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金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法
    【技术领域】
     本发明涉及细胞生物学领域， 尤其涉及一种金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法。 背景技术 畜禽遗传资源保护问题最早于 50 年代在美国提出。自 1972 年斯德哥尔摩人类环 境会议以后， 引起联合国粮农组织 (FAO) 与环境规划署 (UNEP) 的重视， 他们联手在全球开 展了家养动物遗传资源的保护行动， 至今前后进行了几十年的工作， 取得了明显的成效。 我 国从开始就参加了他们组织的一系列计划与行动。 但目前中国的畜禽遗传资源保护形势并 不乐观。在 80 年代进行的普查中， 估计共有品种 600 个， 其中本国地方品种有 385 个。有 10 个地方品种已经灭绝， 8 个品种濒临灭绝。 20 个品种的有效群体含量急剧下降， 占调查品 种数 364 个的 13%。 又据中国农科院畜牧所与全国畜牧兽医总站种畜禽处在 2000 年完成的 “畜禽遗传资源多样性补充调查” 的资料称， 在调查的 17 个省区的 331 个品种中， 处于濒危 与将要灭绝的品种有 59 个， 占调查总数的 18% 另有 7 个品种已经灭绝， 例如云南的大普吉 猪， 浙江的萧山鸡、 文山鹅、 思茅鹅、 草海鹅等。
     我国畜禽遗传资源丰富， 它们在畜牧生产和新遗传资源形成过程中发挥了非常重 要的作用。近 2O 年来， 为满足人民对肉、 蛋、 奶、 蜜等畜产品的需求， 我国相继引进了大量的 外来高产品种对低产地方品种进行改良， 使畜牧生产水平大幅提高。但改良的消极后果使 某些地方品种逐渐被培育品种或杂交种所取代， 致使具有丰富多样性的地方品种群体数量 下降或消失。 最近研究表明， 50% 以上地方畜禽品种的群体数量处于不同程度的下降， 其中 一定数量处于濒危状态。国内外多年来对保种工作的实践与经验， 告诉我们要有效保护地 方优良的畜禽资源关键是要采用经济合理的方法， 即使得畜禽资源得到很好的保护又要节 约成本。这里应用细胞生物学方法建立畜禽的细胞系就是一个有效经济的方法。在建立细 胞系的过程中同时对词细胞的基本生物学特性进行研究， 为以后进一步的研究提供技术与 理论支持。
     金华猪是中国著名的地方品种。又称两头乌， 产于浙江东阳、 义乌、 金华等地。据 金华县古方出土的西晋 （公元 265-316 年） 陶猪和陶猪圈考证， 早在 1600 年前这一带的养猪 业已相当发达。相传在古代就有 “家乡肉” 的腌制品， 尔后演变成火腿。随着火腿远销， 金 华猪也随之扬名。金华猪体型中等， 耳下垂， 颈短 粗， 背微凹， 臀倾斜 、 蹄质坚实。全身被 毛中间白， 头颈、 臀尾黑。以早熟易肥 、 皮薄骨细、 肉质优良、 适于腌制火腿著称。7 ～ 8 月 龄、 体重 70 ～ 75 千克时为屠宰适期， 胴体瘦肉率 40％～ 45％。目前， 由于外来猪种的大量 引进和一些社会因素的干扰使得金华猪的种群数量持续减少， 肉品质持续下降， 应该采取 有效措施加强金华猪的保种。
     细胞生物学研究一直都很受人们的重视， 随着科学研究的发展， 人们对细胞的研 究也越来越深入， 细胞生物学的发展为其它生命科学的发展提供了研究基础， 也可以说细 胞生物学是其它生命学科发展的前提。 这也从另一个侧面反映出畜禽资源细胞保存的重要
     性。这些种质资源一旦失去就无法再进行研究与应用， 所以很多国家目前都致力于种质资 源的保存。我国保护物种多样性方面也面临着许多问题需要解决。
     哺乳动物核移植技术的发展也日趋完善， 细胞核移植技术是将供体细胞核移入出 去核的卵母细胞中， 使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、 分裂并发 育成新个体， 使得核供体的基因得到完全复制。它在动物育种、 制备转基因动物、 基因治疗 及器官移植等方面具有重大的作用， 而成纤维细胞是核移植中的一种理想的供体细胞。金 华猪作为一个优良的地方猪种， 它在育种方面具有巨大的潜力， 而且猪也是一种人类器官 的比较优良的提供者， 因而金华猪成纤维细胞的建系具有重要的科研与生产价值。 发明内容
