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1、(10)申请公布号 CN 102907458 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102907458 A *CN102907458A* (21)申请号 201210416722.6 (22)申请日 2012.10.28 A01N 63/04(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 7/04(2006.01) (71)申请人 郑文定 地址 中国澳门高楼街 26 号 7 楼 B 座 申请人 苏晓庆 (72)发明人 苏晓庆 (74)专利代理机构 贵阳东圣专利商标事务有限 公司 52002 代理人 袁庆云 (54) 发明名称 生物灭蚊剂及其制备方法 (57)。
2、 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 生 物 灭 蚊 剂 及 其 制 备 方 法，由 灭 蚊 真 菌 与 灭 蚊 细 菌 复 配 制 得，以 1g 湿 菌 丝 的 灭 蚊 真 菌 计， 配 以 灭 蚊 细 菌 苏 云 金 杆 菌 以 色 列 变 种 （Bacillusthuringiensisvar.israelensis） 的 个 数 为 1.4104 1.410 18或 配 以 灭 蚊 细 菌 球 形 芽 孢 杆 菌 （Bacillussphaericu）的 个数为 2.5104 2.510 20。灭蚊真菌为贵 阳 腐 霉 （PythiumguiyangenseSu）或 卡 地 腐 霉 。
3、（PythiumcaronlinianumMatthews） 。本发明具有 既快速灭蚊、 又持久制蚊的效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 1/2 页 2 1. 一种生物灭蚊剂， 其特征在于 ： 由灭蚊真菌与灭蚊细菌复配制得， 以 1g 湿菌丝的灭 蚊真菌计， 配以灭蚊细菌苏云金杆菌以色列变种个数为 1.4104 1.41018或配以灭蚊 细菌球形芽孢杆菌的个数为 2.5104 2.51020。 2. 如权利要求 1 所述的生物灭蚊剂， 其特征在于 ： 灭蚊真菌为贵阳腐。
4、霉或卡地腐霉。 3. 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5 天， 培养温度 25 1， 摇床 转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将灭蚊真菌菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种灭蚊细菌于灭蚊细菌液体培养基 。
5、, 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1； 48 小时后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 1.4104 2.51020， 得芽孢悬液 ； （6） 按 1 10ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与微胶囊混匀， 包装。 4. 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5 天， 培养温度 25 1， 摇床 转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 将准备好的灭蚊真菌菌液在无菌条件下加入 BF 培养基， 每 100。
6、 克 （湿重） 培养基加 菌液 15ml, 拌匀， 静置培养， 培养温度 25 1 ； （3） 采用灭蚊细菌液体培养基， 接种灭蚊细菌， 摇床培养 48 小时， 摇床速度 ： 120rmp, 培养温度 30 1； 将培养好的菌液在无菌条件下加入 HF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养 基加菌液 15ml， 拌匀， 静置培养， 培养温度 30 1 ； （4） 5 天后， 将上述培养物按灭蚊真菌培养物 : 灭蚊细菌培养物 =1:3 的比例均匀拌在 一起， 包装。 5.如权利要求3或4所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中KPYG2培养基的制备方法为 ： 将1.5克蛋白胨、 1.5克酵母粉 、 。
7、3.0克葡萄糖、 0.025克胆固醇、 0.11克无水氯化钙、 1.0克 玉米油混合， 加水至 1000 毫升， 用时 121灭菌 30min。 6. 如权利要求 3 或 4 所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 SFE 的制备方法为 ： 生葵花 籽 100 克加水 1000 毫升， 粉碎， 6 层纱布过滤， 滤液再加水至 2000 毫升 ； 分装冷冻于 -20， 用时， 取出解冻， 121灭菌 30min。 7. 如权利要求 3 或 4 所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中灭蚊细菌液体培养基为 Bti 液体培养基， 其制备方法为 ： 将 0.7g 酵母膏、 0.2g 硫酸镁、 1g 蛋白胨、 1。
