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1、(10)申请公布号 CN 102895221 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102895221 A *CN102895221A* (21)申请号 201210371706.X (22)申请日 2012.09.29 A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 黄慧琳 翁桁游 周惠 屈良鹄 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (54) 发明名称 一种靶向降。
2、解 Bcr-Abl 蛋白的试剂及其在制 备费城染色体阳性肿瘤治疗药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了冬凌草甲素通过降解 Bcr-Abl 融合蛋白可用于治疗费城染色体阳性肿瘤， 涉及 冬凌草甲素在制备费城染色体阳性肿瘤治疗药物 中的应用。经过大量研究发现， 冬凌草甲素能够 激活 Bcr-Abl 特异的泛素化降解途径， 迅速和高 效地降解 Bcr-Abl 癌蛋白， 从而使费城染色体阳 性的肿瘤细胞发生显著的生长抑制和不可逆转的 细胞凋亡。在小鼠体内， 冬凌草甲素同样能够降 解 Bcr-Abl 蛋白， 显著抑制费城染色体阳性肿瘤 的生长。冬凌草甲素主要来源于我国传统中药冬 凌草， 对人体毒性较。
3、低， 且易于制备、 可应用性强。 另外， 本发明所揭示的冬凌草甲素作用机制与目 前用于白血病临床治疗的一线药物 STI-571 （格列 卫） 完全不同， 因此可作为一种治疗 STI-571 耐受 的费城染色体阳性肿瘤的潜在药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种靶向降解 Bcr-Abl 蛋白的试剂， 其特征在于其主要成分为冬凌草甲素， 或以冬 凌草甲素为先导化合物的具有环外亚甲基环戊酮结构的四环二萜类化合物。 2. 如。
4、权利要求 1 所述的试剂， 其特征在于冬凌草甲素的浓度为 2.5-20 M。 3. 如权利要求 1 所述的试剂在哺乳动物肿瘤细胞的实验研究中作为诱导剂降解 Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白的应用。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于所述的哺乳动物为人类、 小鼠或大鼠。 5. 冬凌草甲素或以冬凌草甲素为先导化合物的具有环外亚甲基环戊酮结构的四环二 萜类化合物在制备费城染色体阳性肿瘤治疗药物。 6. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征在于所述的费城染色体 （Ph） 阳性肿瘤包括 Ph 阳 性的慢性髓性白血病、 Ph阳性的急性髓性白血病、 Ph阳性的急性淋巴性白血病和Ph阳性的 前。
5、 B 细胞、 T 细胞淋巴瘤。 7.如权利要求5所述的应用， 其特征在于使用2.5-20 M及以上浓度的冬凌草甲素处 理费城染色体阳性的K562细胞和KU812细胞， 2-24小时后可引起Bcr-Abl蛋白的泛素化降 解， 使细胞生长受到抑制并且诱导细胞凋亡。 8. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征在于以 15mg/kg 冬凌草甲素的剂量连续注射携带 费城染色体阳性肿瘤的小鼠， 12 天后可引起肿瘤组织中 Bcr-Abl 蛋白的降解， 抑制肿瘤的 生长。 9. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征在于冬凌草甲素可专一性地降解费城染色体阳性 肿瘤的病源蛋白 Bcr-Abl， 以及其同一蛋白家。