     本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种金华猪成纤维细胞系的建立及其 培养方法。
     为实现上述目的， 本发明采取以下技术方案 ： 金华猪成纤维细胞系的培养方法的步骤如下 ： 1） 初代培养 ： 快速从怀孕母猪子宫中取出 40 日龄的胚胎， 用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次 ； 用眼科剪和眼科镊分离背最长肌， 再用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次， 然后剪成 0.5~1.0mm3 的组 织块 ； 将组织块移入培养瓶并涂布均匀， 倒置培养瓶， 放入 37~39℃， 体积百分数为 5%CO2 的 培养箱中培养 3~4h ； 组织块完全贴壁后加入 10ml 的培养液， 培养液成分 ： DMEM+10% 胎牛血 清继续培养 8~12 个小时 ； 2） 传代培养 ： 倒出步骤 1) 过程中的培养液， 六用 PBS 清洗 2~3 次后， 用胰蛋白酶消化 后加入 10~15ml 的培养液终止消化 ； 消化后的细胞平均分成三瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养 箱中培养至冻存前 24~28h ； 3) 细胞冻存 ： （1） 准备冻存前 24~26h 弃除原有培养液并更换新的培养液 10~15ml， 继续培养 24~26h; （2） 倒出培养瓶中的培养液， 用 PBS 清洗 2~3 次后， 用胰蛋白酶消化后加入 10~15ml 的 培养液终止消化 ； （3） 用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数 ； （4） 1000rpm 离心细胞 5min， 去上清， 加入 1~1.5ml 的冻存液， 轻轻的吹打细胞使其悬 浮 ; 细胞冻存液成分 ： 体积百分数为 50% 胎牛血清、 体积百分数为 40%DMEM 及体积百分数为 10%DMSO ； （5） 把细胞移到冻存管中， 用封口膜封口 ； （6）将装有细胞的冻存管转移到 4 ℃冰箱中放置 1~2h， 然后转入 -20 ℃冰箱中放置 2~3h， 再移入到 -70℃的冰箱中过夜， 最后快速将其移入到液氮中长期保存， 并做好相应的 记录。
     所述的胰酶消化的步骤为 ： 向培养瓶中加入 37~39 ℃预热的质量百分数为 2% 的 胰蛋白酶 1.5~2ml， 在显微镜下观察体积百分数为 90~95% 的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒 掉， 用手轻磕细胞培养瓶使细胞脱落， 加入 10~15ml 新的培养液。
     所述的冻存细胞进行复苏步骤为 ： 将冻存管从液氮中取出后放入 37~39 ℃水浴 中， 晃动 1~2min 后， 把细胞移入到加入了 10~15ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min后去上清， 加入 2ml 的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶， 放置 于 37℃， 5%CO2 的培养箱中培养。
     本发明对于贴壁培养方法及培养基培养液成分的改进调整， 本发明培养得到的成 纤维细胞系不含上皮细胞等杂细胞， 细胞纯度高 ； 冻存细胞质量稳定， 细胞冻存复苏后活率 可达 91.8~97.5%， 传代后细胞生长稳定， 适合大规模培养。 对于培养基及培养方法的改进可 以大幅度的降低培养成本。 本发明涉及的金华猪成纤维细胞可以用于制作转基因猪的核移 植供体 ； 可以为医学及分子生物学研究提供原材料 ； 可以作为疫苗生产的主要原料及肝细 胞培养的饲养层。 农业上可以丰富和改良地方猪种， 是我国地方优良猪种的有效保护手段。
     由于金华猪种质资源匮乏， 使得对于金华猪在各个领域内的研究成为空白。而本 发明所述的高细胞活率及高纯度的金华猪成纤维细胞系可以为以后的研究提供材料， 为以 后的科学研究提供便利。 附图说明
