一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂 技术领域 本发明涉及一种胰岛素脂质复合物及其制备方法, 还涉及包含胰岛素脂质复合物 的油溶液及其在制备缓释注射剂和非注射给药途径制剂中的用途, 又涉及包含胰岛素脂质 复合物的新型囊泡 ( 脂质体 ) 及其在制备非注射给药途径制剂中的用途, 属医药制剂技术 领域。
背景技术 1、 脂质复合物研究进展及背景介绍
1.1 复合物的构造特点及形成机制
磷脂复合物是由意大利学者 Bombardelli 在研究脂质体时发现的, 早期磷脂复合 物研究涉及的药物大多是含有酚羟基的黄酮或多酚类成分, 后期更多的研究证实, 除酚羟 基外, 一些醇羟基、 酰胺基或羰基等极性基团均有可能与磷脂或其他脂质材料 ( 如胆固醇、 胆酸钠等 ) 的亲水端通过分子间氢键或范德华力等相互作用形成复合物球状体。不论是亲 水性药物还是亲脂性药物, 只要含有能复合的极性基团, 都可形成脂质复合物。 脂质复合物 的形成, 可显著提高药物亲脂性和油溶性。
磷脂复合物的组成、 结构与同样由磷脂构成的囊泡 ( 又称脂质体 ) 在构造上明显 不同。 脂质体是磷脂分子的亲水端向外、 疏水端向内形成的双分子膜围成的囊泡结构。 而磷 脂复合物则是活性成分的极性基团与磷脂的亲水端部位通过分子间相互作用而被固定, 将 磷脂的亲水部位包裹, 而疏水端不参与复合反应, 可自由移动, 形成一个亲脂性的球状体。
一个脂质体囊泡可能有成百甚至上千个磷脂分子包围而成, 双分子膜的外层和内 层均为磷脂的亲水端, 而中间夹层则为疏水端。 对于亲脂性药物, 可被包封于双分子膜的夹 层中 ( 图中蓝色方块 ), 包封率通常较高且稳定, 不易泄漏 ; 而亲水性药物只能分散在双分 子膜围成的囊泡内核或外围, 由于药物进入内核比较困难, 实际上亲水性药物大多数分布 在外围, 稳定性较差且易发生泄漏。 在粘膜透过性方面, 亲脂性药物的脂质体往往明显优于 亲水性药物的脂质体。
因此, 对于亲水性药物, 如先制备脂质复合物提高亲脂性, 再制备囊泡, 可提高包 封率和稳定性, 改善粘膜转运特性。
2、 胰岛素脂质复合物研究背景及现有技术的缺陷
2.1 胰岛素脂质复合物研究背景
胰岛素易受胃酸及消化道各种蛋白水解酶的破坏, 且因分子量大难以穿透胃肠粘 膜屏障, 常规口服制剂无效, 皮下注射仍是目前最主要的给药途径, 长期频繁的注射患者顺 应性差。 在过去的几十年中, 国内外医药工作者为克服频繁注射的顺应性问题, 开展了大量 研究, 一方面是通过结构修饰, 制备中效和长效胰岛素, 延长了药效维持时间, 减少注射次 数, 另一方面是通过药剂学技术方法, 制备脂质体、 纳米粒、 微球、 微乳或油溶液, 提高药物 对抗酸碱及生物酶的稳定性、 促进药物经上皮粘膜的转运与吸收, 为口服、 经皮、 粘膜、 肺部 吸入等非注射给药制剂的发展提供释药载体。
由于胰岛素亲脂性差, 限制了微粒载体的制备与发展。胰岛素脂质体是国内外报 道最多的微粒载体, 但由于胰岛素分子量大, 亲水性强, 药物大多存在于磷脂双分子膜的外 围, 包封率低, 易发生泄漏, 对胃肠稳定性及粘膜透过性的改善程度有限 ; 而纳米粒、 微球的 制备大多是在 有机溶剂系统中进行的, 而胰岛素难溶于有机溶剂, 包封率极低, 且仅吸附 于微粒表面, 给药后药物易发生突释, 稳定化效果同样较差 ; 现有文献报道的微乳或自微 乳, 均将胰岛素溶于水相, 无法避免药物与胃酸及生物酶的接触, 不利于提高胃肠环境中的 稳定性。
胰岛素分子中含有大量的酰氨基、 酚羟基、 羟基、 羰基等极性基团, 均有可能与脂 质材料的亲水端发生分子间相互作用形成脂质复合物, 从而改善其亲脂性, 突破微粒载体 制备的限制。近年来, 关于胰岛素脂质复合物的研究成为国内外关注的热点。但胰岛素的 亲脂性较差, 同样限制了脂质复合物的制备, 国内外文献报道和专利普遍存在复合率低、 质 量不稳定的缺陷。
2.2 现有技术的不足与缺陷
胰岛素由 A、 B 两个肽链组成, 分子量接近 6 千, 介于多肽和蛋白质之间。人胰岛素 (Insulin Human)A 链有 11 种 21 个氨基酸, B 链有 15 种 30 个氨基酸, 共 26 种 51 个氨基酸 组成。胰岛素不溶于水及有机溶剂, 但可溶于酸性稀醇、 pH7.4 的磷酸盐缓冲液、 稀酸和稀 碱中。 胰岛素中含有大量的可能与脂质材料亲水端发生分子间相互作用的极性基团, 具 备形成脂质复合物的条件。但胰岛素的蛋白质类结构特征及理化性质特点, 使得脂质复合 物的制备极其困难, 最大的障碍就是复合溶剂的选择。
有机溶剂尤其是非质子传递溶剂有利于复合反应, 但胰岛素在有机溶剂中不溶, 且有机溶剂有可能导致胰岛素降解或构象变化, 因此, 单纯的有机溶剂无法制备胰岛素复 合物, 至今未见文献报道。如果选用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液, 虽然胰岛素具有一定的溶解度 且质量稳定, 但脂质材料不能够溶解成澄清透明的溶液, 再加上水的极性太大, 制得的复合 物包封率极低, 且分子间作用力极弱, 质量不稳定。沃维汉 [ 沃维汉, 重组人胰岛素复合物、 其制备方法及包含该复合物的药物组合物, 中国 专利 : 01140047, 2004-10-06] 采用磷酸 盐缓冲液为溶剂, 将胰岛素和磷脂分别溶于或混悬于水溶液中, 混合均匀, 冷冻干燥去除水 分制备磷脂复合物, 结果发现, 当磷脂与药物的质量比为 25 ∶ 1( 摩尔比约为 185 ∶ 1) 时, 复合率仅 21.35%, 150 ∶ 1( 摩尔比约为 1110 ∶ 1) 时复合率为 72.0%。
