水包油型乳液.pdf

摘要
申请专利号：	CN201080023606.7	申请日：	2010.05.18
公开号：	CN102448312A	公开日：	2012.05.09
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A23D 7/005申请公布日:20120509\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A23D 7/005申请日:20100518\|\|\|公开
IPC分类号：	A23D7/005; C11B5/00	主分类号：	A23D7/005
申请人：	荷兰联合利华有限公司
发明人：	A·R·科克斯; H-J·金
地址：	荷兰鹿特丹
优先权：	2009.05.29 EP 09161584.9
专利代理机构：	中国专利代理(香港)有限公司 72001	代理人：	李连涛;林森
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内容摘要

本发明提供了包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油相的碘值大于40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于30克/升并低于140克/升。同时还提供了包含这种水包油型乳液的产品。

权利要求书

1：包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油相的碘值大于 40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升，该水包油型乳液具有至少 1v/v％的油与水的比率。
2：根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该疏水蛋白为第 I 类或第 II 类疏水蛋白，优选第 II 类疏水蛋白，更优选 HFBII。
3：根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该油的碘值大于 60，优选大于 90，更优选大于 120，最优选大于 140。
4：根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该油选自橄榄油，玉米油，低芥酸菜籽油，大豆油，葵花籽油，亚麻籽油及其任意混合物。
5：根据权利要求 1 所述的水包油型乳液，其中该疏水蛋白与油的比率大于 40 克 / 升，优选大于 60 克 / 升，更优选大于 60 克 / 升，且其中该疏水蛋白与油的比率低于 130 克 / 升，优选低于 120 克 / 升，更优选低于 100 克 / 升。
6：包含疏水蛋白和油的水包油型乳液的食品，其中该油相的碘值大于 40，其特征在于，该疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 1v/v％。

