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1、(10)申请公布号 CN 104127386 A (43)申请公布日 2014.11.05 CN 104127386 A (21)申请号 201410351730.6 (22)申请日 2014.07.22 A61K 9/16(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 武汉工程大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区雄楚大街 693 号 (72)发明人 陈嵘 杨红红 王雅萍 杨浩 吕中 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 。
2、42102 代理人 崔友明 (54) 发明名称 一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及其制备 方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米 微球及其制备方法和应用。该纳米微球为壳聚糖 与三聚磷酸钠交联形成的三维网状结构， 大叶茜 草素以分子形式固定其中， 大叶茜草素的包封率 为 4.58 14.64， 纳米微球的平均粒径为 96 467nm， 纳米微球粒径的多分散系数为 0.25 0.27， 载药量为 5.73 28.153g/mg， Zeta 电位 为 45.07 48.73mV。其制备方法步骤如下 ： (1) 配制壳聚糖组分液 ； (2) 配制大叶茜草素组分液 ； 。
3、(3) 将大叶茜草素组分液逐滴加入壳聚糖组分液 中， 充分搅拌， 并逐滴加入1.03.0mg/mL的三聚 磷酸钠水溶液， 制备得到大叶茜草素 / 壳聚糖纳 米微球。 本发明所制备的纳米微球形状规则、 粒径 较小、 分散性好， 具有显著的抗氧化和抑制癌细胞 作用， 是一种潜在的抗氧化和抗肿瘤制剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104127386 A CN 104127386 A 1/1 页 2 1. 一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳。
4、米微球， 其特征在于 ： 该纳米微球为壳聚糖与三聚磷 酸钠交联形成的三维网状结构， 大叶茜草素以分子形式固定其中， 大叶茜草素的包封率 为 4.58 14.64， 纳米微球的平均粒径为 96 467nm， 纳米微球粒径的多分散系数为 0.25 0.27， 载药量为 5.73 28.153g/mg， Zeta 电位为 45.07 48.73mV。 2. 一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤如下 ： (1) 将壳聚糖溶于含有 0.1 0.5wt泊洛沙姆 188 和 1.0 1.5 (V/V) 醋酸的水溶 液中， 配成 1.0 3.0mg/mL 的壳聚糖水溶液， 然后用微孔。
5、滤膜过滤， 所得滤液经 NaOH 溶液 调节 pH 值为 3.5 4.5， 得到壳聚糖组分液 ； (2) 将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为 1.0 5.0mg/mL 的大叶茜草素乙醇溶 液， 采用微孔滤膜过滤， 得到大叶茜草素组分液 ； (3)将步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入步骤(1)所得壳聚糖组分液中， 充分搅 拌， 并逐滴加入 1.0 3.0mg/mL 的三聚磷酸钠水溶液 , 其中大叶茜草素组分液、 壳聚糖组 分液和三聚磷酸钠水溶液的体积比为 1:5:2， 在 30 40持续搅拌反应 10 60min， 所得 微乳液静置陈化 10 15h， 再后处理即得大叶茜草素 / 壳聚糖纳。
6、米微球。 3. 根据权利要求 2 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 所述壳聚糖脱乙酰度为 82 97， 分子量为 10 50 万。 4. 根据权利要求 2 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 和步骤 (2) 所述微孔滤膜的孔径为 0.45m。 5. 根据权利要求 2 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 所述 NaOH 溶液浓度为 1mol/L。 6. 根据权利要求 2 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤 (3) 所述搅拌速率为 800 1600r/m。
