《包含TENC1表达或活性抑制剂的预防或治疗糖尿病的药物组合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《包含TENC1表达或活性抑制剂的预防或治疗糖尿病的药物组合物.pdf（31页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104066437 A (43)申请公布日 2014.09.24 CN 104066437 A (21)申请号 201380006963.6 (22)申请日 2013.01.14 10-2012-0009249 2012.01.30 KR 10-2013-0004101 2013.01.14 KR A61K 38/17(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61K 31/7105(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (71)申请人 浦项工科大学校产学协力团 地址 韩国庆尚北道 (72)发明人 柳成浩 高雅罗 李美男 郑熙润 梁。
2、用烈 徐判吉 (74)专利代理机构 北京德崇智捷知识产权代理 有限公司 11467 代理人 戴义保 (54) 发明名称 包含 TENC1 表达或活性抑制剂的预防或治疗 糖尿病的药物组合物 (57) 摘要 本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或糖 尿病并发症的药物组合物， 其中包括 TENC1（包含 磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域）表达或活性抑 制物， 更具体地说， 涉及到一种用于预防或治疗糖 尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 其抑制由于 TENC1 的 PTPase 活性导致的 IRS-1 降解 （胰岛素 受体底物 -1） ， 或抑制由于 TENC1 的 PTPase 活性 导致的 IRS-1。
3、 磷酸化。根据本发明的用于预防或 治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 其包 括作为活性成分的 TENC1 表达或活性抑制物， 该 药物组合物预期可以广泛应用于预防和治疗糖尿 病或糖尿病并发症， 因为药物组合物能有效地预 防肌肉萎缩症和减少糖吸收， 这是由于通过抑制 TENC1 所致的 IRS-1 降解， 在 IRS-1 中减少。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.07.28 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2013/000288 2013.01.14 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/115504 KO 2013.08.08 (。
4、51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 8 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表8页 附图13页 (10)申请公布号 CN 104066437 A CN 104066437 A 1/1 页 2 1. 一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 包括 ： 作为活性成分的 TENC1（包含磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域） 表达或活性抑制剂。 2. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 表达抑制剂是 si6， 其包括 SEQ ID NO.8 的序列， 或者是 si7， 其包括。
5、 SEQ ID NO.9 的序列。 3. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述活性抑制剂包括乌酸。 4. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述 TENC1 包括 SEQ ID NO.1 的氨基酸序列。 5. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述 TENC1 包括 PTPase（蛋白酪氨酸磷酸酶） 活性。 6. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述 TENC1 使用 IRS-1（胰岛素受体底物 -1） 作为底物。 7. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述糖尿病并发症选自由肌肉萎缩、 糖尿病视网膜病变、 糖尿病性白内。