理论上分析, 胰岛素含 53 个酰氨基, 4 个酚羟基, 12 个醇羟基, 这些基团都有可能 与磷脂复合, 则 1 摩尔的药物理论上需要约 70 摩尔的磷脂 ( 重量比约为 1 ∶ 10)。通常, 为 确保药物复合完全, 脂质材料的投料量应略高于理论值, 按理论量的 1.5 倍计算, 脂质材料 最大用量应不超过药物质量的 15 倍, 即磷脂用量应控制在胰岛素质量的 15 倍以下比较经 济合理。但 01140047 专利技术中, 磷脂的质量高达胰岛素的 150 倍时, 仍未能完全复合, 提 示以水为溶剂复合效率太低。
另一公开文件 [R·R·C·New, 包含中链单酸甘油酯的疏水性制剂, 中国专利 : 97196069, 1999-07-28] 被称为 Macrosol 技术, 提供了一种含脂质复合物的胰岛素油溶液, 其脂质复合物的制备方法也是将药物与双亲性的脂质材料共同溶于缓冲盐的水相溶剂中, 经旋转蒸发或冻干技术除去溶剂, 再溶于油相中制得油溶液 ( 或将复合溶液直接与油混
合, 再进行冷冻干燥 )。其确定的胰岛素与磷脂的重量比为 1 ∶ 1 至 1 ∶ 20, 优选 1 ∶ 2 至 1 ∶ 8, 但未提供复合率评价结果。鉴于 01140047 专利以水为溶剂难以获得高复合率的复 合物, 不难推测, 97196069 专利条件制备的复合物, 大部分药物可能并未与磷脂复合。
本专利发明人对 97196069 专利方法进行了验证。首先根据胰岛素复合物在环 己烷中易溶、 而游离胰岛素不溶的特点, 建立了复合率测定方法 (HPLC 方法定量 )。根据 97196069 专利方法制备胰岛素磷脂复合物,当胰岛素 / 磷脂质量比为 1 ∶ 2 时, 复合率低 于 8% ; 质量比为 1 ∶ 8 时, 复合率未超过 21% ; 质量比为 1 ∶ 12 时, 复合率未超过 25%。 进一步将胰岛素 / 磷脂质量比为 1 ∶ 8 和 1 ∶ 12 的复合物溶于中链油中, 搅拌制备药物浓 度为 1.5mg/g 的中链油溶液, 室温下放置 1 个月和冰箱 (2-8℃ ) 条件下放置 3 个月, 均出现 混浊现象。
虽然 97196069 专利确定的胰岛素 / 磷脂质量比例与理论值接近, 但由于其制备方 法中以水为复合溶剂, 因此复合率极低, 这与 01140047 专利技术结果相吻合。
综合以上两项专利, 以水为溶剂制备胰岛素脂质复合物, 复合率低, 存在明显缺 陷。
后续一些专利或报道, 均在 97196069 基础上对溶剂系统进行了改进, 选用含有冰 醋酸的乙醇、 含有冰醋酸的 DMSO、 或含有稀盐酸溶液的乙醚等为复合反应的溶剂。 与水溶液 相比, 有机溶剂的极性相对较小, 而酸的加入是为了增加胰岛素的溶解度, 提高复合效率。 本专利发明人也进行了验证试验, 结果表明, 由于冰醋酸和盐酸的酸性较强, 且不易挥除干 净, 制备过程中胰岛素含量下降约 5-10%, 贮存过程中含量继续下降至 20%或更多。
综上所述, 关于胰岛素脂质复合物的制备, 现有的专利或文献方法因溶剂系统选 择的缺陷导致复合效率低、 药物在制备过程中易发生降解、 酸性成分或水分的残留影响贮 存过程中的质量稳定性。此外, 对药物 / 脂质材料用量比例未经科学优化, 最终获得的复合 物因复合率低而导致油中溶解度的改善程度有限, 制成的油溶液载药量低且贮存过程中易 出现混浊等不稳定现象。 发明内容 :
本发明提供了一种胰岛素脂质复合物, 由胰岛素和脂质材料在含低 沸点酸的有 机溶剂系统中复合而成, 复合物中, 胰岛素与脂质材料的质量比为 1 ∶ 3 ~ 1 ∶ 15 ; 优选地 为 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 12 ; 更优选地为 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 10。 。
本发明的胰岛素脂质复合物, 胰岛素可选自天然胰岛素、 猪胰岛素、 牛胰岛素、 重 组人胰岛素及各类中、 长效胰岛素, 优选地为重组人胰岛素 ; 脂质材料选自天然磷脂、 合成 磷脂、 胆甾醇、 胆酸及其盐类的一种或它们的混合物, 优选的脂质材料选自天然磷脂, 优选 的天然磷脂选自蛋黄磷脂或大豆磷脂。
本发明的胰岛素脂质复合物, 还可包含一种或多种选自抗氧化剂、 金属螯合剂和 蛋白酶抑制剂的其它成分。
本发明的胰岛素脂质复合物, 所使用的复合溶剂为含低沸点酸的有机溶剂, 其中, 低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物, 有机溶剂为甲醇、 四氢呋 喃、 DMSO、 三氯甲烷、 二氯甲烷和乙醚中的一种或其混合物。
本发明的胰岛素脂质复合物, 可采用如下方法制备 :方法 1) 取有机溶剂, 先加入适量三氟醋酸或通入适量氯化氢气体, 再加入胰岛素 和脂质材料, 搅拌使两者充分复合至形成澄清透明的溶液, 旋转蒸法或喷雾干燥除去有机 溶剂, 残余物干燥即得。
