猪肉质性状相关POSTN基因分子标记的克隆及应用.pdf

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及猪POSTN基因分子标记的克隆及其应用。本发明所述的分子标记由POSTN基因克隆得到，其POSNT分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示。在SEQ ID NO：1的第709bp处有一个C/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-HaeШ多态性，可以应用于猪肉质性状的关联分析。本发明为猪肉质性状标记辅助选择提供了新的分子标记。

权利要求书
1.   一种与猪肉质性状相关的POSTN基因片段，其序列如序列表SEQ ID NO：1所述；在序列表SEQ ID NO：1的709bp处有1个C/T的碱基突变，导致PCR‑RFLP‑HaeШ多态性。

2.   检测权利要求1所述的一种与猪肉质性状相关的POSTN基因片段，其突变的引物对，正向引物为5′‑AGGAGCACTTATTCTTGT‑3′，反向引物为5′‑AAATGCGTTATTCACAGG‑3′。

3.   制备如权利要求1所述的与猪肉质性状相关的POSTN基因片段的方法，按照以下步骤：
利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，利用限制性内切酶HaeШ对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测CC、CT和TT基因型的分布。

4.   权利要求1所述与猪肉质性状相关的POSTN基因片段在猪分子标记辅助选择中的应用。

说明书猪肉质性状相关POSTN基因分子标记的克隆及应用
技术领域
本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
背景技术
猪肉是我国城乡居民动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉品需要量的增加，对肉质质量的要求也相对提高。而这主要是由基因控制，并存在主基因效应。分子生物技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中应用于标记辅助选择，以提高选择进程，更好地改善猪肉质性状，满足人们的需要，以获得更大的经济效益。
肉质定义最为广泛接受的是Hoffmarm的定义，即肉质应该考虑感官属性、营养价值、技术质量和食品安全。感官属性指外观（如色泽）、保水力、硬度，食用品质指嫩度、多汁性、风味与滋味、臭味、大理石纹，营养价值指脂肪含量、脂肪酸组成、蛋白质含量、其它营养含量，技术因素指系水力、脂肪硬度、组织分离、氧化稳定性，社会质量指动物福利、环境，食品安全指微生物卫生（无沙门氏菌、弯曲杆菌）、无残留(抗生素、重金属、杀虫剂)。影响猪肉质的因素很多，有遗传因素和非遗传因素，从遗传上对猪肉质性状进行评定和选育是改善猪肉品质的关键，肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制，某些数量性状存在主基因效应，大多数属于QTL。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能寄予同胞或半同胞测验，这就势必加大选育成本，且遗传进展缓慢。只能肉质性状在动物屠宰时才能测定，需昂贵的同胞测验，因此，利用分子标记进行辅助选择(MAS)控制肉质性状是非常有意义的。
分子生物技术的发展和猪高密度基因图谱的构建，使育种工作者可在DNA水平上寻找影响肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记，理论上这些主基因或分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。
小鼠成骨细胞特异因子（periostin,osteoblast specific fctor,POSTN）基因POSTN被命名为Osf2，以小鼠的POSTN基因为探针，筛查人胚盘和骨肉瘤cDNA文库，克隆2种人的POSTN基因不同形式，据推断，一种编码779个氨基酸，分子量为87.0KD，另外一种编码836个氨基酸，分子量大小为93.3KD，POSTN蛋白含有1个典型的信号肽，1个半胱氨酸富集域和4个150个氨基酸的折叠重复结构，1个C‑端结构域，小鼠和人POST N蛋白的同源性是89.2%，成熟形式的同源性是90.10%。小鼠成骨细胞系的Northern印迹杂交检测一个3.4kb的POSTN基因的转录本，RNA斑点杂交分析，POSTN基因在小鼠的成骨细胞和肺中表达，在其它器官中未测到表达。
Gillan等发现了一个含有POSTN基因的EST克隆，据推断POSTN基因编码782个氨基酸，RNA斑点印迹分析表明，该基因在成年人的主动脉、胃、胃肠道、胎盘、子宫、乳腺组织中广泛表达。该基因在胎牛血清中表达，但在新生的犊牛血清中不表达。Gillan等发现，在培养的子宫瘤上分泌POSTN蛋白，但在正常的子宫上皮细胞中不分泌，从21个患有子宫癌病人中的20个人的腹水中发现POSTN蛋白。POSTN重组蛋白有助于子宫上皮细胞的粘附，而整合素ITGB3和ITGB5的抗体能抑制粘附，据此他认为OSTN是作为整合素IT‑GB3和ITGB5的配体而促进细胞粘附和子宫上皮细胞的迁移。Shao等发现，POSTN在绝大多数人的乳腺肿瘤中过度表达，过度表达POSTN蛋白的转染的肿瘤细胞系能加速生长，并且在无免疫应答动物的异种移植后，加速血管形成。POSTN介导的血液发生在某种程度上是由于血管内皮生长因子受体KDR的上调表达。
人POSTN基因DNA全长36096bp，cDNA全长为3213bp，含有23个外显子，22个内含子，5'‑UTR长为691bp，3'‑UTR11bp。小鼠（Mus musculus）DNA全长29908bp，cDNA全长为3187bp，含有22个外显子，21个内含子，5'‑UTR长为18bp，3'‑UTR133bp。人该基因位于HSA13q13.3，小鼠POSTN基因位于3号染色体3C。
但是，目前国内外关于猪POSTN基因的相关研究很少。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪肉质性状基因POSTN片段，寻找POSTN基因的突变位点以及作为猪肉质性状基因多态性的检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉质性状相关基因POSTN及其在猪标记辅助选择中的应用，为猪标记辅助选择提供有用的分子标记。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种猪肉质性状相关基因POSTN在猪分子标记辅助选择中的应用，该猪肉质性状相关基因POSTN基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示的第709bp处有一个C/T的碱基突变，导致PCR‑RFLP‑HaeШ多态性。