8、g 磷酸氢二钾、 1g 葡 萄糖、 和 0.2g 硫酸铵混合， 加蒸馏水至 1000ml， pH 值为 7.0-7.2， 121灭菌 30min。 8. 如权利要求 3 或 4 所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中灭蚊细菌液体培养基为 Bs 液体培养基， 其制备方法为 ： 将 3.0g 蛋白胨、 5.0g 牛肉膏、 5.0g 酵母膏、 0.01g MnCl2.4H2O、 0.1g CaCl2.2H2O、 0.2g MgCl2.6H2O， 加蒸馏水至1000ml， pH值为7.0-7.2， 121灭菌30min。 9. 如权利要求 3 或 4 所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 BF 培养基的制备。
9、方法为 ： 米 糠粉加面粉按 1:1-3:1 混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为 60ml 水 /100g 糠面混合物， 121灭 菌 30 分钟。 权 利 要 求 书 CN 102907458 A 2 2/2 页 3 10. 如权利要求 3 或 4 所述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 HF 培养基的制备方法为 ： 麦麸粉加面粉按 1:1-3:1 混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为 60ml 水 /100g 麸面混合物， 121 灭菌 30 分钟。 权 利 要 求 书 CN 102907458 A 3 1/8 页 4 生物灭蚊剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体来说涉。
10、及一种生物灭蚊剂， 同时还涉及该生物灭 蚊剂的制备方法。 0002 背景技术 0003 农业害虫和林业害虫每年给人类的农业、 林业生产带来严重的损失。 同时， 蚊虫不 但骚扰人群， 而且可以传播 20 多种疾病， 威胁人类健康。由于化学农药的发明， 人们从虫口 里夺回了粮食， 也控制了媒介昆虫的数量， 减少了虫媒传染病的流行。 0004 然而长期大量使用化学杀虫剂带来了严重问题。1） 环境污染， 对人及生物的健康 造成危害。 农药中的重金属残留在土壤中， 造成土壤变质， 农业减产 ； 农产品残毒含量高， 出 口受阻 ； 2） 生态平衡被破坏 ： 化学农药把害虫和益虫全杀死， 使自然界控制害虫的。
11、天敌大 大减少， 害虫数量反弹， 造成更大的危害 ； 3） 害虫产生抗药性 ： 昆虫极易产生抵抗农药毒性 的能力， 使农药施用的剂量越来越大， 甚至农药完全失效。 而开发新的化学杀虫剂要花大量 资金和时间 （据统计， 约 1 亿美元和 10 年时间开发一种新农药） 。 0005 生物防治是采用害虫天敌或可对害虫致病的微生物来控制或杀灭害虫。 其所采用 的 “杀虫剂” 有对害虫高度特异性， 对非靶生物无毒无害， 不污染环境， 不破坏生态平衡， 不 易诱导害虫的抗药性的优点， 所以是很理想的害虫防治方法。 但无论国际国内， 农业害虫的 生物防治较之医学昆虫的生物防治要发达很多， 医学昆虫的生物防治。
12、是薄弱环节。 0006 到目前为止， 用得最广的生物灭蚊剂为苏云金杆菌以色列变种 （Bacillus thuringiensis var. israelensis, 简称Bti） 。 它是胃毒型灭蚊剂。 它芽孢囊内的伴孢晶 体含有毒素蛋白。该伴孢晶体被蚊幼虫吃进消化道即被肠内分泌物分解， 释放 - 内毒素， 作用于肠上皮细胞， 使其溶解。肠壁损坏， 大量细菌进入血体腔引起败血症。蚊虫在细菌毒 素和败血症的作用下很快死亡。Bti 的优点是灭蚊能力强， 灭蚊速度快， 但是它在环境中生 存时间比较短， 持效期不长。实验证明它在阳光照射下灭蚊能力急剧下降。加上自然环境 中水质、 水温， 以及淤泥吸附等。
13、因素的影响， 它的持效时间一般为 1-10 天， 特别是目前市场 上比较多用的菌液和可湿性粉剂， 持效性比较低。加上悬浮剂后， 持效期可延长 10 多天， 只 有少数情况 （如加大剂量） 下可延长达 1 个多月。另外， 由于 Bti 的杀蚊机理比较简单， 有可 能诱导蚊虫针对其毒素产生抗性。 0007 另一种灭蚊细菌球形芽孢杆菌 （Bacillus sphaericu, 简称 Bs） ， 它与 Bti 一样， 也属于胃毒类杀虫剂。Bs 是一种普通的革兰氏阳性菌。其杀虫毒素是二元毒素蛋白质， 主 要位于芽孢和细胞壁， 有些位于伴孢晶体。菌株产生分子量为 51.4kD 和 41.9kD 的两种毒 。
