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1、(10)申请公布号 CN 102416017 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102416017 A *CN102416017A* (21)申请号 201010292782.2 (22)申请日 2010.09.27 A61K 31/575(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (71)申请人 包海鹰 地址 130118 吉林省长春市新城大街 2888 号吉林农业大学家属区 38 栋 104 (72)发明人 包海鹰 贾力耕 (54) 发明名。
2、称 药用层孔菌中三种单体化合物的抗肿瘤活性 及其在医药中的应用 (57) 摘要 药用层孔菌中三种单体化合物的抗肿瘤活性 及其在医药中的应用， 本发明涉及三个从药用层 孔菌中分离得到的单体化合物的抗肿瘤活性， 研 究表明这二个化合物对 H22荷瘤具有较好的抑制 作用， 对人肝瘤细胞 SMMC-7721 和人乳腺癌细胞 MCF-710 具有较好的杀伤作用。属于中药有效成 分提取制备及其在医药和保健品领域的应用。本 发明还提供了这三种化合物的药物制剂剂型。这 三个化合物可用于预防治疗肿瘤及其功能性保健 品的应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权。
3、利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 102416025 A1/1 页 2 1.3- 酮基 - 去氢硫色多孔菌酸， 3， 5- 二羟基 -8， 24- 羊毛甾二烯 -21- 酸， 齿孔酸 在制备预防治疗癌症药物中的用途及其相关的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的药物， 其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂 型。 权 利 要 求 书 CN 102416017 A CN 102416025 A1/6 页 3 药用层孔菌中三种单体化合物的抗肿瘤活性及其在医药中 的应用 技术领域 ： 0001 本发明公开了药用层孔菌中三种单体化合物的抗肿瘤活性， 研究表明这三个化合 物对 H22荷瘤具。
4、有较好的抑制作用及其对人肝癌细胞 SMMC-7721 和人乳腺癌细胞 MCF-710 均有较好的杀伤作用。属于中药有效成分提取制备及其在医药和保健品领域中的应用。 背景技术 ： 0002 癌症， 亦称恶性肿瘤。20 世纪 70 年代以后， 癌症的发病人数以每年 3 -5的速 度递增。癌症严重危害人类健康， 已成为仅次于心血管病的人类第二杀手。据不完全统计， 我国每年新增癌症患者 180 万， 死亡 140 万， 平均每分钟就有 1.3 人死于癌症。癌症的发生 与环境的改变有着密切的关系， 其给人类造成的危害主要是细胞恶性增殖造成机体重要生 命活动器官的毁损和肿瘤的广泛扩散转移而导致病人死亡。 。
5、目前治疗癌症多为药物与化疗 相结合的方法， 而该方法多具毒副作用。从天然动、 植物中寻找低毒、 高效的抗癌活性成分 是近年来国内外癌症防治研究的热点之一。 美国、 欧洲、 日本及我国相继开展了从天然可食 植物或中药中筛检抗癌物的研究。真菌作为自然界中的一大类群， 以其毒副作用小和显著 的抗肿瘤、 增强免疫等功效， 被国内外学者所重视。 0003 真菌中的三萜类物质具有抑制肿瘤细胞生长、 止痛、 镇静、 抗过敏、 消炎、 解毒、 护 肝、 降血压、 降血脂等功效。并且该类化合物可以通过发酵的方法大量富集。关于这三种单 体的抗肿瘤活性及其应用的研究却至今未见详细报道。 发明内容 ： 0004 本发。
6、明公开了药用层孔菌中三种单体化合物的体内外抗肿瘤活性， 这三种化合物 能够明显地改善机体免疫功能和杀伤癌细胞。 0005 按药剂学方法， 可以将本发明药用层孔菌中三种单体化合物制成多种临床药物剂 型作为治疗肿瘤的药物， 所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型 0006 本发明的药物组合物含有疗效有效量的这三种单体为活性成分， 以及含有一种或 多种药学上可以接受的载体。 0007 上述的载体是指药学领域常规的药物载体， 包括稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 黏合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体。 0008 本发明可以组合物的形式通过口服、 静脉、 肌肉注射或胃肠外给药方。
7、式施用于这 种治疗的患者。 按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、 颗粒剂、 冲剂、 胶囊、 栓 剂、 喷雾剂、 缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物组合， 制成所需 剂型。 0009 本发明公开了这三种化合物化学名称及化学结构。其中化合物一为 3- 酮基 - 去 氢硫色多孔菌酸， 化合物二为 3， 5- 二羟基 -8， 24- 羊毛甾二烯 -21- 酸， 化合物三为齿 孔酸。其结构如下。 说 明 书 CN 102416017 A CN 102416025 A2/6 页 4 0010 0011 化合物 1 化合物 2 化合物 3 0012 下述的药理实验证实了这三种单。