上述POSTN基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的POSTN基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用SSCP技术和测序技术发现SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，再利用SAS软件GLM（通用线性模型）分析SNP与肉质性状的关联。
申请人通过克隆得到一种与猪肉质性状相关的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO：1所述。序列表SEQ ID NO：1的709bp处有1个C/T的碱基突变，导致PCR‑RFLP‑HaeШ多态性。
制备了检测上述序列表SEQ ID NO：1基因片段突变的引物对，所述引物对，
正向引物为5′‑AGGAGCACTTATTCTTGT‑3′。
反向引物为5′‑AAATGCGTTATTCACAGG‑3′。
利用上述制备的与猪肉质性状相关的分子标记对外来猪种和中国地方品种进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。
SNP发现与检测方法建立：发明人设计了扩增包含该SNP引物，经分析C/T位点的突变可以采用HaeШ进行酶切检测多态性。在扩增的1249bp的片段上，存在1个HaeШ的酶切位点，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示在POSTN基因片段的C/T位点存在3种基因型，TT型（1249bp）、CT型（541bp、708bp、1249bp）和CC基因型（541bp、708bp）。酶切电泳结果证实了在POSTN基因第9个内含子碱基位置12835bp处存在的突变。
基因型－肉质性状间关联：利用SAS软件中的一般线性模型（General Linear Model,GLM）程序对基因型与性状进行关联分析，模型如下为Yijkn=μ+hi+lj+gk+εijkn，Yijkn为性状表型值，μ为总体均数，hi为牧场效应，lj为年代效应，gk为POSTN基因型不同位点的效应，εijkn为随机误差效应，服从正态分布（0,σ2）。分析表明POSTN基因SNP位点对背膘厚有显著影响（P<0.01），此位点对其它肉质性状也有显著影响。
本发明将为猪肉质性状的分子标记，为标记辅助选择（MAS）奠定坚实的基础，进一步阐明肉质性状的分子机制，将为改善猪肉品质提供理论依据，提高养猪生产经济效益，并指导猪的育种实践。
附图说明
图1是本发明的POSTN基因片段的PCR扩增产物的电泳结果图。
图中：M：100bp DNA Ladder Marker，1‑7表示不同泳道。
图2是本发明的POSTN基因C/T位点的HaeШ酶切电泳结果。
泳道2：TT基因型；泳道1,3,4，7：CT基因型：泳道5，6：CC基因型；M:100bp DNA Ladder Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。
PCR‑RFLP技术检测POSTN基因的HaeШ多态性。
引物设计：利用比较基因组学方法根据人的POSTN基因（GenBank收录号为NM_001206351）的第8内含子到第10内含子设计引物，以该基因在GenBank作BLAST序列比对后筛选出POSTN基因候选SNPs位点，选取POSTN基因全序列的第12835bp候选SNPs位点，设计特异性引物，用这些引物来扩增从猪耳组织提取的基因组DNA。
引物为：F：5′‑GAGTGCCAAGGAGCAGAAAT‑3′，
R：5′‑CCCGCTAAGGTGTGTTTGTT‑3′
DNA样品的来自8个品种共772头，其中益阳农科所种猪场杜洛克猪57头、大白猪118头；湘潭北农大种猪场大白猪106头；岳阳正虹种猪场大白猪136头，新五丰猪场长白猪38头；地方品种宁乡猪67头、桃源黑猪70头、大围子猪62头、沙子岭猪63头和五指山猪55头。取小块供试猪耳组织提取DNA。
PCR条件：PCR反应体系（总体积20μL）：10×Buffer2μL，2mmol/L dNTPs1.6μL，20mmol/LMgCl21.6μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，DNA模板（100ng/μL）1μL，上下游引物（10pmol/μL）各0.4μL，ddH2O12.6μL。
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50.5℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。
取10μL PCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于2%的琼脂糖凝胶（含0.05%EB）上，然后点6μL100bp DNA Markers作为参照。5V/cm电泳0.5～1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产物后送铂尚生物技术公司测序。
PCR产物的HaeШ酶切：在10μL PCR产物中加入8μL10×内切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶和2μL双蒸水，总体积为20.2μL，37℃消化10h。C/T位点用1%琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图2，扩增产物进行测序，序列如SEQ ID NO：1所示，扩增片断为猪POSTN基因12127bp到13375bp之间，为第8内含子到第10内含子的片断，共1249bp，为PCR‑RFLP‑HaeⅢ分子标记，图2是本发明中POSTN基因PCR‑RFLP的3种基因的TT、CT和CC电泳结果。图中M：DNA分子量标准（DL100bp ladder）。
本发明以猪POSTN基因作为猪肉质性状的候选基因，以5个地方猪种(宁乡猪、桃源黑猪、大围子猪、沙子岭猪和五指山猪)、3个外来猪种(杜洛克猪、大白猪、长白猪)和杜×长×大三元杂为试验材料，采用PCR‑RFLP方法对POSTN基因C/T位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构，分析该基因与肉质性状的相关性。
PCR‑RFLP‑HaeШ多态性在各品种中的分布情况如下表1所示，由表1可以看出，在宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源猪、五指山猪这5个地方品种中C基因为优势等位基因，其中桃源猪和五指山猪中未出现T基因，其它3个本地猪中沙子岭猪C基因频率最高（0.9921）；在3个外来品种杜洛克猪、长白猪、大白猪中C基因也为优势等位基因，杜洛克猪C基因频率最高（0.7368）；从基因型分布频率看，CC型占优势。
表1  不同品种POSTN基因C/T位点的基因频率与基因型频率