7、in。 7. 根据权利要求 2 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 其特征在于步骤 (3) 所述后处理包括过滤、 透析、 真空冷冻干燥。 8. 一种权利要求 1 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球在制备抗氧化剂方面的应用。 9.一种权利要求1所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球在制备人肝癌细胞抑制剂方面 的应用。 10. 一种权利要求 1 所述的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球在制备人宫颈癌细胞抑制剂 方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 104127386 A 2 1/5 页 3 一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 。
8、涉及一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及其制备方法 和应用。 背景技术 0002 茜草 (Rubia cordifolia L.) 是一种医药学上应用前景广阔的中草药， 而大叶茜 草素 (mollugin) 是茜草科植物中的主要活性成分。研究发现， 大叶茜草素具有良好抗肿 瘤、 抗氧化、 抗诱变、 抗病毒、 抗菌、 抗炎抗风湿、 保护神经、 抑制脂肪积聚、 止血等生物活性， 用于关节炎、 痛经、 大出血、 风湿和泌尿系统紊乱等疾病的治疗， 是一种有着广阔研究价值 和市场前景的植物活性物质。但由于大叶茜草素中酚羟基的存在， 致使该化合物不稳定， 在有机溶剂中易氧化降解 ； 而且大叶茜草素不溶于水。
9、， 生物利用率低， 限制了其发展应用。 相关研究表明， 将纳米技术引入传统中药， 制备纳米中药， 可改善药物水溶性， 利用纳米粒 子的实体瘤的高通透性和滞留效应 (EPR 效应 ) 可实现药物控释缓释、 提高药物靶向性， 从 而提高中药生物利用度 ； 同时， 还可丰富传统中药剂型和给药途径， 解决中药剂型单一的问 题。虽然纳米技术在中医药领域起步较晚， 但已展现出巨大的潜力及广阔的前景。 0003 壳聚糖是自然界中唯一碱性多糖， 天然无毒， 不仅具有生物相容性， 还拥有氨基等 活性基团， 使它在药物的控制与释放、 改善药物的溶解性和吸收性等方面发挥重要作用。 壳 聚糖作为缓释载体具有维持血药浓。
10、度平衡、 降低药物不良反应、 提高药物疗效等优势。 近年 来已公开了一些壳聚糖载药微球的报道。例如， 专利 CN201612864U 提供了一种以壳聚糖与 戊二醛的缩合物为囊壳， 包覆白藜芦醇、 氧化白藜芦醇、 紫檀芪和白皮杉醇的缓释微球， 微 球粒径为2100m ； CN102293752B公开了通过离子交联法联合喷雾干燥法制备壳聚糖载 辣椒素微球， 微球粒径为 0.8 4.5m ； 专利 CN101991541B 报道了通过离子交联法， 经二 次冷冻干燥制备负载阿昔洛韦的壳聚糖 - 明胶纳米粒。这些壳聚糖载药微球的制备方法存 在一定缺陷， 如有些方法使用了有毒试剂(戊二醛)， 有些方法制备。
11、复杂， 反应条件较高(离 子交联法联合二次冷冻干燥法 )， 并且所得到的载药微球粒径均偏大， 分布较广等。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足， 提供一种粒径较 小、 分散良好的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用。 0005 本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为 ： 0006 一种大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球， 该纳米微球为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形 成的三维网状结构， 大叶茜草素以分子形式固定其中， 大叶茜草素的包封率为 4.58 14.64， 纳米微球的平均粒径为 96 467nm， 纳米微球粒径的多分散系数为 0.25 0.2。
12、7， 载药量为 5.73 28.153g/mg， Zeta 电位为 45.07 48.73mV。 0007 本发明还提供了上述大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法， 步骤如下 ： 0008 (1) 将壳聚糖溶于含有 0.1 0.5wt泊洛沙姆 188 和 1.0 1.5 (V/V) 醋酸的 说 明 书 CN 104127386 A 3 2/5 页 4 水溶液中， 配成 1.0 3.0mg/mL 的壳聚糖水溶液， 然后用微孔滤膜过滤， 所得滤液经 NaOH 溶液调节 pH 值为 3.5 4.5， 得到壳聚糖组分液 ； 0009 (2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为1.05.0mg/mL。