6、 障、 糖尿病肾病、 糖尿病神经病变、 心脏病、 癌症、 骨质疏松症、 肾脏疾病、 性功能障碍、 皮肤 疾病、 高血压、 动脉硬化、 中风和动脉粥样硬化所组成的组。 8. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述药物组合物抑制通过 TENC1 的 IRS-1 降解。 9. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 所述药物组合物抑制通过 TENC1 的 IRS-1 脱磷酸。 10. 一种 TENC1 表达或活性抑制剂的筛选方法， 所述抑制剂治疗或预防糖尿病或糖尿 病并发症， 该方法包括 ： 与测试物质在一起培养或单独培养表达 TENC1（包含磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域）。
7、 的细胞 ； 以及 测量 TENC1 在细胞中的表达或活性程度。 11. 根据权利要求 10 所述的方法， 其特征在于， 所述测试物质选自由化学物质、 微生物培养液或提取物、 核酸、 抗体、 适体 和天然提取物所组成的组。 12. 根据权利要求 10 所述的方法， 其特征在于， 通过 RT-PCR 或蛋白质印迹法测量 TENC1 的表达程度。 13. 根据权利要求 10 所述的方法， 其特征在于， 在测量TENC1活度的过程中， 测量TENC1的PTPase活性或TENC1和IRS-1 的结合度。 权 利 要 求 书 CN 104066437 A 2 1/8 页 3 包含 TENC1 表达或活。
8、性抑制剂的预防或治疗糖尿病的药物 组合物 技术领域 0001 本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 其包含作 为活性成分的 TENC1( 张力蛋白像包含磷酸酶的 C1 结构域 ) 活性或表达的抑制剂， 更具 体地说， 涉及一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 其由于 TENC1 的 PTPase 活性， 抑制 IRS-1( 胰岛素受体底物 -1) 的磷酸化或 IRS-1 的降解。 背景技术 0002 糖尿病是一种以高血糖 ( 血糖水平高 ) 为特征的代谢疾病， 其由于胰岛素分泌不 足或功能障碍引起。高血糖会导致多种症状和体征， 并且葡萄糖随着尿液排出。。
9、此外， 随着 时间的流逝， 会在神经、 肾脏、 视网膜等处引起血管疾病和功能障碍， 导致死亡。 0003 糖尿病有两种类型 ： 1 型和 2 型。1 型糖尿病被称为 “青少年糖尿病” ， 不产生胰岛 素时会导致 1 型糖尿病。2 型糖尿病是由于胰岛素相对缺乏而导致的， 其特点是胰岛素抵 抗 ( 由于胰岛素的功能降低， 细胞不能有效处理血糖， 降低血糖水平 )。2 型糖尿病主要是 由于环境因素， 如在西方化饮食中的高卡路里、 高脂肪、 高蛋白食物， 以及缺乏运动， 并承受 压力所导致的。除了环境因素， 糖尿病可能是由于特定的基因缺陷， 胰腺癌手术、 感染或药 物导致的。 0004 近来， 由于西。
10、方化饮食、 压力、 缺乏锻炼等， 慢性和与生活方式相关的成人疾病， 如 动脉硬化、 高血压和糖尿病在增加。特别是， 在韩国， 糖尿病的发病率持续增加 ： 在 20 世纪 70 年代不到 1的人口， 在 20 世纪 80 年代末大约 3， 在 20 世纪 90 年代为 5 8。因 此， 到目前为止， 已经开发出各种类型的糖尿病治疗药物， 但是尚未开发出令人满意的治疗 方法或药物。 0005 胰岛素抵抗是 2 型蛋白质的特征， 其是由胰岛素分泌缺陷引起的， 胰岛素抵抗降 低了胰岛素信号转导。因此， 最近新提出的治疗糖尿病的方法是增加胰岛素信号转导。为 此， 正在开发一种抑制蛋白质表达的方法， 所述。
11、蛋白质如 PTP1B( 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B) 抑 制胰岛素受体的功能。然而， 在 2 型糖尿病中， 胰岛素信号转导问题通常是由 IRS-1( 胰岛 素受体底物 -1) 功能降低 ( 减少蛋白质的数量和 IRS-1 酪氨酸磷酸化 ) 引起的， 而非胰岛 素受体的功能退化。因此， 能够调节 IRS-1 功能的蛋白质是非常重要的， 因为它是治疗糖尿 病和糖尿病并发症的靶标。然而， 与糖尿病有关的作为 IRS-1 的 PTPase( 蛋白酪氨酸磷酸 酶)具有直接影响力的蛋白质尚未报道。 同时调节蛋白质的数量和IRS-1磷酸化的PTPase 的例子也尚未报道。 0006 通过这种方式， 能够调节蛋白。
