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1、(10)申请公布号 CN 102847198 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102847198 A *CN102847198A* (21)申请号 201210345312.7 (22)申请日 2012.09.17 A61L 27/22(2006.01) A61L 15/32(2006.01) A61L 31/04(2006.01) (71)申请人 浙江星月生物科技股份有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街道 海曙路 9 号 3 幢 2 楼 (72)发明人 陈隆坤 其他发明人请求不公开姓名 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理。
2、人 黄美娟 王兵 (54) 发明名称 一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种难溶于水的丝素蛋白膜及 其制备与应用 ： 将质量浓度 0.330% 丝素蛋白溶 液倒入水平的模具内， 将模具置于 560， 相对 湿度 1070% 条件下干燥， 获得丝素蛋白膜 ； 将丝 素蛋白膜在 50100， 相对湿度 70100% 条件下 放置 20200min， 再依次用乙醇水溶液、 纯化水充 分浸洗， 获得难溶于水的丝素蛋白膜 ； 本发明以 丝素蛋白为原料， 膜及其降解产物生物相容性好 ； 本发明制备工艺简单， 环保无毒 ； 所发明膜在湿 润环境下， 致密而柔软， 能阻止细胞。
3、、 微生物及生 物大分子穿过 ； 贴滑型膜的粗糙面有利于膜的固 定、 创面止血和引导组织再生 ； 在防粘连膜、 护创 膜和人工膜补片领域具有广阔的市场。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于所述丝素蛋白膜按如下方法制备 ：（1） 以 桑蚕丝为原料， 经脱胶、 溶解、 透析， 获得截留液 a， 将截留液 a 或截留液 a 的浓缩液过滤或 离心， 取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液 ；（2） 。
4、取步骤 （1） 得到的丝素蛋白溶液， 将丝 素蛋白溶液的质量浓度用水调整至 0.330%， 倒入模具内， 所述模具内丝素蛋白溶液加入量 以丝素蛋白质量计为 150mg/cm2 模具， 将模具在温度 560， 相对湿度 1070% 条件下干 燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成丝素蛋白膜 ；（3） 将模具在温度 50100， 相对湿度 70100% 条件下放置 20200min 进行湿热交联， 然后置于体积浓度 5090% 的乙醇水溶液中 浸洗 1060min， 去除模具， 丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗 30150min 至无醇， 获得难溶于 水的丝素蛋白膜。 2. 如权利要求 1 所述的难溶于。
5、水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （1） 所述截留液 a 的 浓缩液制备方法为 ： 将透析后的透析袋放入质量浓度 2060% 的聚乙二醇水溶液中， 静置 110h， 取截留液 b 即为截留液 a 的浓缩液 ； 所述聚乙二醇平均分子量 100010000。 3. 如权利要求 1 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （1） 所述截留液 a 或 截留液 a 的浓缩液过滤或离心方法为下列之一 ： a） 将截留液 a 或截留液 a 的浓缩液于 4、 30006000g 条件下离心 520min， 弃去沉淀， 取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液 ； b） 将截 留液 a 或截留液 a 的浓缩液用孔。
6、径为 220m 的滤器过滤， 去除不溶性颗粒， 滤液即为所述 的丝素蛋白溶液。 4. 如权利要求 1 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （2） 所述模具为底部 光滑平整且水平的模具。 5. 如权利要求 1 或 4 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （2） 所述模具 利用浮法玻璃制成的底部光滑平整且水平的模具， 所述模具内质量浓度 0.330% 的丝素 蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为 150mg/cm2模具， 将模具在温度 560， 相对湿 度 1070% 条件下干燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成表面光滑的丝素蛋白膜 ； 将模具 在温度 50100， 相对湿度 7。
