两性离子聚合物生物缀合物以及相关的方法.pdf

两性离子聚合物和混合荷电共聚物生物缀合物，用于制成和使用所述生物缀合物的方法。

权利要求书两性离子聚合物生物缀合物，其包含与生物分子共价偶联的一种或多种两性离子聚合物。
权利要求1的缀合物，其中所述两性离子聚合物包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:

其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R2和R3独立地选自：烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[‑(CH2‑CR4)n‑]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)O‑]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，SO，SO2或PO;
M+是与(A=O)O‑阴离子中心相缔合的反离子;
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;和
n是1至约10,000的整数。
权利要求2的缀合物，其中R1，R2和R3独立地选自C1‑C3烷基。
权利要求2的缀合物，其中L1选自‑C(=O)O‑(CH2)n‑和‑C(=O)NH‑(CH2)n‑，其中n是1‑20。
权利要求2的缀合物，其中L2是‑(CH2)n‑，其中n是1‑20的整数。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子是蛋白。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子是核酸。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子是碳水化合物。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子是脂。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子是小分子。
权利要求1的缀合物，其中所述生物分子相对于其未缀合的形式具有增加的热稳定性。
权利要求1的缀合物，其中所述缀合物抵抗离液剂的变性并且适于以阴离子放射治疗剂(例如I125‑和I135‑)进行的蛋白加载。
组合物，其包含权利要求1‑12中任一项的缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
混合荷电共聚物生物缀合物，其包含与生物分子共价偶联的一种或多种混合荷电聚合物。
权利要求14的缀合物，其中所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:

其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)‑OM)是阴离子中心，其中A是C，SO，SO2或PO，且M为金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)‑OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
p是1至约10,000的整数。
权利要求14的缀合物，其中R4‑R8独立地选自C1‑C3烷基。
权利要求14的缀合物，其中L3选自‑C(=O)O‑(CH2)n‑和‑C(=O)NH‑(CH2)n‑，其中n是1‑20。
权利要求14的缀合物，其中L4是‑(CH2)n‑，其中n是1‑20的整数。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子是蛋白。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子是核酸。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子是碳水化合物。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子是脂。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子是小分子。
权利要求14的缀合物，其中所述生物分子相对于其未缀合的形式具有增加的热稳定性。
权利要求14的缀合物，其中所述缀合物抵抗离液剂的变性并且适于以阴离子放射治疗剂进行的蛋白加载。
组合物，其包含权利要求14‑25中任一项的缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

说明书两性离子聚合物生物缀合物以及相关的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月6日递交的美国临时申请号61/259,088的权益，在此以其全部通过引用而明确地并入。
政府许可权利声明
本发明是以海军研究办公室授予的No.00140910137合约和国家科学基金授予的合约No.DMR‑0705907之下的政府支持进行的。政府在本发明中有一定的权力。