方法 2) 取有机溶剂, 将脂质材料先溶于其中, 再加入胰岛素, 搅拌条件下缓慢通 入适量氯化氢气体或加入适量三氟醋酸, 至胰岛素完全溶解形成澄清透明的溶液, 常温条 件下搅拌或超声处理一定时间, 使胰岛素与脂质材料充分复合, 旋转蒸法或喷雾干燥除去 有机溶剂, 残余物经干燥即得。
方法 3) 将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的溶剂 A 中, 制成澄清的胰岛 素溶液, 脂质材料溶于适量的溶剂 B 中制成澄清的脂质溶液, 将胰岛素溶液与脂质溶液混 合均匀后, 水浴减压旋蒸, 再经水泵 抽干处理, 干燥即得。
方法 4) 将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的的溶剂 A 中, 制成澄清的胰 岛素溶液, 脂质材料溶于适量的溶剂 B 中制成澄清的脂质溶液, 将胰岛素溶液与脂质溶液 混合均匀后, 在一定温度下水浴减压旋蒸, 在溶剂蒸除过程中, 分次加入适量的溶剂 B, 继续 旋蒸, 水泵抽除溶剂, 干燥即得。
上述的方法 1) 及方法 2) 中, 所述的 “有机溶剂” 选自甲醇、 四氢呋喃和 DMSO 中的 一种或其混合物, 优选地为甲醇。三氟乙酸的加入量或氯化氢气体的通入量, 以能使加入 的胰岛素完全溶解为准, 优选地, 酸在有机溶剂中的浓度为 0.01-0.5%, 优选 0.05-0.1%。 ( 重量 / 体积, g/ml) 在上述方法 3) 及方法 4) 中, 所述的 “溶剂 A” 可选自甲醇、 四氢呋喃或 DMSO 中 的任一种溶剂或它们的混合物, 优选甲醇 ; 所述的 “溶剂 B” 可选自三氯甲烷、 二氯甲烷或 乙醚中的一种或其混合物, 优选二氯甲烷。三氯醋酸或氯化氢气体在溶剂 A 中的浓度约为 0.01-0.5%, 优选 0.05-0.1%。溶剂 B 的用量约为溶剂 A 的 3-8 倍, 优选 4-6 倍。
胰岛素与脂质材料的复合溶液中, 胰岛素的浓度应控制在 0.5 ~ 30mg/ml, 优选 1.0 ~ 10.0mg/ml。 “常温条件下搅拌或超声处理一定时间” 中的 “常温条件” 系指控制在 15℃~ 30℃, 例如 15℃、 20℃、 25℃或 30℃ ; “一定时间” 是指控制在 30 分钟以内, 例如 30 分钟、 20 分钟、 10 分钟或 5 分钟。 “
在本发明的制备方法中, 去除有机溶的方法可以是旋转蒸发法, 也可以是冷冻干 燥法, 还可采用其它挥除溶剂的方法, 只要能够将溶剂挥除干净, 并且不影响药物的稳定 性即可。旋转蒸发法去除溶剂时, 应在不超过 40℃的条件下进行, 具体地说, 可以是 35℃、 30℃或 25℃。
本发明还提供一种胰岛素油溶液的制剂, 其包含本发明所述的胰岛素脂质复合物 和油。 其中, 油选自长链甘油三酸酯 ( 长链油 )、 中链甘油酸三酯 ( 中链油 )、 甘油单油酸酯、 甘油单甘酯、 油酸乙酯、 肉豆蔻酸异丙酯中的一种或它们的混合物。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液, 其特征在于, 油中还可任选地加入选 地加入一种或多种选自吐温 80、 司盘 20、 汴泽、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 (Cremphor RH40)、 聚 氧乙烯蓖麻油 (Cremphor EL35) 和 Labrosal 的乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液, 其特征在于, 油中还可任选地加入一 种或多种选自丙二醇、 PEG400、 Transcutol P 中的助乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液, 药物含量可以是 12mg/g, 10mg/g, 8mg/
g, 6mg/g, 5mg/g, 4mg/g, 2mg/g 或更低。
本发明制备的胰岛素脂质复合物, 在制备胰岛素缓释注射剂中的应用。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液, 在制备胰岛素口服、 经皮、 粘膜和肺部 吸入等非注射给药制剂中的应用。
本发明还提供了一种胰岛素新型囊泡, 其包含本发明的胰岛素脂质复合物和 磷脂, 还可加入适量的 Tween20, Span60 等一种或几种混合表面活性剂, 平均粒径约为 20nm-200nm。
本发明包含胰岛素脂质复合物的新型囊泡, 可以是水分散液, 还可以经冷冻干燥 或喷雾干燥后制成固体粉末。
本发明的包含胰岛素复合物的新型囊泡, 在制备胰岛素口服、 经皮、 粘膜和肺部吸 入等非注射给药制剂中的应用。
与现有技术方法相比, 本发明的复合物具有以下优点 :