7、0100% 条件下放置 20200min 进行湿热交联， 然后置于体积 浓度 5090% 的乙醇水溶液中浸洗 1060min， 去除模具， 丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗 30150min， 获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。 6. 如权利要求 1 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （2） 所述模具为底部 毛糙且水平的模具。 7. 如权利要求 1 或 6 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （2） 所述模具底 部为浮法玻璃经磨砂获得粗糙面的模具， 所述模具内质量浓度 0.330% 的丝素蛋白溶液的 加入量以丝素蛋白质量计为 150mg/cm2模具， 将模具在温度 560， 相。
8、对湿度 1070% 条 件下干燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成一面光滑， 一面粗糙的丝素蛋白膜 ； 将模具 在温度 50100， 相对湿度 70100% 条件下放置 20200min 进行湿热交联， 然后置于体积 浓度 5090% 的乙醇水溶液中浸洗 1060min， 去除模具， 丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗 30150min， 获得难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。 8. 如权利要求 1 所述的难溶于水的丝素蛋白膜， 其特征在于步骤 （1）所述脱胶、 溶 解、 透析方法为 ： a）脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝放入 48L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 90100 水浴 2060min， 纯水。
9、清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝胶蛋白， 留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在 2060烘干， 获得干燥后的丝素蛋白 ； b） 溶解 ： 将上述干燥后的丝素蛋白溶于 911M 的溴 权 利 要 求 书 CN 102847198 A 2 2/2 页 3 化锂水溶液中， 5565水浴 30300min 至丝素蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白的混合液 ； 所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为 0.10.2:1 ； c） 透析 ： 将含丝素蛋 白的混合液用截留分子量 100020000 道尔顿的透析袋进行透析， 用 10 倍混合液体积的无 菌去离子水作为透析液在 3 天透析 1012 次， 去除。
10、溶液中的溴化锂成分， 获得截留液 a。 9. 如权利要求 18 之一所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、 护创膜或人工 膜中的应用。 10. 如权利要求 9 所述的应用， 其特征在于所述人工膜为引导骨再生膜、 胸膜、 硬脑膜、 硬脊膜、 鼓膜或眼角膜。 权 利 要 求 书 CN 102847198 A 3 1/7 页 4 一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法， 特别涉及一种难溶于水的丝素蛋白膜 及其制备和应用。 （二） 背景技术 0002 蚕丝是强度最好的天然纤维之一， 由 7080% 的丝素蛋白和 2030% 的丝胶蛋。
11、白 组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由 “甘氨酸 - 丙氨酸 - 甘氨酸 - 丙氨酸 - 甘氨酸 - 丝 氨酸” (GAGAGS) 的重复单元构成， 其中甘氨酸、 丙氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的 85% 以上。该重复序列绝大多数位于丝素蛋白的结晶区， 并自组装成反向平行折叠链构象 （anti-parallel -sheet） 结构。 这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的 特性。 0003 丝胶蛋白在体内会引起炎症反应， 在使用前需要需进行脱胶处理 （degummed） 。丝 素蛋白由分子量为 325KD 和 25KD 两种蛋白组成， 其降解产物为氨基酸。大量的研究表明 丝素蛋白具有良。