发明背景
蛋白和肽治疗剂构成制药市场中逐渐增加的份额，其中2008年在美国的销售中，生物学药物构成了约四十五亿美元。在这些生物学药品中有单克隆抗体、激素和治疗性酶。
尽管有生物制药市场的成长，治疗性蛋白的实施仍然是有挑战性的任务。蛋白的内在物理和化学不稳定性可导致构象改变，降解，凝聚，沉淀和吸附到表面上，其中的每一项都可减少蛋白的活性或使其完全失活。
一旦被施用，治疗性蛋白容易有短的半衰期，蛋白分解，调理素作用并且可引起免疫原性应答，这每一项都引起不希望的药代动力学。已开发了各种技术来改善这些不足。在这些技术中包括氨基酸操控，免疫球蛋白结构域或血清蛋白的基因融合，以及与天然和合成的聚合物的缀合。
一个成功的实施方案是治疗性蛋白与聚乙二醇(PEG)的共价缀合，所述PEG是非毒性、非免疫原性的聚合物。PEG与治疗性蛋白的缀合过程通常被称作聚乙二醇化。已知聚乙二醇化改变生物分子的物理和化学特性，这包括构象，静电结合和疏水性，并且可引起药物的改善的药代动力学特性。聚乙二醇化的优势包括药物溶解性的改善和免疫原性的削弱，增加的药物稳定性和一旦施用时的循环寿命，以及蛋白分解和肾排泄的减少，这允许了降低的给药频率。
聚乙二醇化技术已被有利地应用于治疗性蛋白和寡核苷酸，以提供被U.S.FDA批准的新药:腺甙脱氨酶(Pegademenase)，天冬酰胺酶(培门冬酶)，G‑CSF(聚乙二醇非格司亭)，干扰素‑α2a(Peginterferon‑α2a)，干扰素‑α2b(Peginterferon‑α2b)，hGH(培维索孟)，抗VEGF适体(哌加他尼钠)，促红细胞生成素(PEG‑EPO)和抗TNF αFab'(赛妥珠单抗)。
目前获准的且在市场上的聚乙二醇化的治疗性酶包括用于从血流中清除某些氨基酸以饿死生长中的肿瘤细胞的耗竭性酶。实例包括PEG‑天冬酰胺酶，PEG‑甲硫氨酸酶和PEG‑精氨酸脱亚胺酶。对于这些酶，它们相对小的氨基酸底物能够扩散通过PEG层，进入酶的活性位点，并且按照所设计的被有效地处理。然而，没有能够开发出需要聚合保护和作用于更大的底物的生物分子，因为使酶保留在体内所需的聚乙二醇化水平使得活性位点不可及。
聚乙二醇化和聚乙二醇化的生物分子不是没有其缺点的。由于其对于水的强的吸引，已知PEG具有的流体动力学直径显著大于由其分子量将预测出的大小。这种鼓胀效应可归因于身体识别生物分子的能力的降低并引起生物分子活性的下降。
用十个(10)5kDa PEG聚乙二醇化的鼠A7单克隆抗体具有的活性是未修饰的抗体的活性的10%。类似地，用一个40kDa PEG聚乙二醇化的干扰素‑α2a具有的活性是未修饰的蛋白的活性的7%。清楚地，产生自聚乙二醇化的对生物分子的活性位点的修饰或阻碍在生物制药产品的开发中是要被避免的严重问题。
尽管有由聚乙二醇化提供的、在生物制药药品开发中的进展，仍存在需求以进一步推进生物制药药品开发，以克服与聚乙二醇化的药品相关的缺点，以及提供改善的试剂和生物制药产品。本发明力求满足这一需求并提供其它相关的优势。
发明概述
本发明提供了聚合物生物分子缀合物，用于制成所述缀合物的试剂和方法，以及用于使用缀合物的方法。
一方面，本发明提供了两性离子聚合物生物缀合物，其包含与生物分子共价偶联的一种或多种两性离子聚合物。
在一个实施方案中，所述两性离子聚合物包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:

其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[‑(CH2‑CR4)n‑]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)O‑]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，SO，SO2或PO;
M+是与(A=O)O‑阴离子中心相缔合的反离子；
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;且
n是1至约10,000的整数。
另一方面，本发明提供了混合荷电共聚物生物缀合物，其包含与生物分子共价偶联的一种或多种混合荷电聚合物。
在一个实施方案中，所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:

其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)‑OM)是阴离子中心，其中A为C，SO，SO2或PO，且M是金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)‑OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
p是1至约10,000的整数。
对于上述缀合物，代表性的生物分子包括蛋白，核酸，碳水化合物，脂类和小分子。在某些实施方案中，相对于其未缀合的形式，所述生物分子具有增加的热稳定性。在某些实施方案中，所述缀合物通过离液剂来抵抗变性并且适于用阴离子放射治疗剂(例如I125‑和I135‑)进行的蛋白加载。