12、质数量和 IRS-1 磷酸化减少的蛋白质， 是糖尿病或 糖尿病并发症治疗药物的有效靶标。因此， 发现这种糖尿病或糖尿病并发症的靶蛋白以及 开发其使用都是必要的。 发明内容 说 明 书 CN 104066437 A 3 2/8 页 4 0007 技术问题 0008 针对现有技术中的上述问题， 本发明提供了一种用于预防或治疗或糖尿病并发症 的药物组合物， 其包含作为活性成分的TENC1(包含磷酸酶的张力蛋白样C1结构域， Tensin like C1domain containing phosphatase)表达或活性的抑制剂。 此外， 本发明提供了一种 TENC1 表达或活性的抑制剂的筛选方法。。
13、该方法包括与测试物质在一起培养或单独培养表 达 TENC1( 包含磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域 ) 的细胞， 并测量细胞中 TENC1 的表达或活 性程度。 0009 然而， 本发明的范围并不局限于上述目的， 本领域技术人员可以从下面的详情中 清楚地知晓其它未提到的目的。 0010 技术方案 0011 根据本发明的一个方面， 提供一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物 组合物， 其包含作为活性成分的 TENC1( 包含磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域 ) 表达或活性 的抑制剂。 0012 该表达抑制剂可以是 siRNA 的 si6 或 si7。 0013 该活性抑制剂可以是乌酸。 0。
14、014 TENC1 可以包括 SEQ ID NO.1 的氨基酸序列。 0015 TENC1 可以是 PTPase( 蛋白酪氨酸磷酸酶 ) 活性。 0016 TENC1 可以使用 IRS-1( 胰岛素受体底物 -1) 作为底物。 0017 糖尿病的并发症可能选自下列组成的组， 包括肌肉萎缩、 糖尿病视网膜病变、 糖尿 病性白内障、 糖尿病肾病、 糖尿病性神经病变、 心脏病、 癌症、 骨质疏松症、 肾脏疾病、 性功能 障碍、 皮肤疾病、 高血压、 动脉硬化、 中风或动脉粥样硬化。 0018 该组合物可以抑制 IRS-1 的降解性和 / 或 TENC1 的脱磷酸。 0019 根据本发明的另一个方面，。
15、 提供了一种用于治疗或预防糖尿病或糖尿病并发症的 抑制剂的筛选方法， 该抑制剂能抑制 TENC1 的表达或活性， 该方法包括 ： 0020 与测试物质在一起培养或单独培养表达TENC1(包含磷酸酶的张力蛋白样C1结构 域 ) 的细胞 ； 以及 0021 测量细胞中 TENC1 的表达或活性的程度。 0022 测试物质可以选自下列组成的组， 包括化学物质、 微生物培养液或提取物、 核酸、 抗体、 适体和天然提取物。 0023 可以通过 RT-PCR( 实时聚合酶链反应 ) 或蛋白质印迹法， 测量 TENC1 表达的程度。 0024 在TENC1的活性程度测量中， 可以测量TENC1的PTPase。
16、活性， 或者TENC1和IRS-1 的结合程度。 0025 有益效果 0026 本发明已证实， TENC1 的 PTPase 活性抑制 IRS-1 的磷酸化， 或直接降解 IRS-1， 使 得葡萄糖的吸收减少并且引起肌肉萎缩， 从而提出了一种治疗糖尿病的新靶标。 因此， 根据 本发明， 提供了一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症制药物组合物， 其包含作为活 性成分的 TENC1 表达或活性的抑制剂， 该抑制剂抑制由 TENC1 引起的 IRS-1 脱磷酸和降解， 并且能够有效预防由于 IRS-1 减少引起的葡萄糖吸收减少和肌肉萎缩。因此， 可以预期的 是该组合物将广泛应用于预防和 / 或治疗。
17、糖尿病或糖尿病并发症。同样的， 当使用根据本 说 明 书 CN 104066437 A 4 3/8 页 5 发明的 TENC1 表达或活性的抑制剂进行的筛选方法时， 激活 IRS-1 的机理和有效预防和 / 或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药品开发是可以预期的。 附图说明 0027 图 1 示出了通过测量在 db/db 小鼠中 TENC1 表达的增加所获得结果。 0028 图 2 示出了通过测定 TENC1 对 Akt 和 ERK1/2 的磷酸化的抑制能力所获得的结果。 0029 图 3 示出了通过测量 TENC1 对胰岛素受体和 IRS-1 的磷酸化的抑制能力所获得的 结果。 0030 图 4 。