13、的大叶茜草素乙醇 溶液， 采用微孔滤膜过滤， 得到大叶茜草素组分液 ； 0010 (3)将步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入步骤(1)所得壳聚糖组分液中， 充 分搅拌， 并逐滴加入1.03.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液， 其中大叶茜草素组分液、 壳聚糖 组分液和三聚磷酸钠溶液的体积比为 1:5:2， 在 30 40持续搅拌反应 10 60min， 所得 微乳液静置陈化 10 15h， 再后处理即得大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球。本发明以壳聚糖 为载体， 三聚磷酸钠为交联剂， 泊洛沙姆 188 为稳定剂， 将大叶茜草素负载到壳聚糖上制备 得到粒径较小、 分散性好的纳米微球。 0011 按上。
14、述方案， 步骤 (1) 所述壳聚糖脱乙酰度为 82 97， 分子量为 10 50 万。 0012 按上述方案， 步骤 (1) 和步骤 (2) 所述微孔滤膜的孔径为 0.45m。 0013 按上述方案， 步骤 (1) 所述 NaOH 溶液浓度为 1mol/L。 0014 按上述方案， 步骤 (3) 所述搅拌速率为 800 1600r/min。 0015 按上述方案， 步骤 (3) 所述后处理包括过滤、 透析、 真空冷冻干燥。 0016 本发明还提供了上述大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的应用， 具体为在制备抗氧化 剂方面的应用， 在制备人肝癌细胞抑制剂方面的应用， 及在制备人宫颈癌细胞抑制剂方面 。
15、的应用。 0017 本发明的有益效果在于 ： 1、 本发明以壳聚糖为载体， 三聚磷酸钠为交联剂， 泊洛沙 姆 188 为稳定剂， 将大叶茜草素负载到壳聚糖上制备得到粒径较小、 分散性好的纳米微球， 解决了现有制备技术中存在的有毒物质残留和载药微球粒径偏大、 粒度分布广、 生物活性 低的问题， 对提高药物的疗效和有效性、 丰富药物剂型有着重要意义。2、 大叶茜草素 / 壳聚 糖纳米微球具有显著地抗氧化和抑制癌细胞活性， 将大叶茜草素制备成纳米微球， 增强了 药物的稳定性， 改善了药物的水溶性， 提高了药物的生物利用率， 为开发治疗和预防由体内 氧化反应引起的心脑血管、 糖尿病、 癌症等疾病的新制。
16、剂提供了新途径， 并对开发中药新剂 型和实现中药现代化具有积极促进作用。 3、 本发明提供的制备方法操作简单， 条件温和， 重 复性好。 以壳聚糖为药物载体， 利用壳聚糖的生物相容和可体内生物降解性能， 可实现药物 的控释缓释。 附图说明 0018 图 1 为本发明实施例 1 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的原子力显微镜 (AFM) 图 ； 0019 图 2 为实施例 2 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的原子力显微镜 (AFM) 图 ； 0020 图 3 为实施例 3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的扫描电子显微镜 (SEM) 图 ； 0021 图 4 为实例 1-3 。
17、所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球清除自由基活性图 ； 0022 图 5 为实例 1-3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌细 胞 (HepG2) 存活率关系图 ； 说 明 书 CN 104127386 A 4 3/5 页 5 0023 图 6 为实例 1-3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人宫颈癌 细胞 (HeLa) 存活率关系图。 具体实施方式 0024 为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案， 下面结合附图对本发明作进 一步详细描述。 0025 实施例 1 0026 本实施例大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法如下 ： 0027。
18、 (1) 将壳聚糖 ( 脱乙酰度 82， 分子量 50 万 ) 溶于含有 0.1wt泊洛沙姆 188 和 1.5 (V/V) 醋酸的水溶液中， 配成 1.0mg/mL 的壳聚糖水溶液， 然后用孔径为 0.45m 的微 孔滤膜过滤， 所得滤液经浓度为 1mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 值为 4.0， 得到壳聚糖组分液 ； 0028 (2) 将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为 1.0mg/mL 的大叶茜草素乙醇溶液， 采用孔径为 0.45m 的微孔滤膜过滤， 得到大叶茜草素组分液 ； 0029 (3) 将 1mL 步骤 (2) 所得大叶茜草素组分液逐滴加入 5mL 步骤 (1) 所得壳。