在另一方面，本发明提供了组合物，其包括一种或多种本发明的缀合物和药学上所接受的载体或稀释剂。
附图说明
通过参考下面的详细描述并与附图相结合，将更好地理解从而更容易认可本发明的前述方面以及许多所伴随的优势。
图1是本发明的代表性两性离子聚合物‑蛋白缀合物的制备的图示。利用代表性的两性离子单体(CBMA)和NHS酯引发剂，通过原子转移自由基聚合合成了代表性的NHS‑酯封端的两性离子聚合物。所述NHS‑酯封端的两性离子聚合物通过使NHS‑酯与可得的氨基(例如，赖氨酸残基的氨基)进行反应而与蛋白相缀合。
图2A和2B比较了CT‑PEG(LD，MD和HD)(图2A)与本发明的代表性两性离子聚合物‑蛋白缀合物CT‑pCB(LD，MD和HD)(图2B)的凝胶渗透色谱。CT‑pCB缀合物是pCB MnEq。包括了未缀合的CT用于比较。
图3A和3B比较了CT‑PEG(LD，MD和HD)与本发明的代表性两性离子聚合物‑蛋白缀合物CT‑pCB(LD，MD和HD)的热稳定性。CT‑pCB缀合物是pCB MnEq.(图3A)和pCB RhEq.(图3B)。包括了未缀合的CT用于比较。
图4比较了在尿素中孵育时，CT‑PEG(LD，MD和HD)与本发明的代表性两性离子聚合物‑蛋白缀合物CT‑pCB(LD，MD和HD)的化学稳定性。CT‑pCB缀合物为pCB MnEq.和pCB RhEq。包括了未缀合的CT用于比较。
图5比较了在100%血清中、在7天中，CT‑PEG(LD，MD和HD)与本发明的代表性两性离子聚合物‑蛋白缀合物CT‑pCB(LD，MD和HD)的稳定性。包括了未缀合的CT用于比较。
图6A和6B比较了聚合物类型和缀合程度对于kcat的影响，其中使用了基于肽的底物(图6A)和小分子底物(图6B)。
图7A和7B比较了聚合物类型和缀合程度对于米歇利斯常数(km)的影响，其中使用了基于肽的底物(图7A)和小分子底物(图7B)。
图8A和8B比较了聚合物类型和缀合程度对于催化效率(kcat/km)的影响，其中使用了基于肽的底物(图8A)和小分子底物(图8B)。
发明详述
本发明提供了聚合物生物分子缀合物，用于制成所述缀合物的试剂和方法，以及使用缀合物的方法。
一方面，本发明提供了两性离子聚合物生物分子缀合物。如本文中所使用的，术语“两性离子聚合物生物分子缀合物”或“两性离子聚合物生物缀合物”是指通过与两性离子聚合物相缀合而被修饰的生物分子。
另一方面，本发明提供了混合荷电共聚物生物分子缀合物。如本文中所使用的，术语“混合荷电共聚物生物分子缀合物”或“混合荷电共聚物生物缀合物”是指通过与混合荷电共聚物缀合而被修饰的生物分子。
所述生物分子可被修饰以包括一种或多种两性离子聚合物，或者一种或多种混合荷电聚合物，其与所述生物分子共价偶联。
两性离子聚合物
两性离子聚合物生物缀合物包含与生物分子共价偶联的一种或多种两性离子聚合物。
在一个实施方案中，所述两性离子聚合物包含多个重复单元，每个重复单元都具有式(I):

其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R2和R3独立地选自烷基和芳基，或者与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[‑(CH2‑CR4)n‑]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)‑O‑]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，SO，SO2或PO;
M+是与(A=O)O‑阴离子中心相缔合的反离子;
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
*代表重复单元与下一个重复单元共价相连的点。
混合荷电共聚物
所述混合荷电共聚物生物缀合物包含与生物分子共价偶联的一种或多种混合荷电共聚物。
如本文中所使用的，术语“混合荷电共聚物”是指共聚物，其具有：聚合物主链、多个带正电的重复单元和对个带负电的重复单元。实施本发明时，可通过离子对共聚单体的聚合而制备这些共聚物。
混合荷电共聚物包括多个带正电的重复单元和多个带负电的重复单元。在一个实施方案中，所述混合荷电共聚物是基本上电中性的。如本文中所使用的，术语“基本上电中性的”是指赋予共聚物有利的非污染特性的共聚物。在一个实施方案中，基本上电中性的共聚物是具有基本上为零的净电荷的共聚物(即，具有大约相同数目的带正电的重复单元和带负电的重复单元的共聚物)。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目之比为约1∶1.1至约1∶0.5。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目之比为约1∶1.1至约1∶0.7。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目之比为约1∶1.1至约1∶0.9。
离子对共聚单体.在一个实施方案中，通过合适的可聚合离子对共聚单体的共聚来制备共聚物。
可用于本发明的代表性离子对共聚单体具有式(II)和(III):