1) 含低沸点酸的有机溶剂系统作为复合溶剂 : 复合溶剂中不含水, 低沸点的三氟 醋酸和氯化氢气体易于蒸除, 既为胰岛素的溶解提供了酸性环境, 又缩短了有机溶剂挥除 时间 ; 选择的有机溶剂可保证胰岛素与脂质材料的复合溶液澄清, 其极性可确保胰岛素与 脂质材料的复合稳定性, 且不影响胰岛素的质量稳定, 制得的复合物中无酸性物质或水分 残留, 复合率在 90%以上, 制备及贮存过程中药物含量无明显变化。 2) 药物 / 脂质材料用量合理 : 基于复合溶剂的突破, 胰岛素与脂质材料的质量比 为 1 ∶ 3 ~ 1 ∶ 15, 即可获得复合完全的复合物。脂质材料用量与理论推测值相吻合。
3) 制备稳定的油溶液 : 复合物显著改善了胰岛素的油溶性, 制得的油溶液不仅载 药量高, 且稳定性好, 长期放置不发生混浊, 物理性质和化学性质均较稳定。
4) 制备稳定的新型囊泡 : 复合物显著改善了胰岛素的亲脂性, 使药物分布在囊泡 的双分子膜夹层中, 药物在胃肠液中的稳定性及粘膜转运速率均明显改善。
在本发明中, 如果没有特别地指出, 本文所用的科学和技术术语以及名称都具有 与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的意思 ; 并且, 如果没有特别地指出, 其中所 采用的物质及其含量或比例、 装置、 仪器、 制备条件等都是本领域技术人员所熟知的或者其 根据本发明的描述可得知的。
制备实施例
1. 前期探索性研究结果
1.1 有机溶剂对药物化学性质及空间结构的影响考察
本发明人在前期研究工作中, 对不同的有机溶剂进行了系统考察, 具体方法如下 : 取胰岛素溶液 (pH7.4PBS) 适量, 加入适量的甲醇、 乙醇、 丙酮、 四氢呋喃、 乙酸乙酯、 乙醚、 氯仿, 充分混匀放置 1 小时, 氮吹吹干, 加入 pH7.4 的 PBS 溶液复溶, 过滤后进行 HPLC 测定, 以相同浓度的胰岛素对照品 PBS 溶液为对照, 依法测定, 计算胰岛素含量的变化, 结果显 示, 甲醇中药物含量无明显变化, 最为稳定, 其次为四氢呋喃, 而乙醇和丙酮则使药物含量 下降约 5-10%, 乙醚下降约 15%, 乙酸乙酯、 氯仿和四氢呋喃中下降更为明显, 约 30-40%, 提示在甲醇和四氢呋喃中胰岛素化学性质比较稳定。此外还考察了 DMSO 和 DMF, 由于 DMSO 和 DMF 沸点太高, 氮吹法难以吹干, 因此采用冷冻干燥法去除溶剂, 再加入 pH7.4 的 PBS 溶 液复溶, 过滤后同上法进行 HPLC 测定并计算胰岛素含量, 结果显示, DMF 使胰岛素含量明显
下降, 可能与其碱性条件有关, 而 DMSO 质量相对比较稳定。
进 一 步 按 上 述 甲 醇、 四 氢 呋 喃 和 DMSO 处 理 方 法 操 作, 去 除 溶 剂 后 用 5mM PBS(pH7.4) 溶解成含胰岛素 0.1mg/ml 的供试溶液, 照圆二色谱测定法, 将供试溶液置于光 径 0.1cm 的石英样品池中, 于远紫外区 (190nm ~ 250nm) 测定, 记录二级结构图谱的特征峰 峰位及最低椭圆率 ; 另将供试溶液置于 1cm 的样品池, 于近紫外区 (250nm ~ 350nm) 测定, 记录三级结构图谱的特征负峰峰位及最低椭圆率。 结果表明, 三种溶剂处理后的胰岛素, 二 级图谱均显示两个负峰, 分别在 210nm 和 223nm 左右, 最低椭圆率分别为 -10.63 和 -8.45 左右 ; 三级图谱中均有一个负峰, 峰位在 274.5nm 左右, 最低椭圆率约为 -2.26。与未经有 机溶剂处理的胰岛素 PBS 结果相比, 无明显变化, 提示甲醇、 四氢呋喃和 DMSO 不会导致空间 结构的改变。
1.2 冰醋酸和盐酸的加入对复合物质量的影响
现有文献中, 为了使胰岛素形成澄清透明的溶液, 大多在有机溶剂中加入冰醋酸 或盐酸。
冰醋酸沸点高, 旋转蒸发耗时长, 随着有机溶剂的挥除, 冰醋酸浓度越来越浓, 导 致胰岛素降解或变性。尤其是最终的复合物中残留的冰醋酸无法去除, 会使复合物贮存稳 定性变差。这种冰醋酸残留量较高的复合物, 即使溶于油溶液中, 药物含量仍会明显下降, 在最初的 24 小时含量通常下降。 本发明人曾选用对胰岛素含量没有影响的甲醇为复合溶剂, 加入 1-5%的冰醋酸, 以药物 / 磷脂质量比为 1 ∶ 10 制备复合物, 35℃旋转蒸发法去除溶剂, 真空条件下干燥 48 小时, 对制得的复合物进行测定, 复合率达 98%以上, 但气相色谱法测定冰醋酸残留量超 出 0.5%。制得的复合物在 2-8℃条件下贮存 4 周后, 与初始含量相比, 胰岛素含量下降约 20%。将复合物溶于中链油中, 室温放置 24 小时, 与初始含量相比, 含量下降约 15%。由此 提示, 冰醋酸的残留对产品稳定性有极为显著的影响。
本发明人进一步用含有稀盐酸的甲醇溶液作为反应溶剂进行试验, 35℃旋转蒸发 法 ( 温度达到 50℃即对胰岛素质量产生明显影响, 通常需控制在 40℃以下、 且时间不宜过 长 ), 结果发现, 因引入了一定的水分, 去除溶剂更加困难, 复合物成形不好。气相色谱法测 定盐酸残留量约 0.2%, 在 2-8℃条件下贮存 4 周后, 与初始含量相比, 复合物中的胰岛素含 量下降约 10%。将复合物溶于中链油中, 室温放置 24 小时, 与初始含量相比, 含量下降约 5%。
1.3 以甲醇 ( 含 0.1%三氟乙酸 )- 二氯甲烷为复合溶剂的考察