12、好的生物相容性， 其体内炎症反应 （inflammatory responses） 要远低于胶 原和聚乳酸等常用生物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史， 经编织后作为 人工韧带和组织补片已在研究领域应用。 但在目前的生物材料研究领域应用更多的是再生 型丝素蛋白。 即丝素蛋白经过脱胶、 溶解、 提纯后， 再通过物理、 化学的方法， 形成海绵状、 膜 状、 凝胶状、 微球状等形态。 0004 在丝素蛋白膜的制备方面， 中国发明专利 “一种可溶高弹性丝素蛋白膜的制备 方法” （CN101234212A） 中， 将提纯后的丝素蛋白溶液在聚苯乙烯培养皿在恒温恒湿箱内 （温 度 4070， 相对。
13、湿度 6080%） 直接干燥形成厚度为 3050um 可溶性膜。中国发明专利 “再 生丝素蛋白膜及其制备方法” （公开号 CN 101760027A） 中， 将提纯后的丝素蛋白溶液在 PS 皿内直接干燥成膜 （未对干燥条件提出要求） ， 再用极性溶剂 （C1-C5 醇和水混合物、 水或水 蒸汽） 结合力学拉伸， 进行溶胀变性处理， 以改善丝素蛋白膜的脆性， 即增加拉伸伸长率。中 国发明专利 “一种难溶于水的透明丝素蛋白膜及其制备方法” （CN101967282A） 中， 在提纯 后的丝素蛋白溶液中加入多元醇作为交联剂， 将两者混合物在模具中经鼓风干燥成膜， 再 在相对湿度为 3098% 的环境。
14、中处理 148 小时 （未对处理温度提出要求） ， 获得所需要的膜。 中国发明专利 “柔韧丝素蛋白膜及其制备方法” （CN1316465） 中， 通过加入环氧树脂来交联 丝素蛋白制备不溶于水的丝素蛋白膜。 0005 现有丝素蛋白膜的制备方法， 均是丝素蛋白溶液或其混合物灌注在模具内， 通过 溶剂挥发干燥， 溶质沉积于模具底部， 进而形成厚度约 10500um 的可溶或难溶于水的膜。 在该步骤的成膜过程中， 模具底部上表面的平整性和水平性， 模具是否处于振动环境， 吹在 溶液表面的风速， 都将影响膜厚度的均一性和膜表面的微观结构 ； 该步骤成膜过程中， 干燥 的温湿度条件， 也将影响膜的透明性和。
15、膜均一性 （如温度过高， 会在膜内形成微气泡） ； 该步 骤中膜的干燥程度， 也影响膜的性能 ； 该步骤膜的干燥时间约几小时到几天， 模具所处环境 的洁净程度， 将影响膜的微生物和内毒素含量 ； 该步骤形成的膜， 再通过后续步骤的极性溶 说 明 书 CN 102847198 A 4 2/7 页 5 液或湿热条件等处理， 处理温湿度也会对膜的结晶程度造成影响。 0006 针对上述问题， 本发明专利期望通过最简单和最经济的方法， 获得一种难溶于水 的丝素蛋白膜。 （三） 发明内容 0007 本发明目的是提供一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备方法和应用， 制备工艺中 不接触有毒物质， 未使用变性、 促。
16、凝和交联等添加剂， 制备工艺简单， 利于大量生产 ； 模具底 面采用表面极其平整的浮法玻璃， 并将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台 ； 通过改 变模具底部上表面的光滑或粗糙程度， 将获得两种不同表面结构的丝素蛋白膜 ： 底部光滑 模具制备的双滑型膜， 膜的两面均是光滑面， 膜为半透明至近透明状， 而底部毛糙模具制备 的贴滑型膜， 一面光滑， 另一面粗糙， 粗糙面有利于膜在创面的固定， 利于止血、 细胞粘附和 增殖 ； 通过控制该膜的厚度及其结晶程度， 产生不同理化性能 （如力学、 柔韧度） 和生物学 性能 （体内降解速率） ， 满足不同用途的需要 ； 该膜在湿润条件会吸收 3040% 水分。
17、， 膜会变 的柔软 （厚度 10100um） ， 大于 150um 的柔韧性较差 ； 膜降解产物为氨基酸， 膜及其降解产 物具有良好的生物相容性 ； 膜能阻止细胞、 微生物及生物大分子穿过， 具有一定的水汽渗透 性能 ； 该膜在防粘连膜、 护创膜或人工膜 （引导骨再生膜、 牙周膜、 胸膜、 硬脑膜或硬脊膜、 鼓 膜、 眼角膜） 等领域具有广阔的市场。 0008 本发明采用的技术方案是 ： 0009 一种难溶于水的丝素蛋白膜， 所述丝素蛋白膜按如下方法制备 ：（1） 以桑蚕蚕丝 为原料， 经脱胶、 溶解、 透析， 获得截留液 a， 将截留液 a 或截留液 a 的浓缩液过滤或离心， 取 滤液或上层。
18、离心液得到丝素蛋白溶液 ；（2） 取步骤 （1） 得到的丝素蛋白溶液， 将丝素蛋白溶 液的质量浓度用纯化水调整至 0.330%（优选 0.5 15%） （取部分丝素蛋白溶液在 60 烘干至恒重， 计算丝素蛋白溶液的含水量， 从而计算用纯化水调整丝素蛋白溶液所需的水 量） 倒入模具内， 所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为 150mg/cm2模具 （优 选 230mg/cm2， 更有效 320mg/cm2） ， 在温度 560（优选 3555， 更优选 45） ， 相对湿 度 （RH） 1070%（优选 2050%， 最优选 40%） 条件下干燥至无肉眼可见的水分， 模具重量增加 了所。