     图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图图 1 为金华猪原代成纤维细胞显微镜下图 ； 2 为金华猪传代前细胞显微镜下图 ； 3 为金华猪继代 I 细胞显微镜下图 ； 4 为金华猪继代 II 细胞显微镜下图 ； 5(a) 为被大肠杆菌污染的细胞图 ； 5(b) 为被霉菌污染的细胞图 ； 6(a) 为支原体污染阳性的细胞对照图 ； 6(b) 为支原体污染阴性的细胞对照图 ； 7 为金华猪成纤维细胞的生长曲线图 ； 8 为金华猪成纤维细胞的核型分析图 ； 9 图中左图为苹果酸脱氢同工酶电泳图， 右图为乳酸脱氢同工酶电泳图 ； 10 为外源基因在金华猪成纤维细胞中 24h 表达图 （pEGFP-N3 荧光蛋白转染质粒 ) ； 11 为金华猪成纤维细胞复苏后细胞凋亡的检测。具体实施方式
     金华猪成纤维细胞系的培养方法的步骤如下 ： 1） 初代培养 ： 快速从怀孕母猪子宫中取出 40 日龄的胚胎， 用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次 ； 用眼科剪和眼科镊分离背最长肌， 再用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次， 然后剪成 0.5~1.0mm3 的 组织块 ； 将组织块移入培养瓶并涂布均匀， 倒置培养瓶， 放入 37℃， 体积百分数为 5%CO2 的 培养箱中培养 3~4h ； 组织块完全贴壁后加入 10ml 的培养液， 培养液成分 ： DMEM+10% 胎牛血 清继续培养 8~12 个小时 ； 2） 传代培养 ： 倒出步骤 1) 过程中的培养液， 六用 PBS 清洗 3~4 次后， 用胰蛋白酶消化 后加入 10~15ml 的培养液终止消化 ； 消化后的细胞平均分成三瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养 箱中培养至冻存前 24~28h ； 3) 细胞冻存 ： （1） 准备冻存前 24~26h 弃除原有培养液并更换新的培养液 10~15ml， 继续培养 24~26h;（2） 倒出培养瓶中的培养液， 用 PBS 清洗 3~4 次后， 用胰蛋白酶消化后加入 10~15ml 的 培养液终止消化 ； （3） 用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数 ； （4） 1000rpm 离心细胞 5min， 去上清， 加入 1~1.5ml 的冻存液， 轻轻的吹打细胞使其悬 浮 ; 细胞冻存液成分 ： 体积百分数为 50% 胎牛血清、 体积百分数为 40%DMEM 及体积百分数为 10%DMSO ； （5） 把细胞移到冻存管中， 用封口膜封口 ； （6）将装有细胞的冻存管转移到 4 ℃冰箱中放置 1~2h， 然后转入 -20 ℃冰箱中放置 2~3h， 再移入到 -70℃的冰箱中过夜， 最后快速将其移入到液氮中长期保存， 并做好相应的 记录。
     所述的胰酶消化的步骤为 ： 向培养瓶中加入 37~39℃预热的质量百分数为 2% 的胰 蛋白酶 2ml， 在显微镜下观察体积百分数为 90~95% 的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒掉， 用 手轻磕细胞培养瓶使细胞脱落， 加入 10~15ml 新的培养液。
     所述的冻存细胞进行复苏步骤为 ： 将冻存管从液氮中取出后放入 37~39 ℃水浴 中， 晃动 1~2min 后， 把细胞移入到加入了 10~15ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去上清， 加入 2ml 的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶， 放置 于 37℃， 5%CO2 的培养箱中培养。 下面结合附图及实施方式对本发明做进一步说明， 以使公众对发明内容有整体和 充分的了解。