14、素原蛋白， 被蚊虫吞食后， 在蚊幼虫肠道中活化成毒素， 并发挥作用， 使幼虫死亡。 Bs的灭蚊 作用较 Bti 慢， 持效期较 Bti 稍长， 但在室外也一般为 1个月左右。Bti 和 Bs 是胃毒型杀蚊 剂， 必须被蚊虫吃进去才能把蚊虫杀死， 当它们被淤泥掩盖或包裹则不起作用。 0008 贵阳腐霉 （Pythium guiyangense Su, 简称 Pg） 是一种灭蚊真菌。其无性繁殖阶 说 明 书 CN 102907458 A 4 2/8 页 5 段游动孢子可以在水中主动搜寻蚊幼虫， 在幼虫体壁囊化， 发出芽管， 伸入后者体内， 生长 繁殖， 夺取营养， 破坏组织， 使蚊幼虫死亡。 其菌。
15、丝再从蚊尸中伸出体表， 释放游动孢子进一 步感染新的蚊幼虫， 从而在蚊群中造成流行病， 产生长期制约蚊虫种群的效果。同时， 由于 Pg 的灭蚊机理复杂， 涉及很多环节， 蚊虫不易产生抗药性。但是， Pg 的灭蚊过程比较慢， 在 刚施用时杀蚊作用不明显， 因而不易被大家接受， 其应用由此受限。 0009 另一种灭蚊真菌卡地腐霉 （Pythium caronlinianum Matthews） 的灭蚊效果与 Pg 类似。 0010 发明内容 0011 本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种既快速灭蚊、 又持久制蚊的生物灭 蚊剂。 0012 本发明的另一目的在于提供该生物灭蚊剂的制备方法。 001。
16、3 本发明的一种生物灭蚊剂， 由灭蚊真菌与灭蚊细菌复配制得， 以 1g 湿菌丝的灭蚊 真菌计， 配以灭蚊细菌苏云金杆菌以色列变种 （Bti） 个数为1.41041.41018或配以灭 蚊细菌球形芽孢杆菌 （Bs） 的个数为 2.5104 2.51020。 0014 其中 ： 灭蚊真菌为贵阳腐霉 （Pg） 或卡地腐霉。 0015 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5 天， 培养温度 25 1， 摇床 转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 。
17、配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将灭蚊真菌菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种灭蚊细菌于灭蚊细菌液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1； 48 小时后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 1.4104 1.41019， 得芽孢悬液 ； （6） 按 1 10ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与微胶囊混匀， 包装。 0016 一种生物灭蚊剂的制备方法。
18、， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养灭蚊真菌 5 天， 培养温度 25 1， 摇床 转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 将准备好的灭蚊真菌菌液在无菌条件下加入 BF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加 菌液 15ml, 拌匀， 静置培养， 培养温度 25 1 ； （3） 采用灭蚊细菌液体培养基， 接种灭蚊细菌， 摇床培养 48 小时， 摇床速度 ： 120rmp, 培养温度 30 1； 将培养好的菌液在无菌条件下加入 HF 培养基， 每 100 克 （湿重） 。
19、培养 基加菌液 15ml， 拌匀， 静置培养， 培养温度 30 1 ； （4） 5 天后， 将上述培养物按灭蚊真菌培养物 : 灭蚊细菌培养物 =1:3 的比例均匀拌在 一起， 包装。 0017 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 KPYG2 培养基的制备方法为 ： 将 1.5 克蛋白 胨、 1.5 克酵母粉 、 3.0 克葡萄糖、 0.025 克胆固醇、 0.11 克无水氯化钙、 1.0 克玉米油混合， 说 明 书 CN 102907458 A 5 3/8 页 6 加水至 1000 毫升， 121灭菌 30min ； 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 SFE（葵花籽培养基） 的制备方法为 ：。
20、 生葵花籽 100 克加水 1000 毫升， 粉碎， 6 层纱布过滤， 滤液再加水至 2000 毫升 ； 分装冷冻于 -20。用时， 取出解冻， 121灭菌 30min ； 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中灭蚊细菌液体培养基为苏云金杆菌以色列变种液 体培养基， 其制备方法为 ： 将 0.7g 酵母膏、 0.2g 硫酸镁 （MgSO47H2O） 、 1g 蛋白胨、 1g 磷酸 氢二钾、 1g 葡萄糖、 和 0.2g 硫酸铵混合， 加蒸馏水至 1000ml， pH 值为 7.0-7.2， 121灭菌 30min。 （固体培养基加琼脂 1.5%-2%） ； 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中灭蚊细。