CH2=C(R4)‑L3‑N+(R6)(R7)(R8)X‑  (II)
CH2=C(R5)‑L4‑A2(=O)‑OM    (III)
在这种实施方案中，交联的聚合物(例如水凝胶)具有重复单元，所述重复单元具有式(IV):

其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1‑C6烷基和C6‑C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)‑OM)是阴离子中心，其中A是C，SO，SO2或PO，且M是金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)‑OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;
p是1至约10,000的整数;且
*代表重复单元与下一个单元共价连接的点。
在一个实施方案中，R7和R8是C1‑C3烷基。
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心。在一个实施方案中，R6，R7和R8为C1‑C 3烷基。
在某些实施方案中，L3选自‑C(=O)O‑(CH2)n‑和‑C(=O)NH‑(CH2)n‑，其中n是1至20的整数。在某些实施方案中，L3是‑C(=O)O‑(CH2)n‑，其中n是1‑6。
在某些实施方案中，L4是C1‑C20烯烃链。代表性的L4基团包括‑(CH2)n‑，其中n是1‑20(例如1，3或5)。
在某些实施方案中，A是C或SO。
在某些实施方案中，n是5至约5,000的整数。
在一个实施方案中，R4，R5，R6，R7和R8为甲基，L3为‑C(=O)O‑(CH2)2‑，且L4为‑CH2‑，A1是C或SO，且n为5至约5,000的整数。
在上面的式中，聚合物主链包括其源自乙烯基单体的乙烯基主链(即‑C(R′)(R″)‑C(R′″)(R″″)‑，其中R′，R″，R′″和R′″独立地选自氢，烷基和芳基)(例如丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，苯乙烯)。
在上面的式中，N+是阳离子中心。在某些实施方案中，所述阳离子中心是季铵(例如与L1，R2，R3和L2相连接的N)。除了铵之外，其它有用的阳离子中心(例如R2和R3，连同N)包括咪唑鎓,三唑鎓,吡啶鎓,吗啉鎓,噁唑烷鎓,吡嗪鎓,哒嗪鎓,嘧啶鎓,哌嗪鎓和吡咯烷鎓。
R1‑R8独立地选自氢，烷基和芳基。代表性的烷基包括C1‑C10直链和分支的烷基。在某些实施方案中，所述烷基还经一个或多个取代基取代，所述取代基包括例如，芳基(例如‑CH2C6H5，苄基)。在一个实施方案中，R2和R3，以及R6，R7和R8为甲基。在一个实施方案中，R1‑R8为甲基。代表性的芳基包括C6‑C12芳基，这包括例如苯基。对于上面的式的某些实施方案，R2和R3，和/或R6，R7以及R8连同N+一起形成阳离子中心。
L1是将阳离子中心与聚合物主链共价偶联的连接子。在某些实施方案中，L1包括使L1的剩余部分与聚合物主链(或单体的可聚合部分)偶联的官能团(例如酯或酰胺)。除了所述官能团之外，L1可包括C1‑C20烯烃链。代表性的L1基团包括‑C(=O)O‑(CH2)n‑和‑C(=O)NH‑(CH2)n‑，其中n是1‑20(例如，n=2)。
L2是将阳离子中心与阴离子基团共价偶联的连接子。L2可以是C1‑C20烯烃链。代表性的L2基团包括‑(CH2)n‑，其中n是1‑20(例如1，3或5)。
L3是将阳离子中心与聚合物主链共价偶联的连接子。在某些实施方案中，L3包括使L3的剩余部分与聚合物主链(或单体的可聚合部分)偶联的官能团(例如酯或酰胺)。除了所述官能团之外，L3可包括C1‑C20烯烃链。代表性的L3基团包括‑C(=O)O‑(CH2)n‑和‑C(=O)NH‑(CH2)n‑，其中n是1‑20(例如，n=2)。
L4是将聚合物主链与阴离子基团共价偶联的连接子。L4可以是C1‑C20烯烃链。代表性的L4基团包括‑(CH2)n‑，其中n是1‑20(例如1，3或5)。
代表性的烷基包括C1‑C30直链和分支烷基。在某些实施方案中，所述烷基进一步经一个或多个取代基取代，所述取代基包括例如芳基(例如，‑CH2C6H5，苄基)。
代表性的芳基包括C6‑C12芳基，这包括例如苯基，包括经取代的苯基(例如苯甲酸)。
X‑是与阳离子中心相缔合的反离子。所述反离子可以是源自阳离子聚合物或单体的合成的反离子(例如Cl‑，Br‑，I‑)。起初由阳离子中心的合成产生的所述反离子也可与其它合适的反离子交换。代表性的疏水性反离子包括羧酸根，例如苯甲酸和脂肪酸阴离子(例如CH3(CH2)nCO2‑，其中n=1‑19);烷基磺酸根(例如CH3(CH2)nSO3‑，其中n=1‑19);水杨酸根;乳酸根;二(三氟甲基磺酰基)酰胺阴离子(N‑(SO2CF3)2);以及它们的衍生物。其它的反离子也可选自氯离子，溴离子，碘离子，硫酸;硝酸;高氯酸(ClO4);四氟硼酸(BF4);六氟磷酸(PF6);三氟甲基磺酸(SO3CF3);以及它们的衍生物。其它合适的反离子包括水杨酸(2‑羟基苯甲酸)，苯酸和乳酸。