说明书

水包油型乳液
    【技术领域】
     本发明涉及水包油型 (O/W) 乳液。特别是，本发明涉及抗氧化的水包油型乳液。背景技术种类繁多的消费品包含有水包油型乳液，包括化妆品制剂 ( 例如护肤霜，润肤剂，化妆水 (lotion)，头发和皮肤调理剂 ) 和食品 ( 例如调料 (dressing)，冰激凌，蛋黄酱，涂抹酱 (spread) 及调味汁 )。要确保消费者对这类产品的接受度，关键在于乳液的物理化学性质，另外，乳液及其中成分的稳定性对确保此类产品的保质期是至关重要的。
     有许多机制会降低包含水包油型乳液产品的品质。絮凝是由于乳液中的颗粒聚集在一起，然后可能漂浮到连续相的顶部或沉淀到连续相的底部的过程。乳液分层是在浮力的作用下乳液中的物质迁移至样品的顶部，同时该物质的颗粒保持分离。破乳和凝聚是其中颗粒凝聚并在连续相中形成层。不稳定的乳液特别容易受到这些机制的影响，并且遭受乳液的物理化学结构中的破坏和失去消费者所需的有益特性。油的降解可进一步影响包含水包油型乳液产品的质量。氧化就是这样一个可造成降解并导致酸败和损失重要功能成分的过程。欧洲专利申请 EP1978824 公开了充气组合物，其具有至少 10％膨胀率并包含水和乳化脂肪相，其中所述组合物中包括疏水蛋白。 EP1978824 的实施例 1-4 包括因其极易氧化而臭名昭著的橄榄油。因此仍然需要具有改进的保质期的能抗其中的油氧化的水包油型乳液。
     测试和定义
     除非另有定义，此处使用的所有技术术语与本领域普通技术人员 ( 如胶体化学 ) 通常理解的含义相同。
     油
     此处用到的术语 “油” 是类脂 (lipids)，脂肪，或其任意混合物的通称，纯的或在溶液中含有化合物。油类也可包括悬浮液中的颗粒。
     类脂
     此处用到的术语 “类脂” 是作为长链脂肪酸或长链醇的通称，其中术语 “长链” 作为 12 或更多个碳原子的通称。
     脂肪
     此处用到的术语 “脂肪” 是作为含多于 80％的甘油三酯的化合物的通称使用。它还可含有甘油，单酸甘油脂和游离脂肪酸。通俗地说，液体脂肪通常是指油类，但是此处的术语脂肪也作为此液体脂肪的通称。脂肪包括：植物油 ( 例如：杏仁油，花生油，山菊油，摩洛哥坚果油，鳄梨油，巴巴苏仁油，木棉油，黑籽油 (black seed oil)，黑莓籽油，黑加仑籽油，蓝莓籽油，琉璃苣油，金盏花油，亚麻籽油 (Camelina Oill)，油茶籽油 (Camellia Seed Oil)，蓖麻油，樱桃仁油，可可脂，椰子油，玉米油，棉籽油，月见草油，葡萄柚油，葡萄籽油，榛子油，大麻籽油，荷荷巴油，柠檬籽油，青柠檬籽油 (lime seed oil)，亚麻籽油，奇异果油，澳洲坚果油，玉米油，芒果脂，白芒花籽油，哈密瓜籽油，辣木油，橄榄油，橙籽油，棕榈
     油，木瓜籽油，西番莲籽油，桃仁油，李子油，石榴籽油，罂粟籽油，南瓜籽油，油菜籽 ( 或低芥酸菜籽 ) 油，红树莓籽油，米糠油，玫瑰果油，红花油，沙棘油，芝麻油，大豆油，草莓籽油，葵花籽油，甜杏仁油，核桃油，小麦胚芽油 ) ；鱼油 ( 例如：沙丁鱼油，鲭鱼油，鲱鱼油，鱼肝油，蚝油 ) ；动物油 ( 例如：共轭亚油酸 ) ；或其他油类 ( 例如：石蜡油，环烷油，芳香油，硅油)；或其任意的混合物。
     碘值
     此处用到的术语 “碘值” 是作为衡量油不饱和度的通称，并表示为每克样品吸收的碘的厘克数 (％被吸收的碘 )。碘的厘克数越高，代表油中不饱和双键越多，因此油更倾向于通过双键氧化。根据 American Oil Chemists′ Societ(AOCS) 官方方法 Tg 1a-64，第1 到 2 页， American Oil Chemists′ Society 的官方方法和推荐试验，第二版， D.Firestone 编辑， AOCS 出版， Champaign， 1990， 1990 年修订的方法中提供的 Wijs 方法确定碘值。
     疏水蛋白与油的比率计算
     此处用到的术语 “疏水蛋白与油的比率” 定义为水包油型乳液中疏水蛋白的质量 ( 克 ) 比油的体积 ( 升 )。因此，疏水蛋白与油的比率表示为：
     乳液中疏水蛋白的总质量 ( 克 ) ：乳液中油的总体积 ( 升 ) ＝克 / 升油与水的比率计算
     此处用到的术语 “油与水的比率” 定义为油的体积 ( 毫升 ) 比水包油型乳液中水的体积 ( 毫升 )。因此，油与水的比率表示为：
     ( 乳液中油的总体积 ( 毫升 )/ 乳液中水的总体积 ( 毫升 ))×100 ＝ v/v％
     水包油型乳液
     此处用到的 “水包油型乳液” 是作为互不相溶两相的混合物的通称，其中油 ( 分散相 ) 分散在水溶液中 ( 连续相 )。
     食品
     此处用到的术语 “食品” 是作为入口的产品和成分的通称，其组分在胃肠道中是有活性的和 / 或被胃肠道吸收，来获取与人体及其组织的营养，恢复精力和满足嗜好，这些产品将被销售并销卖给顾客，以供人们消费。食品的例子是茶，包括其前体；涂抹酱；冰激凌；冷冻水果和蔬菜；零食，包括减肥食品和饮料；辛辣料 (condiment)，调味料，和烹饪助剂 (culinary aid)。食品可尤其带来以下任意种好处：健康的新陈代谢，延长寿命，最佳的成长和发展，最佳的胃肠道功能，避免代谢综合征和抗胰岛素性，避免血脂异常，体重控制；健康的矿物质代谢，免疫健康，最佳的视力健康，避免认知障碍和记忆力减退，头发和皮肤的健康，美容，以及良好的味觉和嗅觉。
     涂抹酱
     此处用到的术语 “涂抹酱” 是作为含油和水的乳液的通称，例如，人造黄油型涂抹酱。有利地涂抹酱的 pH 为 4.8-6.0。可通过将涂抹酱熔化，从水相中分离熔化的脂肪相并测定水相中的 pH 值来测定其 pH 值。
     本发明中的涂抹酱可包括涂抹酱常用的其他成分，例如调味成分，增稠剂，胶凝剂，着色剂，维生素，乳化剂， pH 值调节剂，稳定剂等。对本领域技术人员来说，采用这些成分的普通添加量以及制备人造黄油或涂抹酱的适宜的方法是众所周知的。
     调味料
     此处用到的术语 “调味料”是作为含油和水的乳液的通称，例如醋油沙司 (vinaigrette) 和色拉调味料类型的组成物。
     充气
     术语 “充气” 是指例如通过机械手段有意地将气体加入产品中。气体可以是任何气体，但优选，特别是在食品背景下，食品级气体例如空气，氮气或二氧化碳气体。充气的程度通常定义为术语 “膨胀率 (overrun)” 。在本发明中，％膨胀率是定义为体积术语：
     膨胀率＝ (( 最终充气产品的体积 - 混合物的体积 )/ 混合物的体积 )X 100