6、族的成员 c-Abl 蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102895221 A 2 1/5 页 3 一种靶向降解 Bcr-Abl 蛋白的试剂及其在制备费城染色体 阳性肿瘤治疗药物中的应用 技术领域 0001 本发明公开一种靶向降解 Bcr-Abl 蛋白的方法和试剂及其在制备 Ph 阳性肿瘤治 疗药物中的应用， 属于医药和生化与细胞生物学技术领域， 具体涉及冬凌草甲素在制药和 临床治疗中靶向泛素化降解病原蛋白Bcr-Abl并抑制和杀伤Ph阳性肿瘤细胞， 以及在临床 和基础研究中作为一种诱导剂来分析 Bcr-Abl 及其相关信号通路的生物学功能。 背景技术 0002 肿瘤是威胁人类健康的头号杀手。。
7、2008 年全球新增肿瘤患者 1270 万， 死亡 760 万， 并且这些数字仍在持续增长中。 随着现代医学的发展， 人们逐渐认识到肿瘤的形成是由 于基因突变造成的， 由此开发出多种以基因为靶点的分子靶向疗法， 并在肿瘤治疗中取得 了显著成效。 0003 染色体畸变是导致肿瘤细胞中基因突变的常见原因。1960 年， 两位美国科学 家 Peter Nowell 和 Dacid Hungerford 在慢性髓性白血病 （CML） 病人的血液样品中发现 了一个异常的染色体， 由于是在美国费城 （Philadelphia） 发现的， 故命名为费城染色体 （Ph） 。后来经染色体显带发现费城染色体是由 。
8、9 号染色体长臂 (9q34) 和 22 号染色体长臂 (22q11)易位造成的， 又被称为t(9; 22)(q34; q11)。 费城染色体具有重要的临床意义 ： 大 约 95% 的慢性髓性白血病病例都是 Ph 阳性， 因此可作为诊断的依据。另外， 在急性髓性白 血病、 前 B 细胞和 T 细胞白血病 / 淋巴瘤中大约 20%-30% 的成人与 2-10% 的未成年患者中 也能检测到费城染色体。 0004 t (9; 22) (q34; q11) 染色体易位产生一种致癌性的融合基因 Bcr-Abl， 该基因 编码的融合蛋白产物具有异常增高的酪氨酸激酶活性， 是导致慢性髓性白血病及其他 Ph 。
9、阳性肿瘤发生的首要原因。研究表明， Bcr-Abl 融合蛋白还是造成 Ph 阳性肿瘤细胞对多种 化疗药物不敏感的原因。在 K562 细胞及其它 Ph 阳性的肿瘤细胞中抑制 Bcr-Abl 蛋白， 可 以显著抑制和杀伤肿瘤细胞， 还可以逆转这些肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。 0005 STI-571（格列卫） 是靶向 Bcr-Abl 的酪氨酸激酶竞争性抑制剂， 目前已经成为治 疗慢性髓样白血病 (CML) 病人的一线用药， 对于慢性期 （CP） 的 CML 病人具有良好的治疗效 果。但是， 对于加速期 （AP） 和急变期 （BC） 的病人， STI-571 的治愈率很低， 而且病人容易复 发并最终。
10、演变成STI-571耐受的CML-BC。 因此急需开发一些作用机制与STI-571不同的的 抗肿瘤药物用于 CML 的治疗。 0006 除了使用小分子抑制剂干扰癌蛋白的酶活性外， 靶向癌蛋白的泛素化降解也是一 种很好的分子靶向治疗策略。泛素化降解是细胞中重要的蛋白质质控系统， 可以选择性降 解细胞中不需要的蛋白质， 例如一些短寿命的细胞周期调节蛋白、 癌基因和抑癌基因产物 以及变性变构蛋白等。 在肿瘤细胞中， 促进癌蛋白的降解对于逆转肿瘤恶性程度、 改善治疗 效果具有重要的意义。 0007 冬凌草甲素是我国传统抗癌中药冬凌草中最主要的抗肿瘤活性成分， 经鉴定属于 说 明 书 CN 102895。