与生物分子相缀合的两性离子聚合物的大小(例如n或Mn)可根据生物分子的性质而变化。
对于可用于本发明的聚合物，聚合度(DP或n)，数平均分子量(Mn)，以及重量平均与数平均分子量之比(Mw/Mn)（也已知为多分散指数），可以变化。在一个实施方案中，聚合物具有的聚合度(n)为1至约10,000。在一个实施方案中，n为约10至约5,000。在另一个实施方案中，n为约100至约3,500。在一个实施方案中，聚合物具有的数平均分子量(Mn)为约200至约2,000,000Da。在一个实施方案中，Mn为约2,000至约100,000Da。在另一个实施方案中，Mn为约20,000至约80,000Da。在一个实施方案中，聚合物具有的重量平均与数平均分子量之比(Mw/Mn.)为约1.0至约2.0。在一个实施方案中，Mw/Mn为约1.1至约1.5。在另一个实施方案中，Mw/Mn为约1.2至约2.0。
生物分子
如上文所示，两性离子聚合物生物缀合物包含与生物分子共价偶联的一种或多种两性离子聚合物。合适的生物分子包括生物聚合物(例如蛋白、肽、寡核苷酸、多糖)，脂质和小分子。
可根据本发明使用的示例性生物分子包括蛋白(包括多体蛋白，蛋白复合体，肽)，核酸，脂质，碳水化合物和小分子。
蛋白试剂.在一些实施方案中，所述生物分子是蛋白或肽。术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可以可互换地使用。在某些实施方案中，肽的大小的范围为5至约5000，5至约1000，约5至约750，约5至约500，约5至约250，约5至约100，约5至约75，约5至约50，约5至约40，约5至约30，约5至约25，约5至约20，约5至约15，或约5至约10个氨基酸。
多肽可含有L‑氨基酸，D‑氨基酸，或二者并且可含有本领域中已知的任何种类的氨基酸修饰或类似物。有用的修饰包括，例如末端乙酰化，酰胺化。在一些实施方案中，多肽可包含天然的氨基酸，非天然的氨基酸，合成的氨基酸，以及它们的组合，如本文中所描述的。
在一些实施方案中，治疗剂可以是激素，促红细胞生成素，胰岛素，细胞因子，用于疫苗接种的抗原，生长因子。在一些实施方案中，治疗剂可以是抗体和/或其特征性部分。在一些实施方案中，抗体可包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合(即“人源化的”)，或单链(重组)抗体。在一些实施方案中，抗体可具有降低的效应子功能和/或双特异性分子。在一些实施方案中，抗体可包括Fab片段和/或由Fab表达文库产生的片段(例如Fab，Fab′，F(ab′)2，s cFv，Fv，dsFv双体抗体，和Fd片段)。
核酸试剂.在本发明的某些实施方案中，所述生物分子为核酸(例如DNA，RNA，其衍生物)。在一些实施方案中，所述核酸试剂是功能性RNA。一般地，“功能性RNA”是不编码蛋白而属于其成员典型地在细胞内具有一种或多种不同的功能或活性的RNA分子类别的RNA。将领会，具有不同序列的功能性RNA分子的相对活性可以不同并且可至少部分地依赖于RNA存在于其中的特定细胞类型。因此，本文中使用的术语“功能性RNA”是指一类RNA分子并且不意在暗示此类的所有成员都将在任何特定的条件下实际上展现出所述类别的特征性活性。在一些实施方案中，功能性RNA包括诱导RNAi的实体(例如短的干扰性RNA(siRNAs)，短的发夹RNA(shRNAs)和微小RNA)，核糖酶，tRNA，rRNA，可用于三螺旋形成的RNA。
在一些实施方案中，所述核酸试剂是载体。如本文中所使用的，术语“载体”是指核酸分子(通常但不必须是DNA分子)，其可转移与其相连的另一个核酸。载体可实现宿主细胞中的额外染色体复制和/或与其相连的核酸的表达。在一些实施方案中，载体可实现整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施方案中，载体用于指导蛋白和/或RNA表达。在一些实施方案中，待表达的蛋白和/或RNA是所述细胞通常不表达的。在一些实施方案中，待表达的蛋白和/或RNA是所述细胞通常所表达的，但是与未将所述载体递送至所述细胞时所表达的相比，表达水平更低。在一些实施方案中，载体指导本文所述的任何功能性RNA（例如诱导RNAi的实体，核糖酶）的表达。
碳水化合物试剂.在一些实施方案中，所述生物分子是碳水化合物。在某些实施方案中，所述碳水化合物是与蛋白相缔合的碳水化合物(例如糖蛋白，蛋白聚糖)。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物也可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物可以是简单或复杂的糖。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖，这包括但不限于葡萄糖，果糖，半乳糖和核糖。在某些实施方案中，碳水化合物为二糖，这包括但不限于乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，这包括但不限于纤维素，微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，甲基纤维素(MC)，右旋糖，右旋糖酐，糖原，黄原胶，结冷胶，淀粉和支链淀粉。在某些实施方案中，碳水化合物是糖醇，这包括但不限于甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