以甲醇 ( 含 0.1 %三氟乙酸 )- 二氯甲烷为溶剂, 设定药物质量浓度为 1.5mg/ ml, 胰岛素与大豆磷脂的投料比分别为 1 ∶ 1, 1 ∶ 3, 1 ∶ 5, 1 ∶ 7.5, 1 ∶ 10, 1 ∶ 15 和 1 ∶ 20(w/w)。将胰岛素溶于甲醇中, 磷脂加入二氯甲烷中, 然后将两者混合, 旋转蒸发除去 溶剂, 水浴温度为 37℃, 氮吹。
照如下方法测定复合率及油中溶解度
复合率 ( 包封率 ) : 利用胰岛素复合物在环己环中易溶, 而游离胰岛素不溶于环 己环的特征, 进行复合率测定。
复合物药物总含量测定 : 精密称取胰岛素磷脂复合物适量, 用含 1%冰醋酸的甲 醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试液 ; 另精密称取胰岛素对照品适量, 用 PBS(pH7.4) 溶
液溶解制成浓度为 1mg/ml 的溶液, 再用含 1%冰醋酸的甲醇稀释成浓度为 0.2mg/mL 的溶 液作为对照液。分别精密量取供试液和对照液各 10μL, 照 HPLC 方法, 以 0.2% TFA ∶乙 腈= 70 ∶ 30 为流动相, 柱温 30 ℃, 流速 1mL/min, 波长 214nm, 色谱柱为 Agilent ZORBAX 300SB-C8, 依法测定, 根据峰面积按外标法计算复合中的药物总含量, 记为 W 总。
复合物中与磷脂结合的药物含量测定 : 精密称取胰岛素磷脂复合物适量 ( 含胰岛 素约 10mg), 置 10mL 容量瓶中, 加环己烷溶解并定容, 摇匀, 经 0.45μm 有机膜滤除未被复合 的游离胰岛素, 精密量取续滤液 2mL 于 10mL 容量瓶中, 氮吹除去溶剂, 加入含 1%冰醋酸的 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 照上述 HPLC 方法依法测定, 按外标法计算溶液中的药物含 量, 记为 W 复合。
复合率按下式计算 : 复合率%= (W 复合 /W 总 )×100%
油中溶解度 : 分别取适量的胰岛素及磷脂复合物, 加入大豆油或中链油, 置 30℃ 磁力搅拌器中, 搅拌 6h 使充分混合、 溶解, 30 ℃放置 24h, 观察药物是否析出, 如无药物析 出, 再加适量胰岛素磷脂复合物, 同法操作, 直至药物析出。 取样 5mL, 用 0.45μm 滤膜过滤, 取续滤液用 1%醋酸甲醇稀释适宜倍数, 照 HPLC 依法测定, 计算大豆油及中链油中的表观 溶解度。
7 组复合物测定结果如下表所示 :
药物与磷脂比例对复合物的影响
结果表明 : 药物与磷脂的投料比例对药物的含量、 复合率及溶解度影响较为显著。 药物的含量随胰岛素在体系中所占比例的降低而增加 ; 当胰岛素与磷脂质量比为 1 ∶ 5 时, 两者基本复合完全, 但比例大于 1 ∶ 15 时, 复合率有下降趋势。在中链油中溶解度随磷脂 在体系中所占比例的增加而增加, 当两者比例大于 1 ∶ 7.5 时, 溶解度趋于稳定。
1.4 以甲醇 ( 通入氯化氢气体 ) 为复合溶剂的考察
以甲醇 ( 通入适量氯化氢气体 ) 为溶剂, 设定药物质量浓度为 2mg/ml, 考察胰岛素 与大豆磷脂的投料比分别为 1 ∶ 1, 1 ∶ 3, 1 ∶ 5, 1 ∶ 7.5, 1 ∶ 10, , 1 ∶ 15 和 1 ∶ 20(w/ w)。将胰岛素和脂质体料一同溶于甲醇中, 室温条件下搅拌 10 分钟使脂质材料和药物溶解 至溶液澄清, 移至旋蒸瓶中, 在 35℃条件下旋转蒸发去除溶剂, 室温下减压真空干燥 12 小 时以上。照上述 3.3 项下的方法测定复合率和中链油中溶解度, 结果如下 :
药物与磷脂比例对复合物的影响
本发明的目的, 是选择合适的复合溶剂系统, 提高胰岛素与脂质材料的复合效率 和质量稳定性。所选择的溶剂系统可同时满足以下条件 : 1) 脂质材料和胰岛素都能够溶解 形成澄清透明的溶液 ; 2) 系统中不含水分, 极性小, 有利于胰岛素与脂质材料分子间的复 合; 3) 溶剂系统蒸发效率高, 易挥除, 无酸性成分或水分残留 ; 4) 制备过程中胰岛素性质稳 定。
实施例 1 : 含不同比例大豆磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的 9 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 分别加入大豆磷脂 0.6g、 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入含氯化氢气体 ( 浓度 0.1%, 重量 / 体积, g/ml) 的甲醇溶液 20ml, 室温条件下搅拌 10 分钟使脂质材料和药物溶解至溶液澄清, 移至旋蒸瓶 中, 在 35℃条件下旋转蒸发去除溶剂, 室温下减压真空干燥 12 小时以上, 得药物 / 磷脂重量 比为 1 ∶ 3 ~ 1 ∶ 15 的 9 组复合物粉末。
9 组复合物经气相色谱法测定, 均未见氯化氢气体的残留。
实施例 2 : 含不同比例蛋黄磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的 8 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 分别加入蛋黄磷脂 0.6g、 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入含氯化氢气体 ( 浓度 0.1%, 重量 / 体积, g/ml) 的甲醇溶液 20ml, 室温条件下搅拌 10 分钟使脂质材料和药物溶解至溶液澄清, 移至旋蒸瓶