19、加入丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的 1.21.8 倍， 在模具内形成丝素蛋白膜 ；（3） 将模 具在温度 50100（优选 6080， 更优选 6570） ， RH 为 70100%（优选 8595%， 最优选 90%） 条件下放置 20200min（优选 60150min， 最优选 120min） 进行湿热交联， 然后置于体 积浓度 5090%（优选 75%） 的乙醇水溶液中浸洗 1060min（优选 30min） ， 去除模具， 丝素蛋 白膜再用纯化水充分浸洗 30150min（优选 60120min） 至无醇， 获得难溶于水的丝素蛋白 膜， 通常厚度为 10500m， 优选厚度 20200。
20、m。 0010 进一步， 步骤 （1） 所述截留液 a 的浓缩液的制备方法是将透析后的透析袋放入质 量浓度 2060% 的聚乙二醇水溶液中， 静置 110h 进行浓缩， 取截留液 b 即为截留液 a 的浓 缩液 ； 所述聚乙二醇平均分子量 100010000。 0011 进一步， 步骤 （1） 所述截留液 a 或截留液 a 的浓缩液过滤或离心方法为下列之一 ： a） 将截留液 a 或截留液 a 的浓缩液于 4、 30006000g 条件下离心 520min， 弃去沉淀， 取 上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液 ； b） 将截留液 a 或截留液 a 的浓缩液用孔径为 220m 的滤器过滤， 去除不溶。
21、性颗粒， 取滤液即为所述的丝素蛋白溶液。 说 明 书 CN 102847198 A 5 3/7 页 6 0012 进一步， 步骤 （2） 所述模具为底部光滑平整且水平的模具。 0013 进一步， 本发明优选采用底部为浮法玻璃的正方形模具 （优选边长 20cm） ， 所述 模具内质量浓度 0.330%（优选 0.515%） 的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为 150mg/cm2模具 （优选 230mg/cm2， 更优选 320mg/cm2） ， 将模具在温度 560， 相对湿度 （RH） 1070% 条件下干燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成两面光滑的丝素蛋白膜 ； 将模 具在温度 50。
22、100， RH 为 70100% 条件下放置 20200min 进行湿热交联， 然后置于体积 浓度 5090% 的乙醇水溶液中浸洗 1060min， 去除模具， 丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗 30150min， 获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。 0014 更进一步， 步骤 （2） 所述模具为底部表面毛糙且水平的模具。 0015 更进一步， 本发明优选采用底部为浮法玻璃经磨砂获得粗糙面的正方形模具 （优 选边长 20cm） ， 所述模具内质量浓度 0.330%（优选 0.515%） 的丝素蛋白溶液的加入量以 丝素蛋白质量计为 150mg/cm2模具 （优选 230mg/cm2， 更优选 320m。
23、g/cm2） ， 将模具在温度 560， RH 为 1070% 条件下干燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成一面光滑、 另一面粗 糙的丝素蛋白膜 （厚度为 10500m） ； 将模具在温度 50100， RH 为 70100% 条件下放置 20200min 进行湿热交联， 然后置于体积浓度 5090% 的乙醇水溶液中浸洗 1060min， 去除 模具， 丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗 30150min， 获得难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。 0016 进一步， 步骤 （1） 所述截留液 a 的浓缩液是指当所需丝素蛋白溶液质量浓度小于 5% 时不需要浓缩， 直接将截留液 a 过滤或离心， 获得丝素蛋白。
24、溶液 ； 当所需丝素蛋白溶液质 量浓度大于5%时， 将所述截留液a进行浓缩， 所述浓缩方法为 ： 将透析后的透析袋放入质量 浓度 2060% 的聚乙二醇水溶液中， 静置浓缩 110h， 取截留液 b 即为截留液 a 的浓缩液， 将 截留液 a 的浓缩液过滤或离心后制成丝素蛋白溶液， 再用去离子水将丝素蛋白溶液调整为 530% ； 所述聚乙二醇平均分子量 100010000。 0017 进一步， 步骤 （1）所述脱胶、 溶解、 透析方法为 ： a）脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝放入 48L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 90100水浴 2060min， 纯水清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝 。