21、菌液体培养基为球形芽孢杆菌液体培养 基， 其制备方法为 ： 将 3.0g 蛋白胨、 5.0g 牛肉膏、 5.0g 酵母膏、 0.01g MnCl2.4H2O、 0.1g CaCl2.2H2O、 0.2g MgCl2.6H2O， 加蒸馏水至 1000ml， pH 值为 7.0-7.2， 121灭菌 30min。 （固 体培养基加琼脂 1.5%-2%） 。 0018 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中 BF 培养基的制备方法为 ： 米糠粉加面粉按 1:1-3:1 混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为 60ml 水 /100g 糠面混合物， 121灭菌 30 分钟 ； 上述的生物灭蚊剂的制备方法， 其中。
22、 HF 培养基的制备方法为 ： 麦麸粉加面粉按 1:1-3:1 混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为 60ml 水 /100g 麸面混合物， 121灭菌 30 分钟。 0019 本发明与现有技术相比， 具有明显的有益效果， 从以上技术方案可知 ： 利用的灭蚊 真菌 Pg 或卡地腐霉是兼性寄生类微生物。其菌丝和游动孢子可以在环境中适合的有机物 中生长， 因此， 它可以在蚊虫生境中定植、 循环， 从而达到长期制蚊的目的。 这一优点可以大 大减少施药次数， 降低灭蚊成本且蚊虫不易产生抗药性。真菌通过释放的游动孢子主动搜 寻蚊幼虫， 并从其体表入侵， 因此其攻击蚊虫的机会就比较多。 加之它可以在蚊虫生境中。
23、生 长繁殖， 特别是可以在被灭蚊细菌杀死的蚊幼虫尸体中繁殖， 有利于菌株的复壮， 因此其控 制蚊虫种群的作用就比较稳固而持久。将其与灭蚊速度快， 但是持效时间短的灭蚊细菌进 行复配， 通过本发明的制备方法从而获得一种新型的生物灭蚊剂。该新型生物灭蚊剂综合 了二者的优点， 不仅能够较快地杀灭水中蚊幼虫， 还能在较长时间保持对水中蚊虫种群的 抑制作用。 从现代生态学的观点来考虑， 治理蚊虫不是要消灭蚊虫， 而是通过实现生态系统 的平衡和和谐， 来达到对蚊虫密度的控制的目的。 从这一角度考虑， 本新型生物灭蚊剂有其 他灭蚊剂不可比拟的优势。 0020 具体实施方式 0021 实施例 1 ： 一种生物。
24、灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； 说 明 书 CN 102907458 A 6 4/8 页 7 （5） 接种 B。
25、ti 菌于 Bti 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小 时后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 1.4105， 得芽孢悬液 ； （6） 按 1ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 0022 其中 ： KPYG2 培养基的制备方法为 ： 将 1.5 克蛋白胨、 1.5 克酵母粉 、 3.0 克葡萄 糖、 0.025 克胆固醇、 0.11 克无水氯化钙、 1.0 克玉米油混合， 加水至 1000 毫升， 121灭菌 30min ； SFE（葵花籽培养基） 的制备方法为 ： 生葵花籽 100 克加水 。
26、1000 毫升， 粉碎， 6 层纱布过 滤， 滤液再加水至 2000 毫升 ； 分装冷冻于 -20。用时， 取出解冻， 121灭菌 30min ； Bti 液体培养基的制备方法为 ： 将0.7g酵母膏、 0.2g硫酸镁 （MgSO4 7H2O） 、 1g蛋白胨、 1g磷酸氢二钾、 1g葡萄糖、 和0.2g硫酸铵混合， 加蒸馏水至1000ml， pH值为7.0-7.2， 121 灭菌 30min。 （固体培养基加琼脂 1.5%-2%） 。 0023 实施例 2 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 2。
27、5 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种 Bti 菌于 Bti 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小 时后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 1.41019， 得芽孢悬液 ； （。
28、6） 按 1.2ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 0024 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0025 Bti 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0026 实施例 3 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； 。