本发明的分子标记在猪肉质性状标记性状关联分析中的应用。
运用SAS8.02（Statistical Analysis System）统计软件对POSTN基因型与猪肉质性状进行关联分析。模型如下：
Yijkn=μ+hi+lj+gk+εijkn
Yijkn为性状表型值，μ为总体均数，hi为牧场效应，lj为年代效应，gk为POSTN基因型不同位点对性状的效应，εijkn为随机误差效应，服从正态分布（0,σ2）。
表2  猪POSTN基因C/T位点与肉质性状关联分析表

表中各列标相同字母表示差异不显著，标不同字母的表示差异显著（下同）
由表2可知，在杜洛克猪中，CC基因型失水率比CT基因型失水率降低了8.98%(p<0.05)，TT基因型贮存损失比CC基因型贮存损失降低了0.89%（p<0.05），CC、CT、TT基因型实测平均pH值、熟肉率、肉色等级和大理石纹等级之间差异均不显著。
在大白猪中，CT基因型失水率比TT基因型降低了4.48%（p<0.05），而大理石纹等级则低于TT基因型，相差0.80（p<0.05），CC基因型的肉色等级比TT基因型的肉色等级高了0.50（p<0.05），但CC和CT基因型之间差异不显著，CC基因型贮存损失比CT基因型贮存损失降低了0.57%（p<0.05），CC、CT、TT基因型pH值和熟肉率之间差异不显著。长白猪中CT基因型肉色等级比TT基因型肉色等级高0.75（p<0.05），与CC基因型差异不显著，CC基因型贮存损失比TT基因型贮存损失高了0.44%（p<0.05），其它性状上的差异均未达到显著水平。在杜长大三元杂中，CC基因型pH值比TT基因型pH值高0.47，CC基因型失水率比TT基因型失水率降低了5.27%（p<0.05），但CC和CT基因型之间差异不显著，CT基因型肉色等级比CC基因型肉色等级高了1.47（p<0.05），而CC和TT基因型之间差异不显著，其它性状上差异不显著。
表3  大白猪POSTN基因C/T位点与生长性状关联分析表

由表3可知，大白猪中，CC基因型背膘厚比TT基因型背膘厚3.18mm（p<0.01），而CC、CT和TT基因型在100kg日龄上差异不显著（p>0.05）。