     产品中的膨胀率值有所不同，取决于所需产品的特性。例如，糕点例如慕斯 (mousses) 中的膨胀度可高达 200 至 250％。一些速冻产品，室温产品和热产品中的膨胀度可以较低，但基本高于 10％，例如奶昔中的膨胀度通常是从 10％到 40％。
     疏水蛋白
     疏水蛋白是明确定义的蛋白质种类 (Wessels， 1997， Adv.Microb.Physio.38 ： 1-45 ； Wosten， 2001， Annu Rev.Microbiol.55 ： 625-646)，在疏水 / 亲水界面上可自组装 (self-assembly)，并具有保守序列 (conserved sequence) ：
     Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm( 序列 1)，其中 X 代表任意的氨基酸， n 和 m 独立代表整数。通常，疏水蛋白长度可达 125 个氨基酸。保守序列上的半胱氨酸残基 (C) 是二硫桥 (disulphide bridge) 的一部分。在本发明中，术语疏水蛋白具有更广泛的含义，以包括在疏水 - 亲水界面处仍然表现为自组装的特性，导致形成蛋白质膜的功能相当的蛋白质，例如含如下序列的蛋白质：
     Xn-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm( 序列 2) 或其中一部分在疏水 - 亲水界面处仍然表现为自组装的特性，导致形成蛋白质膜。根据本发明的定义，可通过如下方法检测自组装：将蛋白质吸附到聚四氟乙烯和利用圆二色性建立二级结构 (secondary structure)( 通常是 α- 螺旋 )(De Vocht et al.， 1998， Biophys.J.74 ： 2059-68)。
     可通过在蛋白质溶液中培育聚四氟乙烯片，随后用水或缓冲液至少洗涤三次的方法 (Wosten et al.， 1994， Embo.J.13 ： 5848-54) 确定膜的形成。该蛋白质膜可以以任何适当的方法目测，例如以本领域常用的荧光标记或使用荧光抗体标记。m 和 n 值通常范围在 0 到 2000，但更通常 m 和 n 之和小于 100 或 200。疏水蛋白在本发明中的定义中包括疏水蛋白与另外的多肽以及疏水蛋白和其他分子例如多糖的共轭物形成的融合蛋白。
     目前确定的疏水蛋白通常分类为第 I 类或第 II 类。这两种类型已确定为真菌中的分泌性蛋白质 (in fungi as secreted protein)，其在两亲薄膜的疏水界面处自组装。第 I 类疏水蛋白的聚集物相对难溶 (insoluble)，而第 II 类疏水蛋白的聚集物易溶于多种溶剂。
     疏水蛋白类蛋白质也可在丝状菌，例如放线菌和链霉菌属中鉴定出来 (WO01/74864)。这些细菌蛋白质与真菌疏水蛋白相比，只形成一个二硫桥，因为他们只有两个半胱氨酸残基。这些蛋白是与具有序列 1 和 2 所示的同源序列的疏水蛋白属于功能性等价物的例子，并也在本发明的范围之内。
     可以通过使用任何适当的工法对天然资源例如丝状真菌进行提取，从而获得疏水蛋白。例如，通过培养能够将疏水蛋白分泌到培养基中的丝状真菌，或者通过使用 60％乙醇从真菌菌丝体提取，可以获得疏水蛋白。尤其优选从天然分泌疏水蛋白的宿主有机体中分离疏水蛋白。优选的宿主为丝孢菌类 ( 例如，木霉属 )、担子菌类、子囊菌类。特别优选的宿主是食品级有机体，例如分泌名为 cryparin 的疏水蛋白的栗疫病菌 (Cryphonectria parasitica)(MacCabe and Van Alfen， 1999， App.Environ.Microbiol 65 ： 5431-5435)。
     另外，可利用基因重组技术获取疏水蛋白。例如宿主细胞，典型的微生物，可经改性来表达疏水蛋白，然后可将该疏水蛋白分离，并相应用于本发明。将编码疏水蛋白的核酸结构引入到宿主细胞的技术在本领域是公知的。编码疏水蛋白的超过 34 个基因已由多于 16 种的真菌种属中克隆出来 ( 参见例如 WO96/41882，其确定了双孢菇 (Agaricus bisporus) 中的疏水蛋白序列， Wosten， 2001， Annu Rev.Microbiol.55 ： 625-646)。重组技术也可用来修饰疏水蛋白序列或合成新的具有期望的 / 改进特性的疏水蛋白。
     通常情况下，通过编码所需疏水蛋白的核酸结构来转化适当的宿主细胞或有机体。编码多肽的核苷酸序列可插入编码转录和翻译所必需元件的合适的表达载体，并以使得它们将在适当的条件下表达 ( 如在恰当的定位和正确的读码框及适当的目标和表达序列 ) 的方式。对本领域技术人员来说，构建这些表达载体所需的方法是公知的。
     许多表达系统可用来表达多肽编码序列。这些包括但不限于，细菌，真菌 ( 包括酵母 )，昆虫细胞系统，植物细胞培养系统和所有由适当的表达载体转化 (transformed) 的植物。优选的宿主是被认为是食品级 - 基本认为安全的 (GRAS) 的那些。合适的真菌种类，包括酵母，例如 ( 但不限于 ) 那些酵母属，克鲁维酵母菌属，毕赤酵母菌 (Pichia)，汉逊酵母属 (Hansenula)，假丝酵母属 (Candida)，裂殖酵母属 (Schizo) 及其类似物，和丝状种类，如 ( 但不限于 ) 那些曲霉属真菌，木霉属，毛霉属，脉孢菌属 (Neurospora)，镰孢菌属 (Fusarium) 及其类似物。
     编码疏水蛋白的序列优选与在自然中确定的疏水蛋白在氨基酸水平上至少 80％相同，更优选至少 95％或 100％相同。然而，本领域技术人员可制造保守的替代品，或其它氨基酸改变却不降低疏水蛋白的生物活性。为了本发明的目标，这些与天然存在的疏水蛋白拥有高度等同性的疏水蛋白也包括在 “疏水蛋白” 术语中。
     可从培养基或细胞提取物中纯化疏水蛋白，例如， WO01/57076 中描述的步骤，其包括将存在于含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白吸附至表面，然后将该表面与表面活性剂例如吐温 20 接触，以从该表面洗脱该疏水蛋白。另见 Collen 等， 2002， Biochim Biophys Acta.1569 ： 139-50 ； Calonje 等， 2002， Can.J.Microbiol.48 ： 1030-4 ； Askolin 等， 2001， Appl Microbiol Biotechnol.57 ： 124-30 ； and De Vries 等， 1999， Eur J Biochem 262 ： 377-85。
     保质期
     此处用到的术语 “保质期” 是消费产品，例如被认为适于销售或消费的食品的时间长度的通称。特别是，保质期是产品可被储藏的时间，在此期间在预期的 ( 或特定的 ) 配送、储藏及陈列条件下，规定比例的货物的限定质量保持合格。在本案中，保质期是指水包油型乳液维持对于确保消费者接受这些产品的重要理化特性的时间长度。