     实施例中所用的主要仪器及试剂来源 ： 金华猪胚胎来源 ： 浙江金华嘉华种猪场 （一） 主要仪器设备 37℃ 5％ CO2 培养箱 （德国 Heraeus） PH030A 型培养箱 （上海） DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱 （上海） DL-CJ-2N 高性能无菌试验台 （哈东联） YXO-LS-50SI 立式高压灭菌锅 （上海） IX-71 倒置相差显微镜 （日本 Olympus） 激光扫描共聚焦显微镜 （日本 尼康） CX31 生物显微镜 （日本 Olympus） 电热恒温水浴锅 （北京） TDL-40B 水平离心机 （上海） 蒸馏水器 （上海） 颇尔超纯水器 （德国 Pall） 电动移液器 （德国） -70℃低温冰箱 （美国） 液氮贮存器 （四川） 血球计数板 （北京） 96 孔培养板 （Corning）
     24 孔培养板 （Corning） DYY 一 111 型稳压稳流电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) 水平电泳槽 ( 北京六一仪器厂 ) 垂直电泳槽 ( 北京六一仪器） （二） 主要试剂 1、 细胞培养试剂 DMEM 培养基 （invitrogen） 、 胎牛血清 （thermo） 、 0.20% 胰蛋白酶溶液 （量取 0.2g 胰蛋 白酶， 溶于 100ml 水中， 0.22µm 滤膜过滤） 、 PBS（称取 NaCl， 8.0g、 Na2HPO4·12H20， 2.89g、 KCl， 0.2g、 KH2PO4， 0.2g 加适量超纯水使其溶解后， 用 1000ml 容量瓶定容。调节 pH 值 7.2 左右， 高压灭菌 30min） 2、 染色体标本制备试剂及配制 0.20% 胰蛋白酶溶液 （量取 0.2g 胰蛋白酶， 溶于 100ml 水中， 0.22µm 滤膜过滤） 、 DMEM 完全培养基 （invitrogen） ， PBS， 秋水仙素 （SIGMA） ， 吉姆萨 （AMRESCO） （1） 秋水仙素配制 ： 秋水仙素 10mg， PBS 10ml， 抽滤， 此为原液。工作液浓度为 100 μg/ml， 即取原液 l ml 溶于 9ml 三蒸水中， 原液与工作液均保存于 4℃ ； （2） 吉姆萨原液的配制 ： 量取甘油 33ml ； 甲醇 33ml。将吉姆萨粉 0.5g 放入研钵中， 先加入少量甘油， 研磨至无颗粒为止， 然后再将全部甘油倒入， 放 56℃温箱中 2h 后， 加入 甲醇， 将配制好的染液密封保存棕色瓶内 （最好于 0 ～ 4℃保存） ； 吉姆萨工作液的配制 ： 吉姆萨原液 1ml， 磷酸缓冲液 9ml（现用现配） ； （3） 磷酸缓冲液的配制 ： 1/15 mol/L Na2HPO4 12H2O ： 2.39g 溶于 100ml 双蒸水中 ； 1/15 mol/L KH2PO4 ： 0.907g 溶于 100ml 双蒸水中。取 1/15 mol/L Na2HPO4 12H2O 液 80ml， 1/15 mol/L KH2PO4 液 20ml 混合即为 pH7.38 的磷酸缓冲液。 （4） 固定液 ： 冰醋酸与甲醇以 1 ∶ 3 的比例 （现用现配） ； （5） 低渗溶液 （0.5%KCl 溶液 ) ： 0.5gKC 溶于 100ml 三蒸水中。
     3、 同工酶所用试剂及配制 EDTA（乙二胺四乙酸） 、 Tris（PROMEGA） 、 Acr（丙烯酰胺） 、 甘氨酸 （Clycine） Triton（曲 拉 通） X-100、 TEMED（四 甲 基 乙 二 胺） 、 PMS（吩 嗪 硫 酸 甲 脂， Phenazine Methosulfate） 、 NAD（氧化性辅酶 Ι） 、 MTT（噻唑兰， Thiazolyl Blue） 、 Bis（甲叉双丙烯 酰胺） 、 过硫酸铵 （Ammonium Persulfate， AP） 、 氯化硝基四氮唑蓝 （NBT） 、 乳酸钠 (1) 蛋白抽提液 ： TritonX-100 ∶ 0.9%NaCl 溶液 =1 ∶ 15（v/v） ， pH7.1， 含有 0.6mmol/L 的 EDTA， 贮于 4℃。
     (2) 分离胶储液配制 ： ① 28％ Acr ～ 0.8％ 配制 ： 称 14g Acr 和 0.4g Bis， 加蒸馏水定容至 50ml， 过滤， 装 到棕色瓶， 4℃避光保存。