11、221 A 3 2/5 页 4 贝壳杉烯类四环二萜类化合物。中国专利 （申请号 200410016891.6， 公开日 2005 年 9 月 14 日） 公开了冬凌草甲素在降解 AML1-ETO 融合蛋白中的应用， 为开发具有 t(8;21) 染色体 易位的白血病靶向治疗药物奠定了基础。另一中国专利 （申请号 201110413556.X， 公开日 2012 年 7 月 4 日） 公开了冬凌草甲素在制备 FBW7 抑癌蛋白激活剂中的应用， 报道了冬凌草 甲素通过激活 FBW7 介导的泛素化降解途径靶向降解癌蛋白 c-Myc、 cyclinE 和 mTOR 的作 用。关于冬凌草甲素在降解 Bcr。
12、-Abl 蛋白以及制备费城染色体阳性肿瘤治疗药物的应用还 未见报道。 0008 冬凌草甲素的化学结构式 发明内容 0009 本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足， 提供一种靶向泛素化降解癌蛋白 Bcr-Abl 的方法和试剂， 以及该方法在制备 Ph 阳性肿瘤治疗药物中的应用。 0010 本发明的另一目的在于提出一种诱导剂， 在临床和基础研究中用于降解 Bcr-Abl 蛋白， 从而应用于其生物学功能及相关信号通路的研究。 0011 申请人经大量研究发现冬凌草甲素在体内和体外均能够激活 Bcr-Abl 特异的泛 素化降解途径， 迅速和高效地降解 Bcr-Abl 癌蛋白， 从而使 Ph 阳性的肿。
13、瘤细胞发生显著的 生长抑制和不可逆转的细胞凋亡。 0012 对本发明的研究结果进一步阐述如下 ： 对Ph阳性肿瘤细胞K562， 采用20M冬凌草甲素处理24小时。 免疫印迹检测Bcr-Abl 蛋白的表达， 发现冬凌草甲素能够降低 Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白的水平， 而对 Bcr 蛋白没有影 响， 表明冬凌草甲素能够在 Ph 阳性细胞系中选择性作用 Bcr-Abl 蛋白家族中的癌蛋白成 员。与 Ph 阴性肿瘤细胞 HL-60 相比， 冬凌草甲素在 Ph 阳性肿瘤细胞 K562 和 KU812 中均能 显著降低 Bcr-Abl 蛋白的水平。 0013 采用0-20 M冬凌草甲素处理K56。
14、2细胞24小时， Bcr-Abl和c-Abl蛋白的降低具 有显著的剂量依赖模式。在较低浓度 （2.5-7.5 M） 冬凌草甲素诱导下， Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白水平即发生显著降低 ； 而 10 M 以上浓度冬凌草甲素诱导下， Bcr-Abl 蛋白几乎完全 降解。表明采用冬凌草甲素诱导降解 Bcr-Abl 只需较低的剂量即可达到显著的效果。 0014 冬凌草甲素对Bcr-Abl蛋白的降解非常迅速， 20 M冬凌草甲素处理2h即可完全 降解 Bcr-Abl。该作用持续时效较长且不易逆转， 处理 24 小时后撤销冬凌草甲素， 48 小时 内未见 Bcr-Abl 的表达回复。 0015 采。
15、用qRT-PCR检测发现冬凌草甲素并不影响Bcr-Abl和c-Abl的mRNA水平。 采用 蛋白酶体抑制剂 MG-132、 ALLN 和 Lactacystin 预处理细胞 2 小时， 然后加入 20 M 冬凌草 说 明 书 CN 102895221 A 4 3/5 页 5 甲素， 可完全抑制冬凌草甲素对Bcr-Abl和c-Abl蛋白的降解。 表明冬凌草甲素对Bcr-Abl 和 c-Abl 的特异性降解是通过泛素化蛋白酶体途径实现的。由于泛素化蛋白酶体降解途径 的高度选择性， 这从另一个方面证明了冬凌草甲素对 Bcr-Abl 蛋白降解的专一性。 0016 采用 0-20 M 冬凌草甲素处理 K。