8、体化合物具有治疗和预防肿瘤的药理活性。 0013 药用层孔菌中三种单体化合物抗肿瘤活性的检测 0014 摘要方法 ： 采用 MTT 法及 H22荷瘤小鼠模型检测这三种化合物体内外抗肿瘤活性。 结果 ： 体内结果表明化合物 1 当剂量为 6mg/kg/d 时， 抑瘤率最高可达到 68.58； 化合物 2 当剂量为 15mg/kg/day 时， 抑瘤率最高可达到 75.13； 化合物 3 剂量为 15mg/kg/day 时， 抑瘤率最高可达到 53.58。体外研究结果表明化合物 1 对人肝癌细胞 SMMC-7721 和人 乳腺癌细胞 MCF-710 均有较好的杀伤作用， 其细胞杀伤率最大分别为 8。
9、3.30和 73.31， 化合物 2 细胞杀伤率最大分别为 77.52和 79.29 ； 化合物 3 细胞杀伤率最大分别为 60.73和 49.58， 并能够明显地改善小鼠机体免疫功能。 0015 结论 ： 这三种单体化合物具有较好的抗肿瘤活性， 能够明显地改善机体免疫功能 和杀伤癌细胞。 0016 1 材料 0017 1.1 药物 ： 3- 酮基 - 去氢硫色多孔菌酸， 3， 5- 二羟基 -8， 24- 羊毛甾二 烯 -21- 酸及齿孔酸由本实验室分离得到 ； 注射用环磷酰胺 (CTX)， 5- 氟尿嘧啶 (5-Fu)， 购 于吉林省肿瘤医院。MTT(Amresco) ； DMSO( 北京。
10、化工厂 )。 0018 1.2 动物 ： 昆明小鼠 100 只， 雌性， 体重 18 22g。购自吉林大学基础医学动物中 心。 0019 1.3 仪器 ： 酶标仪 (Multiskan) ； 离心机 (SORVALL) ； 二氧化碳培养箱 (NAPCO 法 国 )。 0020 2 方法和结果 0021 2.1 方法 0022 2.1.1体内抗肿瘤方法 ： 动物购入后， 先饲养观察， 使其适应环境1周。 无菌条件下 取接种 7d 的腹水型荷瘤小鼠的腹水， 用生理盐水 1 3 稀释成细胞悬液， 以每鼠 0.1mL 接 种于小鼠左后肢腋窝皮下。然后随机分为 ： 正常对照组 ； 生理盐水模型对照组 ；。
11、 阳性对照药 环磷酰胺20mg/kg/d组 ； 阳性对照药5-Fu 20mg/kg/d组 ； 3-酮基-去氢硫色多孔菌酸3mg/ kg/d 和 6mg/kg/d 组， 3， 5- 二羟基 -8， 24- 羊毛甾二烯 -21- 酸 7.5mg/kg/d 和 15mg/kg/ d 组， 齿孔酸 7.5mg/kg/d 和 15mg/kg/d 组共 10 组， 每组 10 只。除第 1 组动物正常饲养， 作 为正常对照外 ； 环磷酰胺组及 5-Fu 组隔天腹腔注射给予环磷酰胺及 5-Fu， 三个单体化合物 组每天灌胃给药 ； 生理盐水对照组每天灌服生理盐水。 各组小鼠自由取食饮水。 每天观察小 鼠的状。
12、态， 连续 10d， 末次给药 24h 后， 称重， 每组随机选取 6 只小鼠摘眼球取血 0.5 1mL， 室温静置2h， 1000r/min离心20min， 取血清待测IL-2含量。 同时， 将取血后的小鼠处死， 完 整摘取瘤块、 胸腺和脾脏， 分别称重， 计算抑瘤率和器官免疫指数 ( 脾脏指数和胸腺指数 )。 说 明 书 CN 102416017 A CN 102416025 A3/6 页 5 0023 计算结果及统计 ： 肿瘤抑制率(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平 均瘤重 100。胸腺指数胸腺重 (mg)/ 体重 (g)， 脾脏指数脾脏重 (mg)/ 体重 (g)。 0024。
13、 IL-2 含量测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测， 操作步骤按照说明 进行。加入终止液后， 轻轻混合， 在酶标仪上 450nm 处读取吸收值 (OD)。依据标准品 OD 值， 采用 ELISA 标准曲线绘制软件作标准曲线， 依据标准曲线计算各样品的 IL-2 含量。 0025 实验数据用表示， 并采用SPSS18.0for Windows统计软件进行分析。 P0.05 说明在统计学上呈显著差异， P 0.01 说明在统计学上呈极显著差异。2.1.2 体外细胞毒 性实验方法 ： 采用MTT法， 实验步骤如下， 采用指数生长期的SMMC-7721和MCF-710细胞， 配 置。
14、成浓度为5104个/mL的细胞悬液， 每孔100L， 接种于96孔板， 37、 5饱和湿度培养 24h 后， 按设计浓度加受试药， 每孔加药量 100L， 每个剂量 4 个平行孔。再培养 72h 后， 加 入 MTT 每孔 20L， 继续培养 4h 后， 弃去上清， 每孔加 150LDMSO， 微量振荡器震荡 10min， 置酶标仪上 492nm 波长处测定吸光度。 0026 计算结果及统计 ： 抑制率 (OD阴性-OD受试药)/OD阴性100。OD 值以平均值 标 准差 () 来表示。并采用 SPSS 13.0for Windows 统计软件进行分析。P 0.05 说明 在统计学上呈显著差异。