中, 在 35℃条件下旋转蒸发去除溶剂, 室温下减压真空干燥 12 小时以上, 得药物 / 磷脂重量 比为 1 ∶ 3 ~ 1 ∶ 15 的 9 组复合物粉末。
9 组复合物经气相色谱法测定, 均未见氯化氢气体的残留。
实施例 3 : 含不同比例大豆磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的 9 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 加入甲醇 ( 含 0.1%, v/v 三氟醋酸 ) 适量, 使胰胰岛素浓度控制在 10mg/ml ~ 2mg/ml, 室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解 至溶液澄清 ; 另取大豆磷脂 0.6g、 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入二氯 甲烷适量 ( 约为甲醇用量的 3-6 倍 ), 37 ℃水浴减压旋蒸, 旋蒸过程可再次加入二氯甲烷 ( 约为甲醇用量的 1-2 倍 ), 基本干燥后, 换用水泵抽 10min, 即得。
9 组复合物经气相色谱法测定, 均未见三氟醋酸的残留。
实施例 4 : 含不同比例蛋黄磷脂的胰岛素复合物的制备
将独立的 9 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 加入甲醇含 0.1%, v/v 三氟醋酸 ) 适 量, 使胰胰岛素浓度控制在 10mg/ml ~ 2mg/ml, 室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解至 溶液澄清 ; 另取蛋黄磷脂 0.6g、 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入二氯甲 烷适量 ( 约为甲醇用量的 3-6 倍 ), 37℃水浴减压旋蒸, 旋蒸过程可再次加入二氯甲烷 ( 约 为甲醇用量的 1-2 倍 ), 基本干燥后, 换用水泵抽 10min, 即得。 9 组复合物经气相色谱法测定, 均未见三氟醋酸的残留。
实施例 5 : 含不同比例脱氧胆酸钠的胰岛素复合物的制备
将独立的 8 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 分别加入脱氧胆酸钠 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入含氯化氢气体 ( 浓度 0.1%, 重量 / 体积, g/ml) 的四氢 呋喃溶液 20ml, 室温条件下搅拌反应 5 分钟, 移至旋转蒸发仪中, 在 35℃条件下蒸除溶剂, 室温下减压真空干燥 12 小时以上, 得 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 的 8 组复合物粉末。
8 组复合物经气相色谱法测定, 均未见氯化氢气体的残留。
实施例 6 : 含不同比例脱氧胆酸钠的胰岛素复合物的制备
将独立的 9 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 甲醇 ( 含 0.1%, v/v 三氟醋酸 ) 适量, 使胰胰岛素浓度控制在 10mg/ml ~ 2mg/ml, 室温条件下搅拌使脂质材料和药物溶解至溶液 澄清 ; 另取脱氧胆酸钠 0.6g、 1g、 1.2g、 1.4g、 1.6g、 1.8g、 2.0g、 2.4g 和 3.0g, 加入二氯甲烷 适量 ( 约为甲醇用量的 3-6 倍 ), 37℃水浴减压旋蒸, 旋蒸过程可再次加入二氯甲烷 ( 约为 甲醇用量的 1-2 倍 ), 基本干燥后, 换用水泵抽 10min, 即得。
9 组复合物经气相色谱法测定, 均未见氯化氢气体的残留。
实施例 7 : 以 DMSO 代替甲醇制备胰岛素脂质复合物制备
将独立的 3 份 0.2g 胰岛素称至锥形小瓶中, 分别加入大豆磷脂酰胆碱、 蛋黄磷脂 酰胆碱和脱氧胆酸钠各 2.0g, 加入含氯化氢气体 ( 浓度 0.1%, 重量 / 体积, g/ml) 的 DMSO 溶液 15ml, 室温条件下搅拌反应 15 分钟, -40℃以下预冻, 经冷冻干燥法去除溶剂, 得3组 复合物粉末。
3 组复合物经气相色谱法测定, 均未见氯化氢气体的残留。
实施例 8 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的油溶液
取大豆磷脂酰胆碱 1.8g, 加入甲醇溶液 30ml, 搅拌使溶解, 加入胰岛素 0.2g, 通入 氯化氢气体至溶液澄清透明, 室温条件下搅拌 5 分钟, 35℃条件下旋转蒸发蒸除溶剂, 室温
下减压真空干燥 12 小时以上, 制得复合物。
分别称取复合物 0.3g, 共 5 份, 分别加入甘油单油酸酯、 中链甘油酸三酯 ( 中链 油 )、 油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯各 2.7g, 搅拌使溶解, 制得载药量为 10mg/g 的油溶液, 过 滤即得。