脂试剂.在一些实施方案中，生物分子是脂。在某些实施方案中，所述脂是与蛋白相缔合的脂(例如脂蛋白)。可根据本发明使用的示例性的脂包括但不限于油脂、脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、必需脂肪酸、顺式脂肪酸、反式脂肪酸、甘油酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、激素、类固醇(例如胆固醇，胆酸)，维生素(例如维生素E)，磷脂，鞘脂和脂蛋白。
在一些实施方案中，所述脂可包含一种或多种脂肪酸基团或其盐。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可包含可消化的、长链(例如C8‑C50)、经取代或未取代的烃。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可以是下列的一种或多种：丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山萮酸或二十四烷酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可以是下列的一种或多种：棕榈油酸，油酸，十八碳烯酸，亚麻油酸，α‑亚麻油酸，γ‑亚麻油酸，花生四烯酸，鳕烯酸，花生四烯酸，十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸或芥酸。
小分子试剂.在一些实施方案中，所述治疗剂为具有药物活性的小分子和/或有机化合物。在一些实施方案中，所述治疗剂为临床上使用的药物。在一些实施方案中，所述药物为抗癌试剂，抗生素，抗病毒试剂，抗HIV试剂，抗寄生虫试剂，抗原生动物试剂，麻醉剂，抗凝剂，酶的抑制剂，甾体试剂，甾体或非甾体的抗炎剂，抗组胺试剂，免疫抑制剂，抗肿瘤试剂，抗原，疫苗，抗体，解充血剂，镇静剂，阿片样试剂，止痛剂，解热剂，生育控制试剂，激素，前列腺素，促孕剂，抗青光眼试剂，眼科试剂，抗胆碱能试剂，止痛剂，抗抑郁剂，抗精神病试剂，神经毒素，安眠药，安定剂，抗惊厥剂，肌肉舒缓剂，抗帕金森试剂，抗痉挛剂，肌肉收缩剂，通道阻断剂，缩瞳剂，抗分泌试剂，抗血栓形成剂，抗凝剂，抗胆碱能试剂，β‑肾上腺素能阻断剂，利尿剂，心血管活性试剂，血管活性试剂，血管舒张剂，抗高血压剂，血管生成试剂，细胞外基质相互作用调节剂(例如细胞生长抑制剂和抗粘附分子)，DNA、RNA或蛋白合成的抑制剂。
在某些实施方案中，小分子试剂可以是任何药物。在一些实施方案中，所述药物是已被适当的政府机构或管理部门认为在人或动物中使用是安全和有效的药物。例如，FDA在21C.F.R.§§330.5，331至361，以及440至460中列出的批准用于人类应用的药物，其在此通过引用而并入;FDA在21C.F.R.§§500至589中列出的用于兽用的药物，其在此通过引用而并入。所有列出的药物都被认为对于根据本发明使用是可接受的。
适用于本发明的类别和具体药物的更完整的列表可在下列中找到：Pharmaceutical Drugs:Syntheses，Patents，Applications by Axel Kleemann and Jurgen Engel，Thieme Medical Publishing，1999和Merck Index:An Encyclopedia of Chemicals，Drugs and Biologicals，Ed.by Budavari et al，CRC Press，1996，二者均在此通过引用而并入。
可有利地与一种或多种两性离子聚合物相缀合的生物分子包括被批准使用的生物制药。经聚乙二醇化的生物分子和生物制药示例了适于与一种或多种两性离子聚合物相缀合以提供本发明的两性离子聚合物生物缀合物的一类生物制药。
缀合方法
可通过将有适当反应活性的聚合物(例如活性酯)与天然生物分子或经修饰以包括有适当反应活性的基团的生物分子(例如蛋白的天然赖氨酸残基的氨基或被掺入蛋白或寡核苷酸中的氨基)共价偶联而使两性离子聚合物与生物分子相缀合。在图1中图示地阐明了通过将两性离子聚合物的反应活性酯(NHS)与通用的蛋白相缀合(例如通过可获得的赖氨酸基团)而制备代表性的两性离子蛋白缀合物。实施例1中描述了代表性两性离子聚合物(聚羧基甜菜碱的末端NHS酯)与代表性生物分子(酶CT)的偶联。
备选地，可如下制备两性离子聚合物生物缀合物：通过将一种或多种聚合引发剂与生物分子共价偶联，随后使用合适的两性离子单体进行聚合以从生物分子接枝所述聚合物(即原位聚合)。在这种方法中，以与上文中对于聚合物与生物分子直接缀合所描述的方式相同的方式而使所述一种或多种聚合引发剂与生物分子相偶联。所述原位聚合方法可仅被用于对于聚合所需的反应条件是稳定的生物分子。
药物组合物