18、示出了通过测量 TENC1 和 IRS-1 的结合所获得的结果。 0031 图 5 示出了通过测量 IRS-1 和 TENC1 的 PTPase 结构域的结合所获得的结果。 0032 图 6 示出了通过测量 TENC1 的 PTPase 酶活性所获得的结果。 0033 图 7 示出了通过在 TENC1 表达时， 测量在肌肉中与 IRS-1 相关联的蛋白质磷酸化 所获得的结果。 0034 图 8 示出了通过在 TENC1 表达时， 测量 IRS-1 的 mRNA 的量所获得的结果。 0035 图 9 示出了通过在 TENC1 表达时， 测量 IRS-1 的丝氨酸磷酸化所获得的结果。 0036 图。
19、 10 示出了通过测量 TENC1 的 PTPase 活性对 IRS-1 降解的影响所获得的结果。 0037 图 11 示出了通过测量依赖 TENC1 酶活性而引起体外肌肉萎缩的能力所获得的结 果。 0038 图 12 示出了通过测量 TENC1 减少 MYH 的能力所获得的结果。 0039 图 13 示出了通过测量 TENC1 对 FoxO 蛋白质磷酸化的影响所获得的结果。 0040 图 14 示出了通过测量依赖 TENC1 酶活性而引起体外肌肉萎缩的能力所获得的结 果。 0041 图 15 示出了通过 TENC1 表达的抑制作用会导致肌肉肥大， IRS-1 降解的抑制作用 对肌肉萎缩的抑制。
20、。 0042 图 16 说明的是结果， 其证实 TENC1 的活性抑制可以抑制 IRS-1 脱磷酸和降解。 具体实施方式 0043 本发明人研究了靶蛋白质， 其通过调节IRS-1(胰岛素受体底物-1)的功能性降解 可以有效地用于治疗糖尿病， 从而完成了本发明。 0044 因为蛋白质如 PTP1B( 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B)， 最近作为在胰岛素受体中治疗糖尿 病的靶标受到广泛关注， 据证实它对葡萄糖的吸收有作用， 但它对通常由糖尿病引起的肌 肉量减少没有作用。 因此， 为了筛选治疗药物的靶标， 该治疗药物可以治疗糖尿病和伴随糖 尿病的肌肉萎缩， 本发明人分析了一种蛋白质， 其在糖尿病诱导小鼠的肌。
21、肉中的表达比正 常小鼠中更多， 因此， 筛选出了 TENC1 蛋白质 (SEQ ID NO.1)。 0045 本发明的一个实施例证实， TENC1 抑制 IRS-1 磷酸化， 同时， 通过降解 IRS-1 抑制 IRS 的功能 ( 参见图 4- 图 10)。另一个实施例证实 TENC1 抑制 IRS-1 的功能， 从而造成肌 肉萎缩 ( 参见图 11-13)。本发明的还一个实施例证实， 通过抑制 TENC1 表达来抑制 IRS-1 次级信号增加和抑制糖尿病引起的肌肉萎缩 ( 参见图 15)。 0046 本发明的还一个实施例证实， 可以通过抑制 TENC1 活性来抑制 IRS-1 的脱磷酸化 说。
22、 明 书 CN 104066437 A 5 4/8 页 6 和 IRS-1 的降解 ( 参见图 16)。 0047 基于上述结果， 据证实 TENC1 可以用作治疗糖尿病或糖尿病并发症的靶蛋白， TENC1表达或活性的抑制剂可以用作治疗或预防糖尿病或糖尿病并发症的有效物质。 因此， 本发明提供了一种用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物组合物， 其包含作为活性 成分的 TENC1( 张力蛋白像包含磷酸酶的 C1 结构域 ) 表达或活性的抑制剂。糖尿病并发症 的例子包括肌肉萎缩、 糖尿病视网膜病变、 糖尿病性白内障、 糖尿病肾病、 糖尿病性神经病 变、 心脏病、 癌症、 骨质疏松症、 肾脏疾病。
23、、 性功能障碍、 皮肤疾病、 高血压、 动脉硬化、 中风、 动脉粥样硬化等， 但并发症并不局限于此， 只要它是由糖尿病引起的就是糖尿病并发症。 0048 同样地， 本发明提供了一种筛选 TENC1 表达或活性的抑制剂的方法， 该抑制剂可 用于预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症。该方法包括， 与测试物质在一起培养或单独培养 表达 TENC1( 包含磷酸酶的张力蛋白样 C1 结构域 ) 的细胞， 并测量细胞中 TENC1 的表达或 活性的程度。测量 TENC1 表达程度的方法包括 RT-PCR、 蛋白质印迹法等等， 但不限于此， 只 要它可以测量 mRNA 或蛋白质的量。同时， 测量 TENC1 活性。