上述油溶液室温放置 24 小时, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 为零时的 99.7%, 提 示药物未发生降解 ; 在 2-8℃条件下贮存 6 个月, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 为初始时的 99.1%, 质量稳定。
实施例 9 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的油溶液
称取实施例 1 至 4 的复合物 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), 每个实施例各取 两份, 分别加入中链甘油酸三酯 ( 中链油 ) 和长链甘油酸三酯 ( 长链油 ) 定量至 10g, 搅拌 使溶解, 分别制备成载药量为 1mg/g、 2mg/g、 3mg/g 和 5mg/g 的油溶液。
分别加入中链油或长链油定量至 10g, 制备成 8 份样品
上述油溶液室温放置 24 小时, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为零时的 98.5% 以上, 提示药物未发生降解 ; 于 2-4℃贮存 6 个月, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为初始 时的 99.4%以上, 质量稳定。
实施例 10 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的油溶液 ( 含乳化剂 )
取中链甘油酸三酯 ( 中链油 )10g, 共三份, 分别加入 1g、 2g 和 4g 吐温 80, 混匀, 制 得含乳化剂的油相 ;
称取实施例 5 至 7 的复合物适量 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), 共 3 份, 分别 加入上述 3 种不同乳化剂配比的油相各 9.45g, 搅拌使溶解, 制得载药量为 5mg/g 的油溶液, 过滤即得。
上述油溶液室温放置 24 小时, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为零时的 98.3% 以上, 提示药物未发生降解 ; 于 2-4℃贮存 6 个月, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为初始 时的 97.7%以上, 质量稳定。
上述油溶液含有乳化剂, 加 50 倍的水, 磁力搅拌 3 分种可发生乳化, 乳化后的平均 粒径≤ 1μm。
实施例 11 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的油溶液 ( 含乳化剂 )
取中链甘油酸三酯 ( 中链油 )10g, 分别加入 Cremphor RH401g、 2g 和 4g, 混匀制得 3 种不同乳化剂配比的油相 ;
称取实施例 2 至 4 的复合物适量 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), , 共 3 份, 分 别加入上述 3 种不同乳化剂配比的油相各 9.12g, 搅拌使溶解, 制得载药量为 8mg/g 的油溶 液, 过滤即得。
上述油溶液室温放置 24 小时, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为零时的 98.6% 以上, 提示药物未发生降解 ; 于 2-4℃贮存 6 个月, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为初始 时的 99.2%以上, 质量稳定。
上述油溶液中含有乳化剂, 加 50 倍的水, 磁力搅拌 3 分种可发生乳化, 乳化后的平 均粒径均≤ 1μm。
实施例 12 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的油溶液 ( 含乳化剂和助乳化剂 )
称取实施例 1 至 4 的复合物适量 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), 共 4 份, 按如 下处方加入油、 乳化剂和助乳化剂, 搅拌使溶解, 制得载药量为 10mg/g 的自微乳浓缩液。
加入中链油 / 长链油 (1 ∶ 1) 溶液至 10g
4 组油溶液室温放置 24 小时, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均 为零时的 98.3% 以上 ; 于 -4℃贮存 6 个月, 溶液澄清, HPLC 测定剩余含量, 均为初始时的 97.8%以上, 质量 稳定。
4 组油溶液中含乳化剂和助乳化剂, 加 5-500 倍的水、 稀盐酸或 pH6.8 的缓冲液, 均 可瞬间发生乳化, 激光粒度仪测定, 乳化后的平均粒径在 20 ~ 50nm 范围内。