     发明简述
     现在，我们已经发现，抗氧化的水包油型乳剂可以包含一定量的疏水蛋白和油的配制剂获得。
     因此，在第一方面，本发明提供了包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油的碘值大于 40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 1v/v％。对水包油型乳液的稳定化和防止其降解进行了大量的研究，我们发现该疏水蛋白与油的比率的优点在于，在这种乳液中，该分散相中的油的氧化被显著降低。因此，疏水蛋白与水的比率优选大于 35 克 / 升，更优选大于 40 克 / 升，在更优选大于 60 克 / 升，和最优选 80 克 / 升。疏水蛋白的总用量优选低于 130 克 / 升，更优选低于 120 克 / 升，再更优选低于 100 克 / 升。
     正如上文所述，疏水蛋白可以是第 I 类或第 II 类疏水蛋白，优选第 II 类疏水蛋白，更优选疏水蛋白为 HFBII。
     本发明能够防止易氧化油类的降解，并且相应地优选实施例中油的碘值大于 60，更优选大于 90，还更优选大于 120，最优选大于 140。
     特殊的油特别适合用于本发明，相应地油优选选自橄榄油，玉米油，低芥酸菜籽油，大豆油，葵花籽油，亚麻籽油及其任意混合物。
     优选地，该水包油型乳液具有至少 20％，更优选至少 40％，最优选至少 80％的膨胀率。水包油型乳液优选具有最大 200％，更优选最大 150％，最优选 100％的膨胀率。优选地，该水包油型乳液具有至少 1v/v％，优选至少 2v/v％，更优选至少 5v/v％的油与水的比率。该水包油型乳液优选具有最大 90v/v％，更优选最大 50v/v％，更优选最大 25v/v％，最优选最大 10v/v％的油与水的比率。
     在第二方面，本发明提供了包含水包油型乳液的食品，该水包油型乳液包含疏水蛋白和油，其中该油相具有大于 40 的碘值，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 1v/v％。优选地，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 2v/v％，更优选至少 5v/v％。该水包油型乳液的油与水的比率为优选最大 90v/v％，更优选最大 50v/v％，再更优选最大 25v/v％，最优选最大 10v/v％。
     产品优选食品产品，更优选该食品选自调味料，冰激凌，蛋黄酱，涂抹酱和调味汁。
     发明详述
     实施例疏水蛋白
     所有试验均采用 VTT Biotechnology Finland 的 HFBII(Mw ＝ 7200g./mol-1) 溶液。除另有声明外，试验使用的所有水都是 Millipore 质量。
     油
     所有试验均使用纯化的葵花籽油 (SFO)。表 1 给出了使用的葵花籽油的组成和碘值。
     表 1- 葵花籽油的组成和碘值
     脂肪酸 C6 葵花籽油的组成 (％ ) 07102448312 A CN 102448335 C8 C10 C12 C14 C16 C16:1 C18 C18:1 C18:2 C18:3 C20 C20:1 C22 C22:1 C24说明0 0 0 0.1 5.5 0.1 4.7书6/8 页19.5 68.5 0.1 0.3 0.1 0.9 0 0.2 碘值＝ 135.8
     制备疏水蛋白 (HFB) 和乳清分离蛋白 (Whey Protein Isolate)(WPI) 溶液使用 0.1M 盐酸或 0.1MNaOH 制备 pH2、 pH3 和 pH7 的 pH 调节的双蒸馏水 (DDW)，然后将 HFB 或 WPI 加入各 pH 调节的 DDW 中至 0.2wt％的浓度，用 0.1M 盐酸或氢氧化钠调节具有每蛋白质的最终溶液的 pH 值至 pH2、 3 或 7。将 SFO 加入这些溶液中，按以下步骤均化。
     制备乳液
     根据表 2 的组分首先在 6500RMP 下经历 Ultraturrax 1 分钟，然后在 24000RPM 下进行 10 分钟，并连续晃动烧杯，然后为了不引入不必要的泡沫生成，小心地转移到微射流机 (MF)，并采用 MF 在 1000bar 下进行 5 分钟，并用冰来防止温度的升高。然后密封乳液瓶并在 80℃度下巴氏杀菌 10 分钟，然后让其冷却。
     表 2- 乳液组成
     8102448312 A CN 102448335说明书实施例 A 9.5g 0.5g7/8 页对比实施例 1 0.2％ HFB 溶液 0.2％ WPI 溶液葵花籽油
     9.5g 0.5g加速氧化实验
     如下提供了对对比实施例 1 和实施例 A 的 pH 2、 3 和 7 的乳液进行了加速氧化实验。加速氧化实验在 40℃下进行了总共 (over)42 天，因为时间和温度典型地在 20℃的温度下进行 9 到 12 个月。加速氧化实验通过测量氧化导致的挥发性成分来评估氧化反应进程，并按如下进行：
     1、 1ml 等份试样的对比实施例 1 和实施例 A 分别装入单独的小瓶 (vial)
     2、用氮气吹出在小瓶顶部的空间的空气
     3、用带橡胶隔片的盖密封小瓶
     4、所有小瓶在 40℃无光的条件下放置在培育箱中 42 天。
     5、 42 天实验期后，从培育箱中取出小瓶，并在无光的情况下冷却，使己醛溶解回到乳液中。冷却后，小瓶的顶部空间再次用氮气吹洗。
     6、采用气相色谱法 (GC) 进行检测挥发性成分。在 GC 期间，小瓶加热到 60℃以将挥发性成分从该乳液中释放到该顶部空间，随后用 GC 测量。用 GS 检测到的挥发性成分的含量用谱图中计算的峰值面积表示。在各种挥发物中，己醛是氧化反应最常见的代表，因此结果只呈现己醛。
     在 40℃下氧化实验 42 天的结果见表 3-5，表明 HFB 稳定的乳液与 WPI 稳定的乳液相比，氧化程度较低。
     表 3-pH2 乳液加速氧化实验 42 天后的结果
     峰面积 (uV/s) 对比实施例 1 实施例 A
     峰面积 (uV/s) 对比实施例 1 实施例 A
     9 2700784 153887 2890470 81778表 4-pH3 乳液加速氧化实验 42 天后的结果表 5-pH 7 乳液加速氧化实验 42 天后的结果102448312 A CN 102448335说明书峰面积 (uV/s)8/8 页对比实施例 1 实施例 A2549786 188375910