     ② 0.6M Tris–HCI（pH8.9） /TEMED 配制 ： 称 7.3g Tris-Base， 溶于 50ml 的蒸 馏水中， 用 1N HCI 调 pH 值至 8.9， 加 0.4ml TEMED， 定容到 100ml， 过滤， 4℃避光保存。
     ③ 1％ AP 的配制 ： 称 1.0g AP， 溶于 50ml 的蒸馏水中， 定容到 100ml， 过滤， 装 到棕色凭， 4℃避光保存。
     (3) 浓缩胶储液配制 ：
     ① 38％ Acr ～ 2％ Bis 配制 ： 称 30g Acr 和 2g Bis， 加蒸馏水定容至 100ml， 过滤， 装到棕色瓶， 4℃避光保存 ； ② 0.124M Tris–HCI（pH6.7） 配制 ： 称 1.5g Tris-Base， 溶于 50ml 的蒸馏水中， 用 HCI 调 pH 值至 6.7， 定容到 100ml， 过滤， 4℃避光保存 ； ③ 10％ AP 的配制 ： 称 0.5g AP， 定容到 5ml， 过滤， 装到棕色凭， 4℃避光保存。
     ④ TEMED 原溶液 ： 分装少量 TEMED 原液于棕色瓶中， 4℃避光保存。
     (4) 电极缓冲液配制 ： 称 3.1g Tris-Base 和 1.0g Gly， 溶于 400ml 的水中， 用 1N HCI 调 pH 值至 8.7， 定容到 1000ml。
     (5) 制胶 ① 7.5% 分离胶 (12ml) PH8.9 Tris 一 HCl 5ml 30% 丙烯酰胺 3ml 1%TEMED 0.9ml 双蒸水 6.51ml 10%AP 0.09ml ② 3% 浓缩胶 (4ml) PH6.7Tris 一 HCl 0.5ml 30% 丙烯酞胺 0.4ml 1%TEMED 0.3ml 双蒸水 2.74ml 10%AP 0.06ml (6) 溴酚兰蔗糖溶液 溴酚兰 5mg 蔗糖 4g 加双蒸水至 10ml (7) 同工酶显色剂的配置 0.05M PH8.0 Tris 一 HCl 称 0.61g Tris-Base， 溶于 50ml 的蒸馏水中， 用 1N HCI 调 pH 8.0, 定容到 100ml, 过滤 ,4℃避光保存。
     ① MDH 显色剂 NAD( 氧化型辅酶 I) 15mg NBT 8mg TMS 1mg 0.05M PH8.0 Tris 一 HCl 30ml ② LDH 显色剂 5M 乳酸钠 6ml NAD 20mg NBT 15mg PMS 2mg0.05M PH8.0 Tris 一 HCl 40ml 4、 绘制细胞增殖曲线所用试剂 台盼蓝 （sigma） 、 PBS、 DMEM 细胞培养基 （invitrogen） 5、 细胞转染所用试剂 pECFP-N1(Invitrogen)、 阳离子脂质体 （Lipofectamine 2000， Invitrogen） 和大肠杆 菌感受态细胞 6、 细胞细菌污染检测 Hoechst 33342（sigma） 、 4% 多聚甲醛固定液 、 PBS（称取 NaCl， 8.0g、 Na2HPO4· 12H20， 2.89g、 KCl， 0.2g、 KH2PO4， 0.2g 加适量超纯水使其溶解后， 用 1000ml 容量瓶定容。调节 pH 值 7.2 左右， 高压灭菌 30min） 7、 细胞凋亡检测 细胞凋亡检测试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司） 、 0.01M TBS,PH7.5( 配法 ： 1L 三 蒸水中加入 8.5g 氯化钠。 1.2gTris 和 0.45-0.50ml 纯乙酸） 、 0.01M PBS,PH7.4( 配法 ： 7.9g 氯化钠 ,0.2g 氯化钾 ,0.24g 磷酸二氢钾 ,1.8g 磷酸氢二钾溶于 800ml 蒸馏水中， 用盐酸调 PH 至 7.4， 最后加蒸馏水定容至 1L） 实施例 1 金华猪成纤维细胞系的构建 （1） 初代培养 ： 快速从怀孕母猪子宫中取出 40 日龄的胚胎， 用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次； 用眼科剪和眼科镊分离背最长肌， 再用加双抗的 PBS 清洗 3~4 次， 然后剪成 0.5~1.0mm3 的组织块 ； 将组织块移入培养瓶并涂布均匀， 