19、聚糖组 分液中， 充分搅拌(搅拌速率为800r/min)， 并逐滴加入2mL1.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液， 在 33持续搅拌反应 10min， 所得微乳液静置 10h， 采用中速定量滤纸抽滤， 再将滤液放入 800014000截留分子量的透析袋中并在室温下于超纯水中透析3h ； 将透析后的微乳液倒 入培养皿中， 在 -20预冻 12h， 然后在 -50真空冷冻干燥 24h， 即得大叶茜草素 / 壳聚糖 纳米微球。 0030 本实施例所制备的纳米微球平均粒径约为 96nm， 载药量为 5.73g/mg， 包封率为 4.58， PDI 值为 0.26， Zeta 电位为 45.07mV。 0。
20、031 附图 1 为采用 MultiModeTM型原子力显微镜所观察到的本实施例所得大叶茜草素 /壳聚糖纳米微球的AFM图。 由AFM图可以看出， 制备得到的纳米微球球形规则， 粒径均一， 分散良好， 微球平均粒径约为 96nm。 0032 实施例 2 0033 本实施例大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法如下 ： 0034 (1) 将壳聚糖 ( 脱乙酰度 97， 分子量 10 万 ) 溶于含有 0.3wt泊洛沙姆 188 和 1.0 (V/V) 醋酸的水溶液中， 配成 1.2mg/mL 的壳聚糖水溶液， 然后用孔径为 0.45m 的微 孔滤膜过滤， 所得滤液经浓度为 1mol/L 的 N。
21、aOH 溶液调节 pH 值为 3.5， 得到壳聚糖组分液 ； 0035 (2) 将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为 3.0mg/mL 的大叶茜草素乙醇溶液， 采用孔径为 0.45m 的微孔滤膜过滤， 得到大叶茜草素组分液 ； 0036 (3) 将 1mL 步骤 (2) 所得大叶茜草素组分液逐滴加入 5mL 步骤 (1) 所得壳聚糖组 分液中， 充分搅拌 ( 搅拌速率为 1200r/min)， 并逐滴加入 2mL1.5mg/mL 的三聚磷酸钠水溶 液， 在30持续搅拌反应30min， 所得微乳液采用与实施例1相同的方法后处理得大叶茜草 素 / 壳聚糖纳米微球。 0037 本实施例所制备的纳米微。
22、球平均粒径约为 107nm， 载药量为 14.67g/mg， 包封率 为 5.87， PDI 值为 0.25， Zeta 电位为 47.7mV。 0038 附图 2 是本实施例所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的 AFM 图。由 AFM 图可 以看出， 制备得到的载药微球球形规则， 粒径均一， 分散良好， 微球平均粒径约为 107nm。 说 明 书 CN 104127386 A 5 4/5 页 6 0039 实施例 3 0040 本实施例大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球的制备方法如下 ： 0041 (1) 将壳聚糖 ( 脱乙酰度 90， 分子量 30 万 ) 溶于含有 0.5wt泊洛沙姆 1。
23、88 和 1.2 (V/V) 醋酸的水溶液中， 配成 3.0mg/mL 的壳聚糖水溶液， 然后用孔径为 0.45m 的微 孔滤膜过滤， 所得滤液经浓度为 1mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 值为 4.5， 得到壳聚糖组分液 ； 0042 (2) 将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为 5.0mg/mL 的大叶茜草素乙醇溶液， 采用孔径为 0.45m 的微孔滤膜过滤， 得到大叶茜草素组分液 ； 0043 (3) 将 1mL 步骤 (2) 所得大叶茜草素组分液逐滴加入 5mL 步骤 (1) 所得壳聚糖组 分液中， 充分搅拌 ( 搅拌速率为 1600r/min)， 并逐滴加入 2mL3.0mg。
24、/mL 的三聚磷酸钠水溶 液， 在40持续搅拌反应60min， 所得微乳液采用与实施例1相同的方法后处理即得大叶茜 草素 / 壳聚糖纳米微球。 0044 本实施例所制备的纳米微球平均粒径约为 467nm， 载药量为 28.153g/mg， 包封 率为 14.64， PDI 值为 0.27， Zeta 电位为 48.73mV。 0045 附图3是采用LEO1530型扫描电子显微镜所观察到的本实施例所制备的大叶茜草 素 / 壳聚糖纳米微球的 SEM 图。由 SEM 图可以看出， 制备得到的载药纳米微球球形圆整， 表 面光滑， 分散良好， 粒径均一， 微球平均粒径约为 467nm。 0046 实施例。