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1、(10)申请公布号 CN 102448312 A (43)申请公布日 2012.05.09 CN 102448312 A *CN102448312A* (21)申请号 201080023606.7 (22)申请日 2010.05.18 09161584.9 2009.05.29 EP A23D 7/005(2006.01) C11B 5/00(2006.01) (71)申请人荷兰联合利华有限公司地址荷兰鹿特丹 (72)发明人 AR科克斯 H-J金 (74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司 72001 代理人李连涛林森 (54) 发明名称水包油型乳液 (57) 摘要本发。

2、明提供了包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油相的碘值大于 40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升。同时还提供了包含这种水包油型乳液的产品。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.11.28 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/056786 2010.05.18 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/136354 EN 2010.12.02 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 8 页 CN 102448335 A。

3、1/1 页 2 1. 包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油相的碘值大于 40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于30克/升并低于140克/升，该水包油型乳液具有至少1v/v的油与水的比率。 2.根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该疏水蛋白为第I类或第II类疏水蛋白，优选第 II 类疏水蛋白，更优选 HFBII。 3. 根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该油的碘值大于 60，优选大于 90，更优选大于 120，最优选大于 140。 4. 根据前述任一权利要求所述的水包油型乳液，其中该油选自橄榄油，玉米油，低芥酸菜籽油，大豆油，葵花籽。

4、油，亚麻籽油及其任意混合物。 5. 根据权利要求 1 所述的水包油型乳液，其中该疏水蛋白与油的比率大于 40 克 / 升，优选大于60克/升，更优选大于60克/升，且其中该疏水蛋白与油的比率低于130克/升，优选低于 120 克 / 升，更优选低于 100 克 / 升。 6. 包含疏水蛋白和油的水包油型乳液的食品，其中该油相的碘值大于 40，其特征在于，该疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于 140 克 / 升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 1v/v。权利要求书 CN 102448312 A CN 102448335 A1/8 页 3 水包油。

5、型乳液技术领域 0001 本发明涉及水包油型 (O/W) 乳液。特别是，本发明涉及抗氧化的水包油型乳液。背景技术 0002 种类繁多的消费品包含有水包油型乳液，包括化妆品制剂 ( 例如护肤霜，润肤剂，化妆水 (lotion)，头发和皮肤调理剂 ) 和食品 ( 例如调料 (dressing)，冰激凌，蛋黄酱，涂抹酱 (spread) 及调味汁 )。要确保消费者对这类产品的接受度，关键在于乳液的物理化学性质，另外，乳液及其中成分的稳定性对确保此类产品的保质期是至关重要的。 0003 有许多机制会降低包含水包油型乳液产品的品质。絮凝是由于乳液中的颗粒聚集在一起，然。

6、后可能漂浮到连续相的顶部或沉淀到连续相的底部的过程。乳液分层是在浮力的作用下乳液中的物质迁移至样品的顶部，同时该物质的颗粒保持分离。破乳和凝聚是其中颗粒凝聚并在连续相中形成层。不稳定的乳液特别容易受到这些机制的影响，并且遭受乳液的物理化学结构中的破坏和失去消费者所需的有益特性。油的降解可进一步影响包含水包油型乳液产品的质量。氧化就是这样一个可造成降解并导致酸败和损失重要功能成分的过程。欧洲专利申请 EP1978824 公开了充气组合物，其具有至少 10膨胀率并包含水和乳化脂肪相，其中所述组合物中包括疏水蛋白。 EP1978824的实施例1-4包括因其极易氧化而臭名昭著。

7、的橄榄油。因此仍然需要具有改进的保质期的能抗其中的油氧化的水包油型乳液。 0004 测试和定义 0005 除非另有定义，此处使用的所有技术术语与本领域普通技术人员 ( 如胶体化学 ) 通常理解的含义相同。 0006 油 0007 此处用到的术语 “油” 是类脂 (lipids)，脂肪，或其任意混合物的通称，纯的或在溶液中含有化合物。油类也可包括悬浮液中的颗粒。 0008 类脂 0009 此处用到的术语 “类脂” 是作为长链脂肪酸或长链醇的通称，其中术语 “长链” 作为 12 或更多个碳原子的通称。 0010 脂肪 0011 此处用到的术语 “脂肪” 是作为含多于 80的甘油三。

8、酯的化合物的通称使用。它还可含有甘油，单酸甘油脂和游离脂肪酸。通俗地说，液体脂肪通常是指油类，但是此处的术语脂肪也作为此液体脂肪的通称。脂肪包括：植物油 ( 例如：杏仁油，花生油，山菊油，摩洛哥坚果油，鳄梨油，巴巴苏仁油，木棉油，黑籽油 (black seed oil)，黑莓籽油，黑加仑籽油，蓝莓籽油，琉璃苣油，金盏花油，亚麻籽油 (Camelina Oill)，油茶籽油 (Camellia Seed Oil)，蓖麻油，樱桃仁油，可可脂，椰子油，玉米油，棉籽油，月见草油，葡萄柚油，葡萄籽油，榛子油，大麻籽油，荷荷巴油，。

9、柠檬籽油，青柠檬籽油 (lime seed oil)，亚麻籽油，奇异果油，澳洲坚果油，玉米油，芒果脂，白芒花籽油，哈密瓜籽油，辣木油，橄榄油，橙籽油，棕榈说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A2/8 页 4 油，木瓜籽油，西番莲籽油，桃仁油，李子油，石榴籽油，罂粟籽油，南瓜籽油，油菜籽 ( 或低芥酸菜籽 ) 油，红树莓籽油，米糠油，玫瑰果油，红花油，沙棘油，芝麻油，大豆油，草莓籽油，葵花籽油，甜杏仁油，核桃油，小麦胚芽油 ) ；鱼油 ( 例如：沙丁鱼油，鲭鱼油，鲱鱼油，鱼肝油，。

10、蚝油 ) ；动物油 ( 例如：共轭亚油酸 ) ；或其他油类 ( 例如：石蜡油，环烷油，芳香油，硅油 ) ；或其任意的混合物。 0012 碘值 0013 此处用到的术语 “碘值” 是作为衡量油不饱和度的通称，并表示为每克样品吸收的碘的厘克数 (被吸收的碘 )。碘的厘克数越高，代表油中不饱和双键越多，因此油更倾向于通过双键氧化。根据 American Oil Chemists Societ(AOCS) 官方方法 Tg 1a-64，第 1 到 2 页， American Oil Chemists Society 的官方方法和推荐试验，第二版， D.Fireston。