16、562 细胞和 KU812 细胞， 均可引发不同程度的细 胞生长抑制和凋亡， 且与 Bcr-Abl 的降解呈正相关。10 M 以上浓度冬凌草甲素能够诱导 显著的细胞凋亡。20 M 冬凌草甲素处理 24 小时， K562 细胞和 KU812 细胞的凋亡率均大 于 50%， 且细胞生长受到显著抑制， 抑制率分别为 68% 和 79%。冬凌草甲素处理 K562 细胞 24 小时后撤销药物诱导， 发现在 20 M 浓度处理组中细胞凋亡不可逆转， 细胞凋亡率在药物 撤销后48小时内仍逐渐增高。 表明冬凌草甲素可通过降解Bcr-Abl融合蛋白， 从而抑制Ph 阳性肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡。 0017 。
17、在 NOD-SCID 小鼠后肢背部接种 Ph 阳性肿瘤细胞， 待小鼠成瘤后采用冬凌草甲素 （15 mg/kg） 进行腹腔注射， 连续注射 12 天。与对照组相比， 冬凌甲素对小鼠体内肿瘤组织 的生长具有显著的抑制作用， 且能显著降低肿瘤组织内的 Bcr-Abl 和 c-abl 蛋白的表达水 平。 0018 本发明具有以下有益效果 ： 本发明提出了一种靶向降解 Bcr-Abl 融合蛋白的方法。使用冬凌草甲素处理 Ph 阳性 细胞系和Ph阳性移植瘤小鼠， 均能够选择性作用于Bcr-Abl蛋白家族成员中具有癌蛋白性 质的成员 （Bcr-Abl 融合蛋白和 c-Abl 蛋白） ， 从而抑制肿瘤细胞的生。
18、长并诱导凋亡。该方 法利用了细胞内源的泛素化降解途径， 具有反应灵敏迅速、 作用时效长、 不易逆转、 应用方 便等优点， 而且特异性较高， 对未发生基因重排的Bcr基因基本没有影响。 这为靶向治疗Ph 阳性肿瘤提供了新思路， 并为在临床和基础研究中分析 Bcr-Abl 生物学功能及其相关信号 通路提供了新途径。 0019 本发明提供了一种靶向降解Bcr-Abl和治疗Ph阳性肿瘤的试剂， 该试剂主要来源 于中国传统草药冬凌草， 是一种易于制备的天然药物， 其应用剂量较低， 对人体毒副作用性 较小， 可应用性强。另外， 冬凌草甲素对 Bcr-Abl 的作用机制与 STI-571 不同， 因此可能对。
19、 STI-571 耐受的费城染色体阳性病人也有较好的疗效。 0020 附图说明 0021 图 1 冬凌草甲素在 K562 细胞中降解 Bcr-Abl 的示意图 ； 图 2 冬凌草甲素在 K562 细胞和 KU812 细胞中降解 Bcr-Abl 的示意图 ； 图 3 0-20 M 浓度冬凌草甲素处理 24 小时对 K562 细胞中 Bcr-Abl 的降解示意图 ； 图 4 20 M 冬凌草甲素处理 0-7 小时对 K562 细胞中 Bcr-Abl 的降解示意图 ； 图 5 20 M 冬凌草甲素处理 24 小时能够不可逆转地降解 Bcr-Abl ； 图 6 冬凌草甲素通过泛素化蛋白酶体途径降解 B。
20、cr-Abl ； 图 7 冬凌草甲素抑制 K562 细胞的生长 （A） 并引发不可逆转的细胞凋亡 （B） ； 图 8 冬凌草甲素抑制 KU812 细胞的生长 （A） 并引发细胞凋亡 （B） ； 图 9 冬凌草甲素在 K562 移植瘤小鼠体内对 Bcr-Abl 的降解作用。 说 明 书 CN 102895221 A 5 4/5 页 6 具体实施方式 0022 实施例1 冬凌草甲素在Ph阳性肿瘤细胞中高效、 迅速和不可逆地降解Bcr-Abl蛋 白 我们在 Ph 阳性肿瘤细胞系 K562 中检测冬凌草甲素对 Bcr-Abl 融合蛋白的影响。各细 胞按 3x105个 /mL 的密度接种于细胞培养板上，。