倒置培养瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养箱中培养 3~4h ； 组织块完全贴壁后加入 10ml 的培养液， 培养液成分 ： DMEM+10% 胎牛血清继续培养 12 个小时 ； （2） 传代培养 ： 倒出 (1) 过程中的培养液， 用 PBS 清洗 2 次后， 用胰蛋白酶消化后加入 10ml 的培养液终止消化 ； 消化后的细胞平均分成两瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养箱中培养至 冻存前 24h ； (3) 细胞冻存 ： ①准备冻存前 24h 弃除原有培养液并更换新的培养液 10ml， 继续培养 24h; ②按步骤 （2） 消化细胞， 加入 10ml 培养基终止消化 ； ③用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数 ； 1000rpm 离心细胞 5min， 去上清， 加入 1ml 的冻存液， 轻轻的吹打细胞使其悬浮 ; 细胞冻存液成分 ： 50% 胎牛血清、 40%DMEM 及 10%DMSO， 把细胞分装到冻存管中， 用封口膜封口 ； ④将装有细胞的冻存管转移到 4℃冰箱中放置 1h， 然后转入 -20℃冰箱中放置 2~3h， 再 移入到 -70℃的冰箱中过夜， 最后快速将其移入到液氮中长期保存， 并做好相应的记录。
     （4） 冻存细胞复苏 ： 将冻存管从液氮中取出后放入 37℃水浴中， 晃动 1~2min 后， 把 细胞移入到加入了 10ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去上清， 加入 2ml 的培 养基， 将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶， 放置于 37℃， 5%CO2 的培养箱 中培养。
     实施例 2 金华猪成纤维细胞系生物学特性的检测 对实施例 1 培养的金华猪成纤维细胞系进行生物学特性的检查， 方法如下 ： 一、 观察细胞生长状态、 培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。结论 ： 如图 1 为金华猪原代成纤维细胞 ； 图 2 为金华猪传代前细胞显微镜下图 ； 图 3 为金华 猪继代 I 细胞显微镜下图 ； 图 4 为金华猪继代 II 细胞显微镜下图 ； 细胞培养液清亮透明， 细 胞质突起丰满， 细胞核清晰可见， 整个细胞呈长梭形、 火焰， 细胞分裂迅速， 细胞形态趋于一 致， 为单核纤维装细胞。对整个细胞群体观察结果证明细胞生长旺盛， 分裂速度快。
     二、 微生物检测 1、 细菌、 真菌检测 方法 ： 1） 取冻存细胞快速将冻存管放入到 37℃水浴中， 晃动 1~2min 后， 把细胞移入到 加入了 10ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去上清。
     2） 重复步骤 （1） 加入 2ml 无抗生素的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀。
     3） 将细胞以 0.5ml 接种于不含抗生素培养基的培养瓶中， 分别置于 37℃和 26℃ 的培养箱中培养两周。
     4） 设对照组 （1） 阳性对照 ： 将细菌接种于刚接种复苏细胞的培养瓶中， 置于 37℃和 26℃的培养箱 中培养两周 ； （2） 阴性对照 ： 不加抗生素的培养基放于 37℃和 26℃的培养箱中两周。 结论 ： 肉眼观察接种有复苏后的成纤维细胞及同时接种成纤维细胞和细菌的培养基， 发现 只接种复苏成纤维细胞的培养基清澈透明， 而同时接种成纤维细胞和细菌的培养基出现浑 浊。 用显微镜观察发现只接种复苏成纤维细胞的培养瓶瓶中除了成纤维细胞外没有其它杂 物。
     2、 支原体检测 （1）取冻存细胞快速将冻存管放入到 37℃水浴中， 晃动 1~2min 后， 把细胞移入到加入 了 10ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去上清。