11、e 编辑， AOCS 出版， Champaign， 1990， 1990 年修订的方法中提供的 Wijs 方法确定碘值。 0014 疏水蛋白与油的比率计算 0015 此处用到的术语 “疏水蛋白与油的比率” 定义为水包油型乳液中疏水蛋白的质量 ( 克 ) 比油的体积 ( 升 )。因此，疏水蛋白与油的比率表示为： 0016 乳液中疏水蛋白的总质量 ( 克 ) ：乳液中油的总体积 ( 升 ) 克 / 升 0017 油与水的比率计算 0018 此处用到的术语 “油与水的比率” 定义为油的体积 ( 毫升 ) 比水包油型乳液中水的体积 ( 毫升 )。因此，油与水的比率表示为： 0019 ( 乳。

12、液中油的总体积 ( 毫升 )/ 乳液中水的总体积 ( 毫升 )100 v/v 0020 水包油型乳液 0021 此处用到的 “水包油型乳液” 是作为互不相溶两相的混合物的通称，其中油 ( 分散相 ) 分散在水溶液中 ( 连续相 )。 0022 食品 0023 此处用到的术语 “食品” 是作为入口的产品和成分的通称，其组分在胃肠道中是有活性的和 / 或被胃肠道吸收，来获取与人体及其组织的营养，恢复精力和满足嗜好，这些产品将被销售并销卖给顾客，以供人们消费。食品的例子是茶，包括其前体；涂抹酱；冰激凌；冷冻水果和蔬菜；零食，包括减肥食品和饮料；辛辣料 (c。

13、ondiment)，调味料，和烹饪助剂 (culinary aid)。食品可尤其带来以下任意种好处：健康的新陈代谢，延长寿命，最佳的成长和发展，最佳的胃肠道功能，避免代谢综合征和抗胰岛素性，避免血脂异常，体重控制；健康的矿物质代谢，免疫健康，最佳的视力健康，避免认知障碍和记忆力减退，头发和皮肤的健康，美容，以及良好的味觉和嗅觉。 0024 涂抹酱 0025 此处用到的术语 “涂抹酱” 是作为含油和水的乳液的通称，例如，人造黄油型涂抹酱。有利地涂抹酱的 pH 为 4.8-6.0。可通过将涂抹酱熔化，从水相中分离熔化的脂肪相并测定水相中的 pH 。

14、值来测定其 pH 值。 0026 本发明中的涂抹酱可包括涂抹酱常用的其他成分，例如调味成分，增稠剂，胶凝剂，着色剂，维生素，乳化剂， pH 值调节剂，稳定剂等。对本领域技术人员来说，采用这些成分的普通添加量以及制备人造黄油或涂抹酱的适宜的方法是众所周知的。 0027 调味料说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A3/8 页 5 0028 此处用到的术语 “调味料”是作为含油和水的乳液的通称，例如醋油沙司 (vinaigrette) 和色拉调味料类型的组成物。 0029 充气 0030 术语 “充气” 是指例如通过机械手段有意地将气体加入产品。

15、中。气体可以是任何气体，但优选，特别是在食品背景下，食品级气体例如空气，氮气或二氧化碳气体。充气的程度通常定义为术语 “膨胀率 (overrun)” 。在本发明中，膨胀率是定义为体积术语： 0031 膨胀率 ( 最终充气产品的体积 - 混合物的体积 )/ 混合物的体积 )X 100 0032 产品中的膨胀率值有所不同，取决于所需产品的特性。例如，糕点例如慕斯 (mousses) 中的膨胀度可高达 200 至 250。一些速冻产品，室温产品和热产品中的膨胀度可以较低，但基本高于 10，例如奶昔中的膨胀度通常是从 10到 40。 0033 疏水蛋白 0034 疏水蛋白是。

16、明确定义的蛋白质种类 (Wessels， 1997， Adv.Microb.Physio.38 ： 1-45 ； Wosten， 2001， Annu Rev.Microbiol.55 ： 625-646)，在疏水 / 亲水界面上可自组装 (self-assembly)，并具有保守序列 (conserved sequence) ： 0035 Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm( 序列 1)，其中 X 代表任意的氨基酸， n 和 m 独立代表整数。通常，疏水蛋白长度可达 125 个氨基酸。保守序列上的半胱氨酸残基 (C。

17、) 是二硫桥 (disulphide bridge) 的一部分。在本发明中，术语疏水蛋白具有更广泛的含义，以包括在疏水 - 亲水界面处仍然表现为自组装的特性，导致形成蛋白质膜的功能相当的蛋白质，例如含如下序列的蛋白质： 0036 Xn-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm( 序列 2) 或其中一部分在疏水 - 亲水界面处仍然表现为自组装的特性，导致形成蛋白质膜。根据本发明的定义，可通过如下方法检测自组装：将蛋白质吸附到聚四氟乙烯和利用圆二色性建立二级结构 (secondary str。

18、ucture)( 通常是 - 螺旋 )(De Vocht et al.， 1998， Biophys.J.74 ： 2059-68)。 0037 可通过在蛋白质溶液中培育聚四氟乙烯片，随后用水或缓冲液至少洗涤三次的方法 (Wosten et al.， 1994， Embo.J.13 ： 5848-54) 确定膜的形成。该蛋白质膜可以以任何适当的方法目测，例如以本领域常用的荧光标记或使用荧光抗体标记。m 和 n 值通常范围在 0 到 2000，但更通常 m 和 n 之和小于 100 或 200。疏水蛋白在本发明中的定义中包括疏水蛋白与另外的多肽以及疏水蛋白和其他分子例如多糖的共轭物形。