21、 培养 24 小时至对数生长期后分别加入 20 M 冬凌草甲素和药物溶剂 DMSO 处理。诱导 24 小时后收集细胞并用 SDS 法提取细胞总蛋 白， 进行免疫印迹检测。结果显示与对照 DMSO 处理相比， 冬凌草甲素处理使 K562 细胞中的 Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白水平显著降低， 几乎完全降解， 而内对照 GAPDH 蛋白的水平没有明显 变化 （图1） 。 说明冬凌草甲素在K562细胞中能专一性降解Bcr-Abl蛋白家族中的癌蛋白成 员。 0023 另外， 我们以Ph阴性肿瘤细胞系HL60为对照， 在Ph阳性肿瘤细胞系K562和KU812 中检测冬凌草甲素对 Bcr-Abl 融。
22、合蛋白的影响。细胞培养 24 小时后分别加入 20 M 冬凌 草甲素和DMSO， 诱导2小时后收集细胞并用SDS法提取细胞总蛋白， 进行免疫印迹检测。 结 果显示 K562 细胞和 KU812 细胞中 Bcr-Abl 表达水平较高， 采用冬凌草甲素处理使 K562 细 胞和 KU812 细胞中的 Bcr-Abl 蛋白水平显著降低， 而内对照 GAPDH 蛋白的水平没有明显变 化 （图 2） 。而 HL-60 细胞中没有检测到 Bcr-Abl 蛋白的表达。说明冬凌草甲素在 Ph 阳性肿 瘤细胞中能专一性降解 Bcr-Abl 蛋白家族中的癌蛋白成员。 0024 接种 K562 细胞， 培养 24 。
23、小时后加入 0-20 M 梯度浓度的冬凌草甲素处理。诱导 24 小时后收集细胞并用 SDS 法提取细胞总蛋白， 进行免疫印迹检测。Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋 白的降低具有显著的剂量依赖模式 ： 在 2.5-7.5 M 冬凌草甲素诱导下， Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白水平即发生显著降低 ； 而 10 M 以上浓度冬凌草甲素诱导下， Bcr-Abl 蛋白几乎完全 降解 （图 3） 。 0025 接种 K562 细胞， 培养 24 小时后加入 20 M 冬凌草甲素处理。于 0-7 小时收集细 胞并用 SDS 法提取细胞总蛋白， 进行免疫印迹检测。结果显示冬凌草甲素对 Bcr-Abl 。
24、的降 解十分迅速， 诱导 2 小时后即可完全降解 Bcr-Abl 蛋白 （图 4） 。 0026 接种 K562 细胞， 培养 24 小时后加入 0-20 M 的冬凌草甲素处理。诱导 24 小时 后收集细胞用 PBS 洗去培养基中的药物， 并用不含药物的新鲜培养基重新悬浮细胞， 继续 培养 24-48 小时。于相应时间点收集细胞并用 SDS 法提取细胞总蛋白， 进行免疫印迹检测。 20 M冬凌草甲素处理组的细胞在撤销药物24-48小时后仍几乎检测不到Bcr-Abl蛋白的 表达 （图 5） ， 表明该浓度冬凌草甲素处理下 Bcr-Abl 蛋白的降解是不易逆转的。 0027 实施例 2 冬凌草甲素。
25、靶向泛素化降解 Bcr-Abl 蛋白 接种 K562 细胞， 培养 24 小时后分别加入三种蛋白酶体抑制剂 MG-132（M， 10 M） 、 ALLN（A， 100 M） 或 Lactacystin（L， 25 M） 预处理 2 小时， 再加入 20M 冬凌草甲素 诱导。2 小时后收集细胞并用 SDS 法提取细胞总蛋白， 进行免疫印迹检测。MG-132、 ALLN 和 Lactacystin 可完全抑制冬凌草甲素对 Bcr-Abl 和 c-Abl 蛋白的降解 （图 6） ， 说明冬凌草甲 素对 Bcr-Abl 和 c-Abl 的降解依赖于泛素蛋白酶体途径。 0028 接种 K562 细胞和 。