实施例 13 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的囊泡溶液
称取实施例 1 至 3 的复合物适量 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), 至圆底烧瓶 中, 再加入适量游离磷脂 ( 游离磷脂与复合物中的磷脂量相当 ), 加入二氯甲烷 20ml, 使复 合物及磷脂溶解, 胰岛素浓度控制在 1mg/mL-10mg/mL 真空旋蒸, 水浴温度为 37 度, 待其挥 干形成薄膜后, 加入 10mLPBS 溶液水化 1h, 形成多室囊泡, 再通过超声波破碎或者高压均质 的方法处理, 得到粒径为 50nm 左右的单室囊泡。
实施例 14 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的囊泡溶液
称取实施例 1 至 8 的复合物适量 ( 均选取药脂比例为 1 ∶ 10, w/w), 至圆底烧瓶 中, 加入适量游离磷脂 ( 游离磷脂与复合物中的磷脂量相当 ), 再加入 Tween20 或 Span60 等 一种或几种混合表面活性剂适量, 加入二氯甲烷 20ml, 使复合物及磷脂溶解, 胰岛素浓度控 制在 1mg/mL-10mg/mL 真空旋蒸, 水浴温度为 37 度, 待其挥干形成薄膜后, 加入 10mLPBS 溶 液水化 1h, 形成多室囊泡, 再通过超声波破碎或者高压均质的方法处理, 得到粒径为 50nm 左右的单室囊泡。
实施例 15 : 包含胰岛素 / 磷脂复合物的囊泡粉末
将实施例 13 和 14 的囊泡溶液, 经冷冻干燥, 即得。
试验例
试验例 1 : 含胰岛素复合物的油溶液在胃肠生物酶环境中的稳定性
试验样品 : 胰岛素溶液 (INS)
胰岛素复合物 (Phytosome) 溶于水中制成混悬液
实施例 8- 实施例 12 的油溶液
将试验样品置于含有 1 % ( 重量 / 体积, g/ml) 胃蛋白酶的人工胃液, 置 37 ℃水 浴中孵育, 涡旋混匀, 1 分钟、 5 分钟和 30 分钟和 60 分钟取样 0.5ml, 加冷的 Tris 溶液 ( 取 Tris 试剂 6.07g, 加水至 500ml)0.1ml, 涡旋混匀后, 离心, 10000rpm, 5min, 取上清液照前述 HPLC 法依法测定胰岛素残余百分比, 结果如下 :
试验例 2 : 含胰岛素复合物的囊泡溶液在胃肠生物酶环境中的稳定性 试验样品 : 胰岛素溶液 (INS) 胰岛素普通囊泡 ( 胰岛素代替胰岛素复合物, 同法制备 )实施例 13 的包含复合物的新型囊泡
将试验样品置于含有 1 % ( 重量 / 体积, g/ml) 胃蛋白酶的人工胃液, 置 37 ℃水 浴中孵育, 涡旋混匀, 1 分钟、 5 分钟和 30 分钟和 60 分钟取样 0.5ml, 加冷的 Tris 溶液 ( 取 Tris 试剂 6.07g, 加水至 500ml)0.1ml, 涡旋混匀后, 离心, 10000rpm, 5min, 取上清液照前述 HPLC 法依法测定胰岛素残余百分比, 结果如下 :
样品 胰岛素溶液 (INS) 胰岛素普通囊泡 实施例 13 的囊泡
1min 0.76% 53.5-56.1% 82.2-85.2% 5min 检测不到 33.2-37.4% 68.3-72.9% 30min 检测不到 22.1-28.6% 43.2-45.7% 60min 检测不到 11.5-14.7% 30.8-33.2%试验例 3 : 含胰岛素复合物的囊泡溶液 Caco-2 细胞透过性
试验样品 : 胰岛素溶液 (INS)
胰岛素普通囊泡 ( 胰岛素代替胰岛素复合物, 同法制备 )
实施例 13 的包含复合物的新型囊泡
精密量取 0.5mL 同浓度的胰岛素溶液、 胰岛素普通囊泡和胰岛素磷脂复合物囊泡 ( 实施例 13), 加至培养在 12 孔板的 Caco-2 细胞上, 在 细胞下面加入 1.5mL 的 HBSS 溶液 于 30、 60、 120、 180、 240min 取样 200μl, HPLC 方法测定, 作为接受介质, 37 度空气浴中孵育, 计算累计透过量, 结果如下 :
样品 胰岛素溶液 (INS) 胰岛素普通囊泡 实施例 13 的囊泡
累积透过量 (% ) 1.65 8.70 17.52 以上试验例 4 : 胰岛素复合物的油溶液及新型囊包降血糖效果
选用体重 200±20g 正常雄性大鼠, 禁食 12h 后 ( 过夜 ), 按 60mg/kg 剂量腹腔注射 10mg/ml 的链脲佐菌素柠檬酸 - 柠檬酸三钠缓冲溶液 (pH4.5 左右 ), 稳定一周, 取血糖水平 大于 16.7mmol/l 判定为糖尿病模型。
大鼠试验前禁食一夜, 不禁水, 实验期间自由饮水。大鼠 35 只, 随机分成 5 组, 按 以下分组方案给药, 于不同时间点尾尖取血, 血糖仪测定血糖值。
第一组 : 不给药空白对照,
第二组 : 胰岛素普通囊泡, 按剂量 70IU/kg 口服
第三组 : 实施例 9 处方 1 中链油制备的油溶液, 按剂量为 70IU/kg 口服
第四组 : 实施例 13 制备的新型纳米囊泡, 按剂量为 70IU/kg 口服
计算每只动物各个时间点的血糖百分比, 以降糖百分比为纵坐标, 时间为横坐标, 绘制降糖效果曲线。17