25、 4 0047 大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球清除自由基活性测试 0048 将二苯代苦味酰基自由基 (DPPH) 用无水乙醇配置成 1mmol/L 的工作液， 实施 例 1、 实施例 2 和实施例 3 所制备的纳米微球亦分别用无水乙醇配成 0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0g/mL 的悬浊液， 待用。实验时将 3.5mL 无水乙醇， 400L DPPH溶液分别和 100L 各悬浊液样品混合均匀， 37于暗处振荡反应1h ； 3000r/min离心5min， 使用UV4500紫外/ 可见分光光度计 ( 美国 PerkinElmer 公司 ) 检测上清液在 517nm 处吸光值， 以无。
26、水乙醇调 零。结果表示为各悬浊液样品对 DPPH自由基的清除率 ( ) (Ac Ai)/Ac100 (Ac 为未加样品的吸光值， Ai为加入样品的吸光值 )。实验均重复三次， 取平均值。 0049 附图 4 是实例 1-3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球清除自由基活性图。结 果表明， 载药纳米微球能清除自由基， 而且载药纳米微球对自由基的清除率随着浓度增加 呈增强趋势。 0050 实施例 5 0051 大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌细胞(HepG2)的细胞毒性测 试 0052 将实施例 1、 实施例 2 和实施例 3 所制备的纳米微球用高糖型 DMEM 细胞培养液配 成。
27、1mg/mL溶液， 超声分散， 现配现用 ； 大叶茜草素用二甲基亚砜配置成5mg/mL溶液， 然后用 高糖型DMEM稀释至5、 15、 30g/mL， 现配现用。 收集对数期HepG2细胞， 以1105个/mL接 种至96孔板中， 每孔接种100L ； 细胞培养至对数生长期， 100L/孔加入纳米微球溶液和 大叶茜草素溶液， 每个浓度 5 孔， 连续培养 48h 后， 每孔避光加入 20L 噻唑蓝 (5mg/mL) 溶 液， 37培养 4h ； 弃去孔内培养液， 每孔加入 100L DMSO， 37恒温低速振荡 30min， 使用 酶标仪在 490nm 处检测吸光值。结果表示为细胞存活率 ( 。
28、) (A1Ai)/(A0Ai)100 (A0为对照孔的吸光值 ； A1为加药孔的吸光值 ； Ai为调零孔的吸光值 )。对比纳米微球和裸 说 明 书 CN 104127386 A 6 5/5 页 7 药 ( 即大叶茜草素 ) 对 HepG2 细胞生长的抑制作用。 0053 附图 5 是实例 1-3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌 细胞 (HepG2) 存活率关系图。由图可知， 所制备的纳米微球能有效抑制 HepG2 细胞的生长， 且实施例1、 实施例2和实施例3所制备的载药纳米微球对HepG2细胞的细胞毒性均优于裸 药。 0054 实施例 6 0055 大叶茜草素 /。
29、 壳聚糖载药纳米微球及大叶茜草素对人宫颈癌细胞 (HeLa) 的细胞 毒性测试 ： 0056 将实施例 1、 实施例 2 和实施例 3 所制备的纳米微球用高糖型 DMEM 细胞培养液配 成1mg/mL溶液， 超声分散， 现配现用 ； 大叶茜草素用二甲基亚砜配置成5mg/mL溶液， 然后用 高糖型 DMEM 稀释至 5、 15、 30g/mL， 现配现用。收集对数期 HeLa 细胞， 以 1105个 /mL 接 种至96孔板中， 每孔接种100L ； 细胞培养至对数生长期， 100L/孔加入纳米微球溶液和 大叶茜草素溶液， 每个浓度 5 孔， 连续培养 48h 后， 每孔避光加入 20L 噻唑蓝。
30、 (5mg/mL) 溶 液， 37培养 4h ； 弃去孔内培养液， 每孔加入 100L DMSO， 37恒温低速振荡 30min， 使用 酶标仪在 490nm 处检测吸光值。结果表示为细胞存活率 ( ) (A1Ai)/(A0Ai)100 (A0为对照孔的吸光值 ； A1为加药孔的吸光值 ； Ai为调零孔的吸光值 )。对比纳米载药微球 和裸药对 HeLa 细胞生长的抑制作用。 0057 附图 6 是实例 1-3 所制备的大叶茜草素 / 壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人宫颈 癌细胞 (HeLa) 存活率关系图。由图可知， 所制备的纳米载药微球能有效抑制 HeLa 细胞的 生长， 而且实施例 1 和实施例 2 所制备的载药纳米微球对 HeLa 细胞的细胞毒性优于裸药。 说 明 书 CN 104127386 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104127386 A 8 2/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104127386 A 9 3/3 页 10 图 6 说 明 书 附 图 CN 104127386 A 10 。