另一方面，本发明提供了组合物，其包括本发明的两性离子聚合物生物缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂。合适的载体和稀释剂包括本领域中已知的那些，例如盐水和右旋糖。
用于施用/治疗的方法
在本发明的另一方面，提供了用于施用和治疗的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了用于施用两性离子聚合物生物缀合物的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的两性离子聚合物生物缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗可通过施用生物分子而治疗的疾病或病况的方法。在这种方法中，向有需要的受试者施用生物分子的两性离子聚合物缀合物。
下面描述了本发明的代表性两性离子聚合物生物缀合物的制备和特性。在下面的描述中，通过酶α‑糜蛋白酶(CT)示例了所述生物分子。将生物缀合物的某些特性与相应的聚乙二醇化的缀合物进行了比较。
稳定性.进行了热稳定性测试，其中测量了温度对于酶活性的影响。N‑琥珀酰‑Ala‑Ala‑Pro‑Phe对硝基苯胺是625Da的基于肽的底物，使用它来测量活性。从图3A中的数据可见，pCB和PEG在升高的温度下都具有稳定化的效果。虽然PEG是已知的稳定化试剂，见到pCB Mn Eq.缀合物提供甚至进一步的改善。在图3B中可见，当与之前的两种缀合物相比较时，使用pCB Rh Eq时测量到了显著的热稳定性。
变性剂尿素被推理与蛋白的主链相互作用并已知引起解折叠和功能丧失。为了对所制备的缀合物的稳定性充分施加压力，使用接近饱和的尿素溶液来原位测量酶活性。结果可见于图4中。选择了时间点2，8和32小时。在早的时间点没有见到显著的差别。在8和32小时时，在CT对照和较低缀合的PEG样品中见到了更大的不稳定性。甚至在较低的聚合度时，与对照相比，所有的pCB缀合物都显示出了增加的稳定性。仅仅是高度缀合的PEG样品(HD)具有与所有其它pCB缀合物相当的活性。这显示出CT‑pCB缀合物具有非常独特的、在化学上稳定蛋白质的能力，甚至当含有非常少的所连接的聚合物时亦是如此。
图5显示了在一周的时间段中CT缀合物的血清稳定性。在第7天时可以看出，与所有的PEG缀合物（包括未缀合的对照）相比，所有的pCB缀合物都具有更高的保留的活性。
动力学和亲合力.对于动力学分析，将CT‑PEG缀合物与等同分子量(pCB Mn Eq)和等同流体动力学大小(pCB Rh Eq)的CT‑pCB缀合物进行比较。使用两种底物来评估下列聚合物的动力学效果:N‑琥珀酰‑Ala‑Ala‑Pro‑Phe对硝基苯胺（625Da的基于肽的底物）和试卤灵溴乙酸盐（较小的(335Da)非基于肽的底物）。包括了试卤灵溴乙酸盐作为阴性对照，已知小的、更为疏水的底物与酶的复合被缀合的聚合物抑制得少的多。
图6显示了所测试的所有缀合物的kcat值。kcat是底物转化为产物的最大速度。这不依赖于底物接触活性位点的能力，这种能力由结合后产生的Km.kcat表示。这在底物浓度非常高时可被观察到。kcat的增加代表酶‑底物复合物内在的不同。从图6中可见，所有的PEG和pCB Mn Eq缀合物在kcat方面均没显示出显著的改变。对于这些缀合物，聚合物被动地起作用。然而，对于pCB Rh Eq样品，似乎有kcat的增加。这是聚合物直接作用在酶‑底物复合物上的证据。对于肽底物，kcat的增加是更明显的并且与缀合程度更加相关。假设这是由于底物酰胺化学作用，并且显示出聚合物对于酶和肽底物的作用是加成性的。
图7显示了所有聚合物蛋白缀合物的米歇利斯常数(Km)的值。Km是达到50%最大活性(kcat)时的底物浓度并且近似于底物对于酶的亲合力。如用基于肽的底物时所预期的，随着逐渐增加的聚合物的掺入，PEG具有逐渐增加的不良影响，由Km的增加所显示。然而，见到了两种CT‑pCB缀合物都不具有任何抑制性效果。事实上，见到随着更多的聚合物被掺入到蛋白上，pCB Rh Eq缀合物的Km减少。Km被缀合的聚合物的大小和化学作用很大地影响。如在阴性对照中所见到的，使用进行比较的小分子底物时有很小的趋势。已知更为疏水的小分子底物在酶‑聚合物缀合物的聚合物壳的内外非常容易地扩散。
图8显示了所有聚合物蛋白缀合物的催化效率(kcat/Km)。这是用于定义总的系统催化底物的效率的通用术语。这些考虑到了酶与底物复合并将其有效地转化为产物的能力。由于上述原因的组合，Km的增加对于PEG缀合物产生了低的催化效率。相反，对于pCB Rh Eq，Km的减少和kcat的增加引起了催化效率的大的增加。要注意，见到高度缀合的PEG缀合物在催化效率方面具有47.6%的减少，而见到高度缀合的pCB Rh Eq缀合物在活性方面具有220.4%的增加。
提供下面的实施例是为了阐释而非限制本发明的目的。
实施例
实施例1
代表性两性离子聚合物蛋白缀合物的制备和表征
在此实施例中，描述了本发明的代表性两性离子聚合物蛋白缀合物pCB‑CT的制备和表征。