29、（4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种 Bti 菌于 Bti 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小 时后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 1.4109， 得芽孢悬液 ； （6） 按 1ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 0027 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0028 Bti 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0029 说 明 书 C。
30、N 102907458 A 7 5/8 页 8 实施例 4 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5。
31、） 接种 Bs 菌于 Bs 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小时 后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 2.5105， 得芽孢悬液 ； （6） 按 2.2ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 0030 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0031 Bs 液体培养基的制备方法为 ： 将 3.0g 蛋白胨、 5.0g 牛肉膏、 5.0g 酵母膏、 0.01g MnCl2.4H2O、 0.1g CaCl2.2H2O、 0.2g MgCl2.6H2O， 加蒸馏水至100。
32、0ml， pH值为7.0-7.2， 121 灭菌 30min。 （固体培养基加琼脂 1.5%-2%） 。 0032 实施例 5 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形。
33、成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种 Bs 菌于 Bs 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小时 后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 2.51021， 得芽孢悬液 ； （6） 按 2.2ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 0033 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0034 Bs 液体培养基的制备方法实施例 4. 实施例 6 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg5 天， 培养温度 25 1，。
34、 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 配制 1% 3%（W/V） 海藻酸钠溶液 ； （3） 将 Pg 菌丝悬液与海藻酸钠溶液按 1:4 比例混合， 拌匀 ； （4） 将上述混合液缓慢滴入 1% 5% （W/V） 氯化钙溶液 , 微胶囊颗粒形成， 沉淀， 0.5 3 小时后滤出微胶囊， 清水冲洗备用 ； （5） 接种 Bs 菌于 Bs 液体培养基 , 摇床培养， 转速 120rpm, 温度 30 1 ； 48 小时 后， 离心收集芽孢， 用时稀释至以下密度 ： 2.5109， 得芽孢悬液 ； （6） 按 2.。
35、2ml 细菌芽孢悬液 /100g 微胶囊的比例将芽孢悬液与 Pg 微胶囊混匀， 包装。 说 明 书 CN 102907458 A 8 6/8 页 9 0035 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0036 Bs 液体培养基的制备方法同实施例 4。 0037 实施例 7 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 将准备好的 Pg 菌液在无。
36、菌条件下加入 BF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加菌液 15ml, 拌匀， 静置培养， 培养温度 25 1 ； （3） 采用 Bti 的液体培养基， 接种 Bti 菌， 摇床培养 48 小时， 摇床速度 ： 120rmp, 培养 温度 30 1； 将培养好的菌液在无菌条件下加入 HF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加 菌液 15ml， 拌匀， 静置培养， 培养温度 30 1 ； （4） 5 天后， 将上述培养物按 Pg 培养物 : 细菌培养物 =1:3 的比例均匀拌在一起， 包装。 0038 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 003。