25、胶蛋白， 留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在 2060烘干， 获得干燥后的丝素蛋白， 备用 ； b） 溶 解 ： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比 0.100.20 ： 1 溶于 911M 的溴化锂水溶液中， 5565水浴 30300min 至丝素蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白的混合液 ； c） 透析 ： 将含丝 素蛋白的混合液用截留分子量 100020000 道尔顿的透析袋进行透析， 用 10 倍混合液体积 的无菌去离子水作为透析液在3天透析1012次， 去除溶液中的溴化锂成分， 获得截留液a。 0018 本发明还提供所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、 护创膜或人工膜中 的应用。 001。
26、9 进一步， 所述的人工膜为牙周膜、 骨引导再生膜、 胸膜、 硬脑膜、 硬脊膜、 鼓膜或眼 角膜。 0020 本发明所模具可以使各种材质制作的平皿或盒体， 优选浮法玻璃制作的方形皿。 0021 本发明所述难溶于水的丝素蛋白膜制备中， 在固定面积模具内加入丝素蛋白质量 决定了最终丝素蛋白膜的厚度， 即所述膜厚度与单位模具面积的丝素蛋白加入量和浓度相 关。当模具面积一定时， 调整丝素蛋白溶液质量浓度或加入体积来获得不同厚度的难溶于 水的丝素蛋白膜。如果模具底部表面光滑则获得双面光滑的难溶于水的双滑型丝素蛋白 膜， 如果模具底部表面毛糙则获得一面光滑、 另一面粗糙的难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。 说 。
27、明 书 CN 102847198 A 6 4/7 页 7 本发明所制备的难溶于水的丝素蛋白膜厚度为 10500m， 在 37生理盐水中， 24h 丝素蛋 白溶失率小于 1%。 0022 本发明所述聚乙二醇的平均分子量为 100010000。 0023 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在 ：（1） 本发明所述的难溶于水的 丝素蛋白膜制备工艺过程中不接触有毒物质， 制备工艺简单， 利于大量生产 ；（2） 本发明难 溶于水的丝素蛋白膜以丝素蛋白为原料， 模具采用表面极其平整的浮法玻璃， 并将模具存 放于水平可精细调整的不锈钢平台， 底部光滑模具制备的双滑型丝素蛋白膜的两面均是光 滑面， 底。
28、部粗糙模具制备的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑， 一面粗糙， 所述膜为半透明至近透 明状， 现有研究已经证明丝素蛋白及其降解产物 （氨基酸） 拥有良好的生物相容性 ；（3） 本发 明难溶于水的丝素蛋白膜易于控制不同的厚度及其结晶程度， 进而产生不同的物理 （如力 学、 透光度、 水汽渗透性） 和生物学性能 （如降解时间） ， 满足不同用途的需求 ；（4） 本发明难 溶于水的双滑型丝素蛋白膜在湿润条件下柔软、 光滑、 致密， 具有阻止细胞、 微生物和生物 大分子穿过的功能， 并拥有高透光率， 尤其适用于防粘连膜、 眼角膜、 护创膜领域 ；（5） 本发 明难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑， 另一面粗糙。
29、， 粗糙面有利于膜的固定， 减少缝合 针数或无需缝合固定， 利于创面止血、 细胞粘附和增殖， 进而具有诱导组织再生作用， 尤其 适用于， 在防粘连膜、 人工膜 （引导骨再生膜、 牙周膜、 胸膜、 硬脑膜、 硬脊膜、 眼角膜或鼓膜） 等领域具有广阔的市场。 （四） 附图说明 0024 图 1 丝素蛋白膜的红外吸收光谱 （FTIR-ATR） 。 0025 图 2 丝素蛋白膜 （100m） 光滑面的扫描电镜图。 0026 图 3 丝素蛋白膜 （100m） 粗糙面的扫描电镜图。 （五） 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0028 。