NHS封端的羧基甜菜碱聚合物的合成.在具有磁性搅拌器的圆底烧瓶中，将N‑羟基琥珀酰亚胺(2.26g，19.6mmol)和2‑溴丙酸(1.45ml，16.4mmol)溶解在500ml的无水二氯甲烷中。使烧瓶冷却至0℃并逐滴地加入DCM中的N,N'‑二环己基碳二亚胺(3.35g，16.34mmol)溶液(25ml)。在室温下过夜搅拌之后，将反应混合物进行过滤并在减小的压力下去除溶剂以给出黄色固体。通过快速色谱来进一步纯化产物。获得了2.4g的白色固体(9.63mmol，产率=59%)。1H NMR(CDCl3)(ppm):1.97(d，3H，CH(CH3)Br)，2.88(s，4H)，4.62(q，1H，CH(CH3)Br)。
使用Cu(1)Br/HMTETA催化剂在无水二甲基甲酰胺(DMF)中进行了原子转移自由基聚合(图1A)。在典型的聚合中，通过用氮气进行起泡而分别对DMF和液体HMTETA配体进行氧清除。向Schlenk管中加入1g(3.67mmol)的CBMA‑1‑tBut单体和125mg(0.5mmol)的NHS‑引发剂。向第二个Schlenk管中加入71.7mg(0.5mmol)的Cu(1)Br。通过在氮和真空之间进行三次循环而对两个管都进行脱氧。将8mL和2mL的脱氧DMF分别加入单体/引发剂和Cu(1)Br管中。将136μL(0.5mmol)的脱氧HMTETA加入含有Cu(1)Br的溶液中并在氮的保护下搅拌30min。然后将催化剂溶液(Cu(1)/HMTETA)全部加入单体/引发剂溶液中以使反应开始。在室温下使反应进行至完全，伴随通过NMR进行监测。聚合物合成是独特的，因为使用了经保护的两性离子单体用于在有机溶剂中进行受控的聚合。这在处理以反应活性酯封端的聚合物中是重要的，因为在更为水性的溶剂(例如水和甲醇)中可发生酯的钝化。为了去除三氟乙酸(TFA)中的保护性单体基团的后聚合物修饰也不水解活性酯。其它的两性离子在有机溶剂中不能够保持是可溶性的。这种保护方法为这一问题提供了解决方案。
聚合之后，使反应在乙醚中完全沉淀。然后，在真空下使沉淀物干燥并重新溶解于最少量的DMF(3‑5mL)中。将此溶液涡旋振荡直至完全溶解并在丙酮中沉淀以去除可溶的催化剂和痕量单体。将此总共重复三次以完全去除催化剂。在真空下使剩余的酯聚合物干燥过夜并通过NMR进行分析。
为了水解叔丁基，将500mg NHS‑pCBMA‑1‑tBut溶解在5mL三氟乙酸中(图1B)。允许其静置2小时。然后使溶液在乙醚中沉淀，在真空下过夜干燥并随后通过NMR和GPC进行分析。
对羧基甜菜碱‑蛋白缀合物的制备和分析.对于这些实验而言，选择了5kDa的分子量用于比较PEG和pCB的效果。由于pCB和PEG之间不同的溶液构象，当与NMR确定的分子量进行比较时，通过GPC确定的分子量变化很大。已知PEG在溶液中采取膨胀得多的构象而pCB是更为凝聚的。这从表1和2中的“PEG”和“pCB Mn Eq”GPC分子量之间可以看出。pCB Mn Eq是PEG的分子量等同物并被用于热、尿素和血清稳定性测试中。然而，也制备了具有通过GPC测定的等同大小的、含有更大的pCB聚合物的pCB缀合物("pCB Rh Eq")用于动力学分析。在稳定性研究中仅使用了pCB Mn Eq以证明当与5kDa PEG进行比较时，所制备的两种pCB聚合物中较小的那种仍具有更有利的效果。
表1.通过TNBS测定测量的缀合的聚合物的数目/酶。其它的pCB聚合物被制备为PEG的流体动力学大小等同物(pCB Rh Eq)。

表2.通过GPC和NMR测定的分子量(*Mn作为所接收的)。其它的pCB聚合物被制备为PEG的流体动力学大小等同物(pCB Rh Eq)。

使经NHS活化的pCB和PEG聚合物与CT的表面暴露的赖氨酸ε‑氨基相缀合。以5mg/mL在200mM HEPES缓冲液（pH 8.0）中制备CT(图1C)。将干燥的聚合物直接加入酶溶液中。调节聚合物与蛋白的给料比来控制缀合的程度(聚合物数目/CT蛋白)。在冰上将反应溶液搅拌2h，然后将其在冰箱中放置过夜。利用超滤(30,000Da MWCO)，通过用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）进行数次缓冲液交换而从未反应的聚合物中纯化缀合物。在最后的过滤后，以40%加入甘油并储存在‑20℃。通过TNBS测定确定了修饰的程度(聚合物数目/CT蛋白)。表1中显示了聚合物的数目/蛋白。在GPC色谱中也证实了缀合(图2)。
在图2中可见到PEG和pCB Mn Eq.缀合物的实例。
虽然对于此系统使用了膜纯化，也述及了其它方法。用于蛋白纯化的典型方法包括标签亲和，离子交换和尺寸排阻色谱。pCb缀合物的离子交换呈现出独特的挑战。由于聚合物的离子性质，缀合物与非缀合物之间的分辨率非常差。PEG是不带电的聚合物并且被显示出具有非常高的分辨率。对于所使用的模式系统而言，蛋白质标签是不适当的因此没有对其进行测试。pCB和Peg缀合物的尺寸排阻都良好地起作用并且应当被用于所有的pCB纯化需求。
用于纯化的独特方法是选择性硫酸铵蛋白质沉淀。由于pCB聚合物的独特的亲液特征，通过硫酸铵蛋白质沉淀进行分离对于此系统良好地起作用。PEG被提出具有相反的效果并且不同样容易地通过此技术被沉淀而需要其它纯化方法。
虽然阐释和描述了阐释性的实施方案，将领会可在其中进行各种改变而不偏离本发明的精神和范围。