26、KU812 细胞， 培养 24 小时后分别加入蛋白酶体抑制剂 MG-132 预 处理 2 小时， 再加入 20 M 冬凌草甲素诱导。2 小时后收集细胞并用 SDS 法提取细胞总蛋 白， 进行免疫印迹检测。在两种细胞中 MG-132 可完全抑制冬凌草甲素对 Bcr-Abl 蛋白的降 说 明 书 CN 102895221 A 6 5/5 页 7 解 （图 2） ， 说明在费城染色体阳性细胞中， 冬凌草甲素均能靶向泛素化降解 Bcr-Abl 蛋白。 0029 实施例 3 冬凌草甲素抑制 Ph 阳性肿瘤细胞的生长并诱导不可逆转的细胞凋亡 接种 K562 细胞， 培养 24 小时后加入 0-20 M 的。
27、冬凌草甲素处理。诱导 24 小时后采 用 MTT 检测细胞存活率， 同时收集细胞通过 AnnexinV-FITC/PI 染色检测细胞凋亡。在不同 浓度冬凌草甲素处理下， K562 细胞和 KU812 细胞发生不同程度的生长抑制和细胞凋亡， 并 呈现出明显的剂量依赖效应。20 M 冬凌草甲素处理 24 小时， K562 细胞和 KU812 细胞的 生长受到显著抑制 （图7A， 图8A） ， 存活率分别仅为32%和21%， 而且发生显著的细胞凋亡， 凋 亡率均大于 50%（图 7B， 图 8B） 。 0030 接种K562细胞， 培养24小时后加入0-20 M的冬凌草甲素处理。 诱导24小时后 收。
28、集细胞用 PBS 洗去培养基中的药物， 并用不含药物的新鲜培养基重新悬浮细胞， 继续培 养 24-48 小时。于相应时间点收集细胞通过 AnnexinV-FITC/PI 染色检测细胞凋亡。在 20 M 浓度处理组中细胞凋亡不可逆转， 凋亡率在药物撤销后 48 小时内仍逐渐增高 （图 7B） ， 这与 Bcr-Abl 融合蛋白的不可逆降解相一致。 0031 实施例 4 冬凌草甲素在 K562 移植瘤小鼠体内对 Bcr-Abl 的降解作用 小鼠移植瘤模型的建立 ： 收集培养至对数生长期的 K562 细胞， 计数活细胞。在 5-6 周 龄的 NOD-SCID 小鼠的右后肢背部皮下注射 6.67x10。
29、6个 K562 细胞， 并观察小鼠成瘤情况。 0032 冬凌草甲素处理 ： 当瘤块体积达到 200 mm3时， 将小鼠随机分成两组 ： 第一组为对 照组， 应用助溶剂 （2% DMSO） 0.07 mL/10g 腹腔注射 ； 第二组为治疗组， 应用冬凌草甲素 （15 mg/kg 体重） 腹腔注射， 连续注射 12 天。每隔 2 天测量一次瘤块的大小和小鼠的体重， 治疗 组小鼠的肿瘤比对照组生长缓慢 （P0.05） ， 而两组小鼠的体重没有明显差别。开始给药后 的第 13 天， 处死小鼠并解剖瘤块， 可见治疗组小鼠的肿瘤大小比对照组明显减小。 0033 Bcr-Abl 表达检测 ： 将小鼠肿瘤组。
30、织切成约 1 cm3， 取适量于 RIPA 蛋白裂解中匀浆 并充分裂解， 离心取上清， 使用BCA试剂盒进行蛋白定量。 取120 g总蛋白进行免疫印迹， 以GAPDH为内参， 分别检测Bcr-Abl和c-Abl的蛋白水平。 与对照组相比， 治疗组中Bcr-Abl 和 c-Abl 的蛋白水平均发生显著降低 （图 9） 。 说 明 书 CN 102895221 A 7 1/5 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102895221 A 8 2/5 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102895221 A 9 3/5 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102895221 A 10 4/5 页 11 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102895221 A 11 5/5 页 12 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102895221 A 12 。