24、度的方法是测量 TENC1 的 PTPase 活性或 TENC1 与 IRS-1 的结合程度。然而， 该方法并不局限于此。测试物质可能选自下列 组成的组， 包括化学物质、 微生物培养液或提取物、 核酸、 抗体、 适体和天然提取物， 但物质 并不局限于此。 0049 本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载体。 药学上可接受的载体可以包 括生理盐水、 聚乙二醇、 乙醇、 植物油、 肉豆蔻酸异丙酯等等， 但载体不限于此。 0050 本发明的另一个方面， 提供了一种通过对 “受试者” 施用药学上有效剂量的药物 组合物来治疗糖尿病的方法， 该药物组合物包含作为活性成分的 TENC1 表达或活性的抑制。
25、 剂。在本发明中 “受试者” 这一术语是指需要治疗疾病的目标， 更具体地说， 哺乳动物如人 类或非人类的猩猩、 小鼠、 大鼠、 狗、 猫、 马或牛。同样， 在本发明中， 对于本领域技术人员显 而易见的是， 药学上有效剂量的范围是可以根据患者体重、 年龄、 性别、 健康状况、 饮食、 给 药时间、 给药方法、 排泄率、 疾病的严重程度等进行不同的调整。 0051 本发明的药物组合物的优选剂量取决于患者的病情、 体重、 疾病的程度、 药物剂 型、 给药途径和持续时间而变化， 但是本领域技术人员可以适当选择。然而， 一天的施用剂 量， 优选 0.001 100mg/ 体重 (kg)， 更优选 0.0。
26、1 30mg/ 体重 (kg)。可以每天给药一 次也可以分成几次给药。本发明的 TENC1 表达或活性的抑制剂可以占总组合物总重量的 0.0001 10wt， 优选 0.001 1wt。 0052 本发明的药物组合物可以通过不同的途径施用给哺乳动物如鼠， 小鼠， 牲畜和人 类。施用方法可以是例如， 通过口腔、 直肠、 或静脉、 肌肉内、 皮下、 子宫内硬膜下或脑室注 射， 给药方法不限于此。 0053 在下文中， 将描述本发明进一步的实施例， 以便于理解本发明。然而， 下面提供的 例子仅便于理解本发明， 但是本发明的范围并不局限于以下实施例。 0054 实施例 0055 实施例 1、 与糖尿病。
27、相关的蛋白质的筛选 0056 已经知晓的是， 具有SH2(Src同源区2)结构域的蛋白质在从受体中传递信号中是 很重要的。因此， 为了筛选与糖尿病有关的新的蛋白质， 发明人在 10 周龄的雄性 db/db 小 鼠的肌肉中， 通过定量实时 PCR 筛选蛋白质， 该小鼠的瘦素受体已经被去除以诱导肥胖症 说 明 书 CN 104066437 A 6 5/8 页 7 和糖尿病， 该蛋白质具有 SH2 结构域， 并且比正常小鼠中表达更多。为了进行 PCR， 使用了 TENC1 的正向引物 5 -CTCAGTGGAGTTTGTTTTCTCCTC-3 (SEQ ID NO.2)， TENC1 的反向引物 5。
28、 -GCTGATTGAAGTTTTCATAGGAGTC-3 (SEQ ID NO.3)， p85a 正向引物 5 -GGCGATTACACTCTTAC ACTAAGGA-3 (SEQ ID NO.4)， p85a 反向引物 5 -GAGTTGAAGGTTAATGGATCAGAGA-3 (SEQ ID NO.5)。结果如图 1 所示。 0057 如图 1 所示， 它证实了 db/db 小鼠的骨骼肌中 TENC1 的 mRNA 显著增加超过三倍 ( 参见图 1)， 并且 TENC1 的蛋白质的量也增加了 ( 参见图 1B)。众所周知， 2 型糖尿病导致 肌肉减少症。基于上述结果， 证实 TENC1。
29、 与 2 型糖尿病相关的病理症状表达相关。 0058 实施例 2、 确定 TENC1 对胰岛素机理的影响 0059 在大多数 2 型糖尿病患者中， 胰岛素降低血糖水平的功能降低， 从而细胞不能有 效处理葡萄糖。为了确定 TENC1 对胰岛素机理的影响， 在低表达 TENC1 的 HEK293 细胞系中 过量表达TENC1， 然后通过蛋白质印迹法确定与胰岛素机理相关的蛋白质磷酸化。 结果如图 2 所示。 0060 如图 2 所示， 证实了 TENC1 抑制了胰岛素刺激的 Akt( 蛋白激酶 B)T308 和 ERK1/2( 细胞外信号激酶 ) 的磷酸化。 0061 因为 Akt 和 ERK1/2。
30、 的磷酸化是由于胰岛素受体和 IRS-1( 胰岛素受体底物 -1) 的 酪氨酸磷酸化导致的， 使用如上所述相同的方法， 可以证实 TENC1 是否抑制了胰岛素受体 和 IRS-1 磷酸化。结果如图 3 所示。 0062 如图 3A 所示， 证实了 TENC1 可以抑制约 50 IRS-1 的磷酸化， 但对胰岛素受体 磷酸化没有影响。此外， 为了确定 TENC1 抑制磷酸化的能力是否是由蛋白质酪氨酸磷酸酶 (PTPase)的活性所引起的， 制备了TENC1CS变体， 其中氨基酸位置231上的半胱氨酸被丝氨 酸替代。TENC1CS 变体是突变体， 比常规 TENC1 更可靠地结合到底物， 但是没有。