30、实施例 1（500m） 0029 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： a） 脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝 （浙江华芝丝绸有限责任公 司， 5A 级） 放入 5L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 96水浴 30min， 纯化水清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝胶蛋白， 留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在 50烘干， 获得 70g 干燥后的丝素蛋白， 备用 ； b） 溶解 ： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比 0.2 ： 1 溶于 9.3M 的溴化锂 （LiBr） 水溶液 中， 60水浴 90min 至丝素蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合 液 ； c） 透析 ： 将混合液用再生纤。
31、维素透析袋 （截留分子量 4000 道尔顿） 透析， 用 10 倍混合液 体积的无菌纯化水在 3d 透析 12 次， 去除溶液中的 LiBr 离子， 获得截留液 a ； d） 浓缩 ： 将透 析后的透析袋放入 4 倍体积的质量浓度 50% 聚乙二醇 （PEG， 分子量 7000） 水溶液， 室温静置 浓缩 5h， 取截留液 b， 即获得截留液 a 的浓缩液 ； e） 将截留液 b 在水平转子 5000g， 4， 离心 10min， 除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒， 取上清液， 即获得提 纯后的丝素蛋白溶液 300ml ； f） 浓度测定 ： 取提纯后的丝素蛋白溶液 10m。
32、l， 在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为 20%。丝素蛋白溶液 4保存备用。 说 明 书 CN 102847198 A 7 5/7 页 8 0030 （2） 将模具 （底部为浮法玻璃， 边长20cm的正方形皿， 其它实施例模具材质相同） 调 整水平， 加入质量浓度 20% 的丝素蛋白溶液 100ml （20000mg 丝素蛋白） ， 在温度 40， RH40% 环境静置晾干至肉眼无可见液体， 比空模具重量增加 30g， 在模具底部形成丝素蛋白膜。 0031 （3） 将模具置于温度 70， RH92% 的恒温恒湿箱内进行湿热交联 120min， 然后用体 积浓度 75% 乙醇水溶。
33、液浸泡 20min， 去除模具， 膜用纯化水洗涤 3 次， 每次 20min， 切去丝素 蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜， 获得厚度为 500m 难溶于水的双滑型丝 素蛋白膜。红外吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪 （型号 Nicolet 6700） ， 检测方法 ： 全 反射光谱， 见图1所示。 扫描电镜型号为Hitachi S-3000N。 力学检测设备为 （model15543， instron， canton， MA） ， 拉伸速度为 100mm/min。 0032 实施例 2（200m） 0033 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： a） 脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝 （浙江。
34、华芝丝绸有限责任公 司， 5A 级） 放入 5L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 95水浴 30min， 去离子水清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝胶蛋白， 留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在 50烘干， 获得 70g 干燥后的丝素蛋白， 备用 ； b） 溶解 ： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比 0.2 ： 1 溶于 9.3M 的溴化锂 （LiBr） 水溶液 中， 60水浴 90min 至丝素蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合 液 ； c） 透析 ： 将上述混合液用再生纤维素透析袋 （截留分子量 8000 道尔顿） 透析， 用 10 倍混 合液体积的无菌去离子水在 3d 透析。
35、 12 次， 去除溶液中的 LiBr 离子， 获得截留液 a ； d） 将截 留液 a 在水平转子 5000g， 4， 离心 10min， 除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存 在不溶性颗粒， 取上清液即获得提纯后的丝素蛋白溶液 1000ml ； e） 浓度测定 ： 取提纯后的 丝素蛋白溶液 10ml， 在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为 5%。丝素蛋 白液 4保存备用。 0034 （2） 将模具 （同实施例1） 调整水平， 加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液160ml （8000mg 丝素蛋白） ， 去除内部产生的气泡。在温度 45， RH40% 环境静置晾干至肉眼无。