19、成的融合蛋白。 0038 目前确定的疏水蛋白通常分类为第 I 类或第 II 类。这两种类型已确定为真菌中的分泌性蛋白质 (in fungi as secreted protein)，其在两亲薄膜的疏水界面处自组装。第 I 类疏水蛋白的聚集物相对难溶 (insoluble)，而第 II 类疏水蛋白的聚集物易溶于多种溶剂。 0039 疏水蛋白类蛋白质也可在丝状菌，例如放线菌和链霉菌属中鉴定出来 (WO01/74864)。这些细菌蛋白质与真菌疏水蛋白相比，只形成一个二硫桥，因为他们只有两个半胱氨酸残基。这些蛋白是与具有序列 1 和 2 所示的同源序列的疏水蛋白属于功能性等价物的。

20、例子，并也在本发明的范围之内。 0040 可以通过使用任何适当的工法对天然资源例如丝状真菌进行提取，从而获得疏水蛋白。例如，通过培养能够将疏水蛋白分泌到培养基中的丝状真菌，或者通过使用 60乙说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A4/8 页 6 醇从真菌菌丝体提取，可以获得疏水蛋白。尤其优选从天然分泌疏水蛋白的宿主有机体中分离疏水蛋白。优选的宿主为丝孢菌类 ( 例如，木霉属 )、担子菌类、子囊菌类。特别优选的宿主是食品级有机体，例如分泌名为 cryparin 的疏水蛋白的栗疫病菌 (Cryphonectria parasitica)(M。

21、acCabe and Van Alfen， 1999， App.Environ.Microbiol 65 ： 5431-5435)。 0041 另外，可利用基因重组技术获取疏水蛋白。例如宿主细胞，典型的微生物，可经改性来表达疏水蛋白，然后可将该疏水蛋白分离，并相应用于本发明。将编码疏水蛋白的核酸结构引入到宿主细胞的技术在本领域是公知的。编码疏水蛋白的超过 34 个基因已由多于 16 种的真菌种属中克隆出来 ( 参见例如 WO96/41882，其确定了双孢菇 (Agaricus bisporus) 中的疏水蛋白序列， Wosten， 2001， Annu Rev.Microbi。

22、ol.55 ： 625-646)。重组技术也可用来修饰疏水蛋白序列或合成新的具有期望的 / 改进特性的疏水蛋白。 0042 通常情况下，通过编码所需疏水蛋白的核酸结构来转化适当的宿主细胞或有机体。编码多肽的核苷酸序列可插入编码转录和翻译所必需元件的合适的表达载体，并以使得它们将在适当的条件下表达 ( 如在恰当的定位和正确的读码框及适当的目标和表达序列 ) 的方式。对本领域技术人员来说，构建这些表达载体所需的方法是公知的。 0043 许多表达系统可用来表达多肽编码序列。这些包括但不限于，细菌，真菌 ( 包括酵母 )，昆虫细胞系统，植物细胞培养系统和所有由适当的表达载体转化。

23、 (transformed) 的植物。优选的宿主是被认为是食品级 - 基本认为安全的 (GRAS) 的那些。 0044 合适的真菌种类，包括酵母，例如(但不限于)那些酵母属，克鲁维酵母菌属，毕赤酵母菌 (Pichia)，汉逊酵母属 (Hansenula)，假丝酵母属 (Candida)，裂殖酵母属 (Schizo) 及其类似物，和丝状种类，如 ( 但不限于 ) 那些曲霉属真菌，木霉属，毛霉属，脉孢菌属 (Neurospora)，镰孢菌属 (Fusarium) 及其类似物。 0045 编码疏水蛋白的序列优选与在自然中确定的疏水蛋白在氨基酸水平上至少 80 相同，更。

24、优选至少 95或 100相同。然而，本领域技术人员可制造保守的替代品，或其它氨基酸改变却不降低疏水蛋白的生物活性。为了本发明的目标，这些与天然存在的疏水蛋白拥有高度等同性的疏水蛋白也包括在 “疏水蛋白” 术语中。 0046 可从培养基或细胞提取物中纯化疏水蛋白，例如， WO01/57076 中描述的步骤，其包括将存在于含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白吸附至表面，然后将该表面与表面活性剂例如吐温 20 接触，以从该表面洗脱该疏水蛋白。另见 Collen 等， 2002， Biochim Biophys Acta.1569 ： 139-50 ； Calonje 等， 2002，。

25、Can.J.Microbiol.48 ： 1030-4 ； Askolin 等， 2001， Appl Microbiol Biotechnol.57 ： 124-30 ； and De Vries 等， 1999， Eur J Biochem 262 ： 377-85。 0047 保质期 0048 此处用到的术语 “保质期” 是消费产品，例如被认为适于销售或消费的食品的时间长度的通称。特别是，保质期是产品可被储藏的时间，在此期间在预期的(或特定的)配送、储藏及陈列条件下，规定比例的货物的限定质量保持合格。在本案中，保质期是指水包油型乳液维持对于确保消费者接受这些产品的重要。

26、理化特性的时间长度。 0049 发明简述 0050 现在，我们已经发现，抗氧化的水包油型乳剂可以包含一定量的疏水蛋白和油的配制剂获得。说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A5/8 页 7 0051 因此，在第一方面，本发明提供了包含疏水蛋白和油的水包油型乳液，其中该油的碘值大于40，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于30克/升并低于140克/升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少1v/v。对水包油型乳液的稳定化和防止其降解进行了大量的研究，我们发现该疏水蛋白与油的比率的优点在于，在这种乳液中，该分散相中的油的氧化被显著降低。因。

27、此，疏水蛋白与水的比率优选大于 35 克 / 升，更优选大于 40 克 / 升，在更优选大于 60 克 / 升，和最优选 80 克 / 升。疏水蛋白的总用量优选低于 130 克 / 升，更优选低于 120 克 / 升，再更优选低于 100 克 / 升。 0052 正如上文所述，疏水蛋白可以是第 I 类或第 II 类疏水蛋白，优选第 II 类疏水蛋白，更优选疏水蛋白为 HFBII。 0053 本发明能够防止易氧化油类的降解，并且相应地优选实施例中油的碘值大于 60，更优选大于 90，还更优选大于 120，最优选大于 140。 0054 特殊的油特别适合用于本发明，。