31、催化作用。 使用 TENC1CS 变体， 使用如上所述同样的方法测定 IRS-1 的磷酸化。结果如图 3B 所示。 0063 如图 3B 所示， 证实了当使用 TENC1CS 时， IRS-1 的磷酸化又恢复了。基于上述结 果， 证实了 TENC1 抑制 IRS-1 的磷酸化， 抑制 Akt 和 ERK1/2 的磷酸化， 从而抑制胰岛素作用 机理。 0064 实施例 3、 确定 TENC1 对 IRS-1 磷酸化的抑制机理 0065 为了确认 TENC1 抑制 IRS-1 磷酸化的机理， 使用 IRS-1 进行免疫沉淀反应。在对 照实验中， 使用磷酸酪氨酸的类似物钒酸盐， 与 PTPase 结。
32、构域结合以抑制 PTPase 的活性。 结果如图 4 和图 5 所示。 0066 如图4所示， 确认了TENC1CS变体比TENC1WT(野生型)更可靠地结合到IRS-1。 此 外， 如图 5 所示， 证实了当不用钒酸盐时， TENC1WT 结合到 IRS-1， 但使用钒酸盐时， 与 IRS-1 的结合减少。基于上述结果， 证实 IRS-1 与钒酸盐竞争结合到 TENC1 的 PTPase 结构域。因 此， 证实了 IRS-1 作为 TENC1 的底物直接结合到 PTPase 结构域中。 0067 此外， 为了测量TENC1的PTPase活性， 首先， Flag免疫沉淀反应/Flag肽洗脱系统。
33、 将 TENC1 从 HEK293 细胞系中分离出来。然后， 使用具有磷酸酪氨酸的肽， 随着时间的推移， 测量分离的TENC1的PTPase活性。 使用孔雀石绿测定法分析PTPase的活性。 使用PTEN(磷 酸酶和张力蛋白同系物 ) 或使用 TENC1 CS 变体作为对照组。结果如图 6 所示。 0068 如图 6A 和图 6B 所示， 证实了 TENC1 与 PTEN 的 PTPase 活性相似， 在 TENC1CS 变体 说 明 书 CN 104066437 A 7 6/8 页 8 中没有 PTPase 活性。基于上述结果， 证实了通过 TENC1 结合到 IRS-1 中通过 PTPas。
34、e 活性 抑制磷酸化。此外， 上述结果意味着 TENC1 抑制 IRS-1 磷酸化以影响糖尿病的发病。 0069 实施例 4、 确定 TENC1 的 IRS-1 降解机理 0070 为了了解 TENC1 的生理功能， 使用腺病毒， 在 L6 肌管 ( 肌细胞 ) 中过表达 TENC1， L6 肌管在 IRS-1 中起重要作用。使用与实施例 1 相同的方法， 进行定量 PCR， 证实， 在肌管 中 TENC1mRNA 增加 8-10 倍。然后， 使用与实施例 2 相同的方法， 测定与 IRS-1 相关的蛋白 质的磷酸化。结果如图 7 所示。 0071 如图 7 所示， 证实了在 TENC1 过量。
35、表达的细胞中， 通过 IRS-1 调节 Akt、 S6K1 和 ERK1/2 的磷酸化受到抑制 ( 参见图 7A 和 7B)。然而， 它证实 IRS-1 蛋白质的数量也减少 ( 参见图 7C)。 0072 为了确定 IRS-1 数量的降低是否是由于抑制的基因表达， 使用 IRS-1 的正向引物 (SEQ ID NO.6) 和反向引物 (SEQ ID NO.7) 通过定量 PCR 来定量 IRS-1 的 mRNA。结果如图 8 所示。 0073 如图8所示， 证实了IRS-1的mRNA的量没有降低。 基于上述结果， 证实， 发生IRS-1 蛋白质的量减少， 不是因为在转录阶段的基因表达， 而是由。
36、于转录阶段之后的基因表达。 0074 因此， 为了确定IRS-1减少的原因， 通过蛋白质印迹法确定TENC1是否影响泛素蛋 白酶体途径或 IRS-1 的丝氨酸磷酸化。为了确定 TENC1 是否影响蛋白质降解机理， 使用了 MG132， 其是一种蛋白质降解酶 ( 蛋白酶 ) 的抑制剂。结果如图 9 所示。 0075 如图 9 所示， 证实， 在不处理胰岛素时 ( 图 9A) 和处理胰岛素时 ( 图 9 B)， 处理 MG132 时的 IRS-1 的减少数量都恢复了， 并且在通过处理 MG132 而恢复 IRS-1 的量的细胞 中， IRS-1 的丝氨酸磷酸化没有区别， 但 IRS-1 磷酸化受到。
37、了抑制。基于上述结果， 证实， TENC1 是通过降解 IRS-1 或抑制其磷酸化以影响 IRS-1 的机理。 0076 为了确定 TENC1 的 PTPase 活性是否影响 IRS-1 的降解， 钒酸盐处理， 通过蛋白质 印迹法确定 IRS-1 的降解是否被抑制。结果如图 10 所示。 0077 如图10所示中， 证实了当钒酸盐处理时， IRS-1降解被抑制。 可以知晓的是， TENC1 的活性直接参与 IRS-1 降解。 0078 实施例 5、 确定 TENC1 和肌肉萎缩的相互关系 0079 在糖皮质激素引起的肌肉萎缩和链脲霉素 (STZ) 引起的急性糖尿病肌肉萎缩中 观察到， 由于 I。