36、可 见液体， 比空模具重量增加 12g， 在模具底部形成丝素蛋白膜。 0035 （3） 将模具置于温度 68， RH90% 的湿热交联箱内放置 120min， 然后用体积浓度 75%乙醇水溶液浸泡20min， 去除模具， 膜用纯化水洗涤3次， 每次20min， 切去丝素蛋白膜边 缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜， 获得厚度为 200m 难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。 0036 实施例 3（100m） 0037 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： a） 脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝 （浙江华芝丝绸有限责任公 司， 5A 级） 放入 5L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 98水浴 30min， 去离子水。
37、清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝胶蛋白， 留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在 50烘干， 获得 70g 干燥后的丝素蛋白， 备用 ； b） 溶解 ： 将丝素蛋白以质量体积比 0.20 ： 1 溶于 9.3M 的溴化锂 （LiBr） 水溶液中， 60水 浴 90min 至丝素蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液 ； c） 透析 ： 将混合液用再生纤维素透析袋 （截留分子量 2000 道尔顿） 透析， 用 10 倍混合液体积的无菌 去离子水在 3d 透析 12 次， 去除溶液中的 LiBr 离子， 获得截留液 a ； d） 将截留液 a 用孔径 10m 的滤器， 除去底部的不溶。
38、性颗粒， 取滤液即获得提纯后的丝素蛋白溶液 1200ml ； e） 浓 度测定 ： 取提纯后的丝素蛋白溶液 10ml， 在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质 量浓度为 4%。丝素蛋白液 4保存备用。 0038 （2） 将模具 （同实施例 1） 调整水平， 加入质量浓度 4% 丝素蛋白液 100ml（2000mg 说 明 书 CN 102847198 A 8 6/7 页 9 丝素蛋白） ， 去除内部产生的气泡。在温度 50， RH50% 环境静置晾干至肉眼无可见液体， 比 空模具重量增加 6g， 在模具底部形成丝素蛋白膜。 0039 （3） 将模具置于温度 65， RH90% 的湿热交联。
39、箱内放置 100min， 然后用体积浓度 75%乙醇水溶液浸泡20min， 去除模具， 膜用纯化水洗涤3次， 每次20min， 切去丝素蛋白膜边 缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜， 获得厚度为 100m 难溶于水的双滑型丝素蛋白膜， 光滑面电镜扫描图见图 2 所示。 0040 实施例 4（50m） 0041 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： a） 脱胶 ： 将 100g 桑蚕蚕丝 （浙江华芝丝绸有限责任公 司， 5A 级） 放入 5L 的 2M 碳酸钠水溶液中， 98水浴 30min， 去离子水清洗， 该过程重复 3 次， 脱去丝胶蛋白， 留下丝素蛋白， 丝素蛋白 50烘干， 获得 70g 丝素。
40、蛋白， 备用 ； b） 溶解 ： 将丝 素蛋白以质量体积比 0.2 ： 1% 溶于 9.3M 的溴化锂 （LiBr） 水溶液中， 60水浴 90min 至丝素 蛋白充分溶解， 获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液 ； c） 透析 ： 将混合液用再 生纤维素透析袋 （截留分子量 8000 道尔顿） 透析， 用 10 倍混合液体积的无菌去离子水在 3d 透析 12 次， 去除溶液中的 LiBr 离子， 获得截留液 a ； d） 将截留液 a 用孔径 10m 的滤器， 除 去底部的不溶性颗粒， 获得提纯后的丝素蛋白溶液 1200ml ； e） 浓度测定 ： 取提纯后的丝素 蛋白溶液 10ml，。
