72.39%， 比活力为 23.04U/mg， 纯化倍数为 1.05 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖。
25、酶 ( 含葡聚糖 )。 0034 实施例 5 0035 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例 1。 说 明 书 CN 103571806 A 5 4/4 页 6 0036 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量浓度 50% 的 PEG6000 溶液和 0.80mL 质量浓度 20% 的 Dextran-T70 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 为 15% 和 0.4%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置。
26、 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 为 67.84%， 比活力为 15.25U/mg， 纯化倍数为 1.14 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 0037 实施例 6 0038 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例 1。 0039 取粗酶液 20mL 置于 50mL 的 Beckman 离心管中， 分别加入 12mL 质量。
27、浓度 50% 的 PEG6000 溶液和 4.00mL 质量浓度 20% 的 Dextran-T70 溶液， 使其质量终浓度 （w/w）分别 为 15% 和 2.0%， 用无菌水补足至体系总质量为 40g， 构建成 PEG/Dextran 双水相体系。构 建 PEG/Dextran 双水相体系后， 充分摇匀均匀混合， 置于 4的冰箱中静置 1h 使得分相充 分， 然后利用高速冷冻离心机在 12000r/min、 4条件下离心 20min 后， 倒掉上相， 将下相用 0.02mol/L 的醋酸钠缓冲液 (pH5.4) 稀释定容至 15mL， 测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率 为 58.42%， 比活力为 13.62U/mg， 纯化倍数为 1.02 倍。然后， 选用分子量为 7000Da 的透析 袋， 将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶 ( 含葡聚糖 )。 说 明 书 CN 103571806 A 6 。