38、RS-1 蛋白质数量的减少， IRS-2 蛋白质数量的增加并且 PI3K/Akt/mTORC1 信 号转导的减少。因此， 为了确定 TENC1 是否会引起肌管萎缩， 进行了如下实验， 使用腺病毒 在肌管中表达绿色荧光蛋白 (GFP)， TENC1 WT 或者 TENC1 CS 过量表达， 用荧光测量肌管的 直径。结果如图 11 所示。 0080 如图 11 所示， 证实， 在 TENC1 过量表达的细胞， 相比 TENC1 CS 过量表达的细胞， 其 尺寸下降了约 40。上面的结果意味着 TENC1 与糖尿病引起的肌肉萎缩有关。 0081 已知的是， 泛素蛋白酶体途径在肌肉萎缩中降解了肌纤维蛋。
39、白如肌球蛋白重链 (MYH)， 其是骨骼肌的主要组成部分。因此， 进行了一个实验来确定 TENC1 是否影响泛素蛋 白酶体途径以减少 MYH。结果如图 12 所示。 0082 如图 12 所示， 通过蛋白质印迹法根据 PTPase 的活性， 证实 TENC1 降解 MYH。基于 上述结果， 证实， TENC1 降解 IRS-1 以抑制 Akt/S6K1 机制， 从而可能造成肌肉萎缩。 说 明 书 CN 104066437 A 8 7/8 页 9 0083 哺乳动物细胞包括三种类型的 FoxO( 叉头框转录因子 O) 蛋白质 ： FoxO1、 FoxO3、 FoxO4。其中， FoxO1 和 F。
40、oxO3 磷酸化对糖皮质激素引起的肌肉萎缩至关重要。特别是激活 的 FoxO3 刺激基因表达， 在肌肉萎缩中发挥重要作用， 即， 各种萎缩基因， 造成肌肉萎缩。因 此， 通过蛋白质印迹法确定 TENC1 是否影响 FoxO1 和 FoxO3 磷酸化。结果如图 13 所示。 0084 如图 13 所示， 在 TENC1 过量表达的肌管 ( 参见图 13A) 中， FoxO1/3a 磷酸化下降。 在 TENC1 CS 过量表达的肌管 ( 参见图 13B) 中， FoxO1 蛋白的量减少， 并且 FoxO1/3a 磷酸 化的量相对增加。此外， 由 FoxO 蛋白质调节的 MuRF1( 肌肉 RING。
41、 指蛋白 1) 在肌管中表达 增加， 该肌管中 TENC1 过量表达 ( 参见图 13C)。基于上述结果， 证实 TENC1 降解 IRS-1 以激 活 FoxO 蛋白质， 这样可能会引起肌管萎缩。 0085 实施例 6、 确定 TENC1 引起的肌肉萎缩 0086 为了确定 TENC1 是否导致体内肌肉萎缩， 通过电穿孔， YFP( 黄色荧光蛋白 ) 结合 的 TENC1， 注入到小鼠的胫骨前肌中。然后， 使用 YFP 测量肌纤维的尺寸变化。结果如图 14 所示。 0087 如图 14A、 14B 和 14C 所示， 证实了注射 TENC1 的肌肉横截面积 (CSA) 在 12 天后下 降了。
42、约 25。然而， 这证实 TENC1 CS 不会造成肌肉萎缩。基于上述结果， 证实由于 PTPase 活性， TENC1 可能导致体内肌肉萎缩。 0088 实施例 7、 确定抑制 TENC1 表达的效果 0089 为了确定 TENC1 可以用作治疗糖尿病的靶标， 使用了 si6 和 si7， 其是特异性结合 到 TENC1 的 siRNA。证实， 当 TENC1 的量减少时， 糖皮质激素引起的 IRS-1 降解被恢复， 来 预防肌管的肌肉萎缩。使用 DeliverX Plus siRNA 转染 (Panomics)， siRNA 被引入 L6 肌管 中。结果如图 15 所示。 0090 如图 。
43、15 所示， 证实， 当 siRNA 用于抑制 TENC1 的表达时， 糖皮质激素引起的 MYH 减 少被有效抑制 ( 参见图 15C)。然而， 可以知晓的是， si7 强烈抑制 TENC1 的表达， 通过 IRS-1 底物蛋白质 (sub-proteins) 活化导致肌肉肥大 ( 参见图 15A 和 15B)。此外， 证实， MuRF1 刺激和由糖皮质激素引起的IRS-1降解(参见图15D)被恢复(参见图15B)， 并且肌肉萎缩 得到抑制 ( 参见图 15F)。 0091 实施例 8、 确定抑制 TENC1 活性的效果 0092 据报道， 乌酸抑制肌肉萎缩并导致肌肉肥大。 然而， 其靶标或者。