37、9 Bti 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0040 BF 培养基的制备方法为 ： 米糠粉加面粉按 1:1-3:1 混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为 60ml 水 /100g 糠面混合物， 121灭菌 30 分钟 ； HF培养基的制备方法为 ： 麦麸粉加面粉按1:1-3:1混合， 再加蒸馏水拌匀， 比例为60ml 水 /100g 麸面混合物， 121灭菌 30 分钟。 0041 实施例 8 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 。
38、次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 将准备好的 Pg 菌液在无菌条件下加入 BF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加菌液 15ml, 拌匀， 静置培养， 培养温度 25 1 ； （3） 采用 Bs 的液体培养基， 接种 Bs 菌， 摇床培养 48 小时， 摇床速度 ： 120rmp, 培养温 度 30 1； 将培养好的菌液在无菌条件下加入 HF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加菌 液 15ml， 拌匀， 静置培养， 培养温度 30 1 ； （4） 5 天后， 将上述培养物按 Pg 培养物 : 细菌培养物 =1:3 的比例均匀拌在一起， 包装。
39、。 0042 其中 ： SFE 或 KPYG2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0043 Bs 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0044 BF 培养基、 HF 培养基的制备方法同实施例 7。 0045 实施例 9 ： 一种生物灭蚊剂的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 采用 SFE 或 KPYG2 液体培养基摇床培养 Pg 5 天， 培养温度 25 1， 摇床转速 120rpm ； 滤出菌丝， 无菌水洗涤 3 次， 加水至原体积， 粉碎机高速粉碎 10 秒， 备用 ； （2） 将准备好的卡地腐霉 （Pythium caronlinianum Matthews） 菌液在无菌条件下加入 。
40、说 明 书 CN 102907458 A 9 7/8 页 10 BF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加菌液 15ml, 拌匀， 静置培养， 培养温度 25 1 ； （3） 采用 Bs 的液体培养基， 接种 Bs 菌， 摇床培养 48 小时， 摇床速度 ： 120rmp, 培养温 度 30 1； 将培养好的菌液在无菌条件下加入 HF 培养基， 每 100 克 （湿重） 培养基加菌 液 15ml， 拌匀， 静置培养， 培养温度 30 1 ； （4） 5 天后， 将上述培养物按 Pg 培养物 : 细菌培养物 =1:3 的比例均匀拌在一起， 包装。 0046 其中 ： SFE 或 KPYG。
41、2 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0047 以上为液体培养基， 固体培养基需按 1.5% 加琼脂。高温高压消毒后倒在培养皿 中， 冷却即可 ； Bs 液体培养基的制备方法同实施例 1。 0048 BF 培养基、 HF 培养基的制备方法同实施例 7。 0049 灭蚊效果实验例 一方法 室内实验 ： 白色塑料盒盛过夜自来水 200ml, 致倦库蚊 （Culex quinquefaciatus） 2-3 龄幼虫 25 只， 4% 鸡肝粉悬液 6 滴为基本条件， 再分别加入待测灭蚊剂， 定时观察蚊虫死亡数， 计算死 亡率。每组 3 个重复， 设空白组做对照。 0050 室外实验 ： 长期实验中，。
42、 待前一批蚊虫死亡或羽化后， 再加入下一批蚊虫， 继续观 察。 0051 室外实验 ： 小型储水桶 （下直径15cm, 上直径20cm, 深24cm） 盛水4L, 桶底加入灭菌土壤约50g, 灭菌木屑 7g。为模拟自然状况中蚊虫不断繁殖， 不定期加入 2-3 龄实验室饲养的致倦库 蚊幼虫。各实验组设空白对照组 ( 除不加任何灭蚊细菌或真菌外， 其他条件均与实验组相 同 )。每组 3 个重复。每 3 天一次调查蚊虫密度。 0052 二实验结果 ： 说 明 书 CN 102907458 A 10 8/8 页 11 注 ： 表中数据跟不同字母者数据差异有统计学意义。 说 明 书 CN 102907458 A 11 。