15、， P 0.01 说明在统计学上呈极显著差异。 0027 2.2 结果 0028 2.2.1 体内抗肿瘤实验 0029 2.2.1.1 对 H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 0030 这三种化合物对 H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用结果如表 1 所示。从表中可知， 三化 合物对小鼠移植瘤的生长呈现较明显的抑制作用 (P 0.05)。当化合物 1 剂量为 6mg/kg/ d 时， 抑瘤率最大为 68.58 ； 当化合物 2 剂量为 15mg/kg/d 时， 抑瘤率最大为 75.13 ； 化 合物 3 剂量为 15mg/kg/d 时， 抑瘤率最大为 53.58。 0031 表 1 三种化合物对荷瘤小鼠肿瘤。
16、的影响 0032 Table 1Anti-tumor activity of three compounds in H22 mice 0033 0034 与对照组比 ： *P 0.05 ； *P 0.01。Compared with the control group， *P 说 明 书 CN 102416017 A CN 102416025 A4/6 页 6 0.05 ； *P 0 01。 0035 2.2.1.2 对 H22荷瘤小鼠免疫器官的影响 0036 三种化合物对 H22荷瘤小鼠免疫器官的影响结果如表 2 所示。从表中可知， 小鼠荷 瘤后脾脏指数及胸腺指数明显升高。三化合物作用后， 。
17、脾脏指数和胸腺指数呈不同程度变 化。 与正常饲养组相比， 三个化合物低剂量组的胸腺指数及脾脏指数不存在显著性差异， 高 剂量组除化合物 3 外， 其余都存在显著性差异 (P 0.05) ； 与生理盐水对照组相比， 三化合 物低剂量组的脾脏指数低于生理盐水组， 化合物 2 和化合物 3 低剂量组存在显著性差异 (P 0.05) ； 0037 表 2 三种化合物对荷瘤小鼠免疫器官的影响 0038 Table2Effects of three compounds on immune organ in H22 mice 0039 0040 注 ： 与对照组相比 ： P 0 05 ； P 0 01 ； 。
18、与正常组相比， *P 0.05 ；*P 0.01 ； Note Compared with the control group， P0.05 ；P0 01， Comparedwith the normal group， *P 0 05 ；*P 0 01， 0041 2.2.1.3 对 H22荷瘤小鼠血清中 IL-2 含量的影响 0042 三种化合物对 H22荷瘤小鼠血清中 IL-2 的影响结果如表 3 所示。从表中可知， 这 三种化合物作用后的荷瘤小鼠的血清中 IL-2 的含量明显升高。 0043 表 3 三种化合物对 H22荷瘤小鼠血清中 IL-2 的影响 0044 Table3 Effec。
19、ts of three compounds on content of IL-2in H22mice 0045 说 明 书 CN 102416017 A CN 102416025 A5/6 页 7 0046 0047 与正常组相比， #P 0 05 ；#P 0 01 ； Note Compared with the normal group， #P 0 05 ；#P 0.01 0048 2.2.2 体外对癌细胞增殖的抑制作用 0049 三种化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)和人乳腺癌细胞(MCF-710)的增殖的抑制 作用如表 4 所示。从表中可知， 这三种物质对 SMMC-7721 和。
20、 MCF-710 均呈现抑制作用， 且存 在一定的量效关系 ； 同对照组相比， 存在显著性差异 (P 0.05)。 0050 表 4 三种化合物对 SMMC-7721 和 MCF-710 细胞增殖抑制作用 0051 Table4Inhibitory Effects of three compounds to SMMC-7721and MCF-710 0052 说 明 书 CN 102416017 A CN 102416025 A6/6 页 8 0053 注 ： 与对照组相比 ： *P 0 05 ； *P 0 01。Note Compared with the control group， *P 0.05 ； *P 0 01. 0054 3 结论 0055 由以上结果可知， 这三种单体化合物能够抑制 H22荷瘤小鼠移植瘤的生长， 并且 能够改善小鼠机体的免疫功能 ； 此外， 这三种单体化合物还能够明显地抑制人肝癌细胞 (SMMC-7721) 和人乳腺癌细胞 (MCF-710) 的细胞增殖。 0056 上述实验结果表明， 3- 酮基 - 去氢硫色多孔菌酸， 3， 5- 二羟基 -8， 24- 羊毛甾 二烯 -21- 酸及齿孔酸对肿瘤具有预防治疗作用 ； 并且具有调节免疫功能。因此， 可用于预 防治疗肿瘤及其功能性保健品的应用。 说 明 书 CN 102416017 A 。