44、作用机理尚未明确 确定。 0093 因此， 发明人通过以下实验确定乌酸是否能够靶向 TENC1 调节活性。 0094 特别是， 使用与实施例 3 相同的方法分离的 TENC1 蛋白质， 与 20m 乌酸一起培 养， 然后通过孔雀石绿测量 PTPase 活性的变化 ( 在这种情况下， 使用钒酸盐作为对照组 )。 结果证实 TENC1 的 PTPase 活性被抑制 60或更多 ( 参见图 16A)。 0095 此外， 使用如实施例 2 相同的方法， 当 TENC1 和 IRS-1 过量表达的细胞 (HEK293 细胞系 ) 与测试物质一起培养时， IRS-1 的酪氨酸磷酸化增加， 从而证实， 由 。
45、TENC1 引起的 IRS-1 脱磷酸在细胞水平上被抑制 ( 参见图 16B)。 0096 此外， 将乌酸添加到 TENC1 过量表达的肌管 ( 肌细胞 ) 中， 然后通过蛋白质印迹法 测量 IRS-1 蛋白质的降解程度。因此， 当乌酸的浓度增加时， IRS-1 恢复到与对照组 ( 细胞 中的 TENC1 没有过量表达 ) 相似的水平。因此， 证实， 通过乌酸可以抑制由 TENC1 的活性引 说 明 书 CN 104066437 A 9 8/8 页 10 起的 IRS-1 降解 ( 参见图 16C)。 0097 基于上述结果， TENC1 的活性抑制剂例如乌酸， 抑制由 TENC1 的活性引起。
46、的 IRS-1 脱磷酸和 IRS-1 的降解。因此， 证实， 可以有效地预防由 IRS-1 减少造成的葡萄糖的吸收降 低、 肌肉萎缩等。因此， 可以知晓的是， TENC1 的活性抑制剂可以有效地用于治疗或预防糖 尿病。 0098 本发明的上面描述仅仅是示例， 可以理解的是， 本领域技术人员可以不背离本发 明的范围而且不改变基本特征而进行变型。因此， 上述实施例仅仅作为描述性意义而不是 为了限制本发明。 0099 工业适用性 0100 本发明的 TENC1 表达或活性的抑制剂， 抑制由 TENC1 导致的 IRS-1 的脱磷酸和降 解， 并且能够防止 IRS-1 降低引起的葡萄糖吸收减少和肌肉萎。
47、缩， 因此其可被开发为一种 预防和/或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物。 此外， 本发明提出的筛选方法提供了TENC1 作为一种新的靶标化合物来克服已有的治疗药物的限制。因此， 本发明能够有用地用来开 发一种药物， 其具有预防和 / 或治疗糖尿病或糖尿病并发症的新机理。 说 明 书 CN 104066437 A 10 1/8 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104066437 A 11 2/8 页 12 0003 序 列 表 CN 104066437 A 12 3/8 页 13 0004 序 列 表 CN 104066437 A 13 4/8 页 14 0005 序 列 表 CN。
48、 104066437 A 14 5/8 页 15 0006 序 列 表 CN 104066437 A 15 6/8 页 16 0007 序 列 表 CN 104066437 A 16 7/8 页 17 0008 序 列 表 CN 104066437 A 17 8/8 页 18 序 列 表 CN 104066437 A 18 1/13 页 19 图 1 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 19 2/13 页 20 图 2 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 20 3/13 页 21 图 3 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 21 4/13 页 22 图。
49、 4 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 22 5/13 页 23 图 5 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 23 6/13 页 24 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 24 7/13 页 25 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 25 8/13 页 26 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 26 9/13 页 27 图 12 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 27 10/13 页 28 图 13 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 28 11/13 页 29 图 14 说 明 书 附 图 CN 104066437 A 29 12/13 页 30 。