28、相应地油优选选自橄榄油，玉米油，低芥酸菜籽油，大豆油，葵花籽油，亚麻籽油及其任意混合物。 0055 优选地，该水包油型乳液具有至少 20，更优选至少 40，最优选至少 80的膨胀率。水包油型乳液优选具有最大 200，更优选最大 150，最优选 100的膨胀率。 0056 优选地，该水包油型乳液具有至少 1v/v，优选至少 2v/v，更优选至少 5v/v 的油与水的比率。该水包油型乳液优选具有最大 90v/v，更优选最大 50v/v，更优选最大 25v/v，最优选最大 10v/v的油与水的比率。 0057 在第二方面，本发明提供了包含水包油型乳液的食品，。

29、该水包油型乳液包含疏水蛋白和油，其中该油相具有大于 40 的碘值，其特征在于，疏水蛋白与油的比率大于 30 克 / 升并低于140克/升，该水包油型乳液的油与水的比率为至少1v/v。优选地，该水包油型乳液的油与水的比率为至少 2v/v，更优选至少 5v/v。该水包油型乳液的油与水的比率为优选最大 90v/v，更优选最大 50v/v，再更优选最大 25v/v，最优选最大 10v/v。 0058 产品优选食品产品，更优选该食品选自调味料，冰激凌，蛋黄酱，涂抹酱和调味汁。 0059 发明详述实施例 0060 疏水蛋白 0061 所有试验均采用 VTT Biote。

30、chnology Finland 的 HFBII(Mw 7200g./mol-1) 溶液。除另有声明外，试验使用的所有水都是 Millipore 质量。 0062 油 0063 所有试验均使用纯化的葵花籽油 (SFO)。表 1 给出了使用的葵花籽油的组成和碘值。 0064 表 1- 葵花籽油的组成和碘值 0065 脂肪酸葵花籽油的组成 ( ) C6 0 说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A6/8 页 8 C8 0 C10 0 C12 0 C14 0.1 C16 5.5 C16:1 0.1 C18 4.7 C18:1 19.5 C18:2 68.5 C1。

31、8:3 0.1 C20 0.3 C20:1 0.1 C22 0.9 C22:1 0 C24 0.2 碘值 135.8 0066 制备疏水蛋白 (HFB) 和乳清分离蛋白 (Whey Protein Isolate)(WPI) 溶液 0067 使用 0.1M 盐酸或 0.1MNaOH 制备 pH2、 pH3 和 pH7 的 pH 调节的双蒸馏水 (DDW)，然后将 HFB 或 WPI 加入各 pH 调节的 DDW 中至 0.2wt的浓度，用 0.1M 盐酸或氢氧化钠调节具有每蛋白质的最终溶液的 pH 值至 pH2、 3 或 7。将 SFO 加入这些溶液中，按以下步骤均化。 0068 制。

32、备乳液 0069 根据表 2 的组分首先在 6500RMP 下经历 Ultraturrax 1 分钟，然后在 24000RPM 下进行 10 分钟，并连续晃动烧杯，然后为了不引入不必要的泡沫生成，小心地转移到微射流机 (MF)，并采用 MF 在 1000bar 下进行 5 分钟，并用冰来防止温度的升高。然后密封乳液瓶并在 80度下巴氏杀菌 10 分钟，然后让其冷却。 0070 表 2- 乳液组成 0071 说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A7/8 页 9 对比实施例 1 实施例 A 0.2 HFB 溶液 - 9.5g 0.2 WPI 溶液。

33、 9.5g - 葵花籽油 0.5g 0.5g 0072 加速氧化实验 0073 如下提供了对对比实施例 1 和实施例 A 的 pH 2、 3 和 7 的乳液进行了加速氧化实验。加速氧化实验在 40下进行了总共 (over)42 天，因为时间和温度典型地在 20的温度下进行 9 到 12 个月。加速氧化实验通过测量氧化导致的挥发性成分来评估氧化反应进程，并按如下进行： 0074 1、 1ml 等份试样的对比实施例 1 和实施例 A 分别装入单独的小瓶 (vial) 0075 2、用氮气吹出在小瓶顶部的空间的空气 0076 3、用带橡胶隔片的盖密封小瓶 0077 4、所有小瓶在。

34、40无光的条件下放置在培育箱中 42 天。 0078 5、 42 天实验期后，从培育箱中取出小瓶，并在无光的情况下冷却，使己醛溶解回到乳液中。冷却后，小瓶的顶部空间再次用氮气吹洗。 0079 6、采用气相色谱法 (GC) 进行检测挥发性成分。在 GC 期间，小瓶加热到 60以将挥发性成分从该乳液中释放到该顶部空间，随后用 GC 测量。用 GS 检测到的挥发性成分的含量用谱图中计算的峰值面积表示。在各种挥发物中，己醛是氧化反应最常见的代表，因此结果只呈现己醛。 0080 在 40下氧化实验 42 天的结果见表 3-5，表明 HFB 稳定的乳液与 WPI 稳定的乳液。

35、相比，氧化程度较低。 0081 表 3-pH2 乳液加速氧化实验 42 天后的结果 0082 峰面积 (uV/s) 对比实施例 1 2890470 实施例 A 81778 0083 表 4-pH3 乳液加速氧化实验 42 天后的结果 0084 峰面积 (uV/s) 对比实施例 1 2700784 实施例 A 153887 0085 表 5-pH 7 乳液加速氧化实验 42 天后的结果 0086 说明书 CN 102448312 A CN 102448335 A8/8 页 10 峰面积 (uV/s) 对比实施例 1 2549786 实施例 A 1883759 说明书 CN 102448312 A 。

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