41、 在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质量浓度为 4%。丝素蛋 白液 4保存备用。 0042 （2） 将丝素蛋白溶液用无菌去离子水稀释成质量浓度 2%， 将模具 （同实施例 1） 调 整水平， 加入质量浓度 2% 丝素蛋白溶液 100ml （800mg 丝素蛋白） ， 去除内部产生的气泡。在 温度 55， RH50% 环境静置晾干至肉眼无可见液体， 比空模具重量增加 3g， 在模具底部形成 丝素蛋白膜。 0043 （3） 将模具置于温度 65， RH88% 的湿热交联箱内放置 100min， 然后用体积浓度 75%乙醇水溶液浸泡20min， 去除模具， 膜用纯化水洗涤3次， 每次20。
42、min， 切去丝素蛋白膜边 缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜， 获得厚度为 50m 难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。 0044 实施例 5（500m） 0045 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： a） 脱胶和 b） 溶解操作同实施例 1， c） 透析 ： 将混合液 用再生纤维素透析袋 （截留分子量 3000 道尔顿） 透析， 用 10 倍混合液体积的无菌纯水在 3d 透析 12 次， 去除溶液中的 LiBr 离子， 获得截留液 a ； d） 浓缩 ： 将透析后的透析袋放入 5 倍积 质量浓度 30% 聚乙二醇 （PEG， 分子量 5000） 水溶液， 室温静置浓缩 5h， 取截留液 b， 即获得截 。
43、留液 a 的浓缩液 ； e） 将截留液 b 在水平转子 5100g， 4， 离心 10min， 除去底部的未溶解丝 素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒， 取上清液， 即获得提纯后的丝素蛋白溶液 300ml ； f） 浓度测定 ： 同实施例 1。 0046 （2） 将模具改为 ： 边长 20cm 的正方形皿， 底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗 糙面， 粗糙面朝向丝素蛋白膜面。 其它操作同实施例1， 获得厚度为500m难溶于水的贴滑 型丝素蛋白膜。 0047 实施例 6（200m） 0048 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： 将步骤 d） 水平转子改为 5100g， 4， 离心 10min， 其它。
44、 操作同实施例 2， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为 5%。丝素蛋白液 4保存备用。 0049 （2） 将模具改为 ： 边长 20cm 的正方形皿， 底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗 说 明 书 CN 102847198 A 9 7/7 页 10 糙面， 粗糙面朝向丝素蛋白膜面。 其它操作同实施例2， 获得厚度为200m的难溶于水的贴 滑型丝素蛋白膜， 粗糙面电镜扫描见图 3 所示。 0050 实施例 7（100m） 0051 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： 将再生纤维素透析袋改为截留分子量 8000 道尔顿进行 透析， 其它操作同实施例 3， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为 4。
45、%。丝素蛋白液 4 保存备用。 0052 （2） 将模具改为 ： 边长 20cm 的正方形皿， 底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗 糙面， 粗糙面朝向丝素蛋白膜面。 其它操作同实施例3， 获得厚度为100m难溶于水的贴滑 型丝素蛋白膜。 0053 实施例 8（50m） 0054 （1） 丝素蛋白溶液的制备 ： 操作同实施例 4， 质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质 量浓度为 4%。丝素蛋白液 4保存备用。 0055 （2） 将模具改为 ： 边长 20cm 的正方形皿， 底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗 糙面， 粗糙面朝向丝素蛋白膜面。其它操作同实施例 4， 获得厚度为 50m 难溶于水的贴滑 型丝素蛋白膜。 0056 表 1 双滑型丝素蛋白膜的主要性能参数 0057 说 明 书 CN 102847198 A 10 1/3 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102847198 A 11 2/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102847198 A 12 3/3 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102847198 A 13 。