     （2） 重复步骤 （1） 加入 2ml 无抗生素的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀。将细胞以 0.5ml 接种于不含抗生素培养基的培养瓶中， 分别置于 37℃的培养箱中培养 48h ； （3） 用 PBS 或合适的缓冲液制备 10 ～ 50µM Hoechst33342 染料 ； （4） 将 1/10 细胞培养基体积的 Hoechst33342 染料溶液加入细胞培养物中 （可以用 1/10 浓度的 Hoechst33342 染料缓冲液代替培养基） ； （5）在 37℃培养细胞 10 ～ 20 分钟 ； （6）用 PBS 或合适的缓冲液洗细胞两次 ； （7） 直接加入 4％多聚甲醛固定液， 与培养液按 1 ： 3 混合， 固定细胞 10min ； （8）用带有 350nm 激发波长， 461nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
     结论 ： Hoechst33342 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料， 对细胞的毒性较低。被 支原体污染的细胞在荧光细胞周围仿佛有一层薄纱， 与没有被污染的细胞形成鲜明的对 比， 如图 6 所示。从图中可以发现此细胞系没有被支原体污染， 细胞生长状况良好。
     三、 细胞生长曲线的绘制 方法 ：
     （1） 制备细胞悬浮液， 取待测生长状况良好的细胞， 待细胞长到 80~90% 时， 用常规的方 法将细胞消化 ； （2） 向 24 孔板中分别接种等量的细胞， 最好为 2×104 个 /ml， 置于 37℃， 5%CO2 的培养 箱中培养 ； （3） 从接种时间算起， 每隔 24h 计数 3 孔内的细胞密度， 用血球计数板分别计数细胞的 总数， 取 3 孔的平均值， 直到第八天结束 ； （4） 以培养时间为横坐标以， 以细胞密度为纵坐标， 将结果在坐标纸上绘制， 得到培养 细胞的生长曲线。
     结论 ： 通过对接种后的细胞连续 8 天的计数， 得到培养细胞的生长曲线。从曲线中可以发现 细胞接种第 1 天生长比较缓慢， 这可能是由于胰酶的作用使细胞损伤没有恢复， 这段时间 为细胞适应的阶段 ； 在接种的第 2 天细胞生长速度明显加快， 第 3 天时细胞生长速度达到最 大； 到第 5 天后细胞生长速度开始变慢， 这可能是由于细胞数量变多， 导致营养物质消耗， 细胞之间的竞争加剧。6~7 天细胞密度基本保持在最大， 到第 8 天细胞数量有所减少， 这可 能是由于细胞之间的相互竞争导致细胞的生存环境进一步恶化， 少量的细胞不能适应这种 恶化的环境而死亡。 四、 细胞活率检测 方法 ： 1、 细胞冻存前， 取收集好的 10µl 细胞悬浮液加入 10µl 的 1% 台盼蓝染液， 混匀。 血球计数板计数活细胞及死细胞 （细胞透明， 不着色的为活细胞 ； 细胞被染色的为死细胞） 。 计数 1000 个细胞， 计数细胞活率。
     2、 细胞复苏后， 取 10µl 细胞悬浮液加入 10µl 的 1% 台盼蓝染液， 混匀。同步骤 （1） 计数细胞活率。
     结论 ： 细 胞 冻 存 前 后 对 金 华 猪 细 胞 系 活 率 进 行 测 定。 结 果 表 明 ： 细胞冻存前活率达 94.2~97.5%， 而细胞复苏后活率达 91.8~93.5%， 由此可得细胞冻存后成活率依然很高。 在冻 存后将细胞培养发现细胞的形态符合成纤维细胞的形态， 而且细胞的生物学活性没有受到 影响， 此金华猪的成纤维细胞系质量比较稳定。
     五、 同工酶分离 方法 ： 不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1、 样品的制备 ： （1） 采集指数增长期待检细胞， 1000g 离心 5min， 去上清 ； （2） 加 PBS 漂洗， 离心。再漂洗、 离心 2 遍， 最后弃上清液 ； （3） 向细胞沉淀中加蛋白质提取液， 用吸管反复吹打， 使细胞完全溶解 ； （4） 把细胞溶解液转入 1.5ml 离心管中， 再用吸管反复吹打， 使细胞膜彻底溶解 ； （5） 置入微型离心机中， 高速离心 （9000r/min、 2min） ， 收集上清， 分成若干份， -70℃中 储存。
     2、 凝胶的制备和注模 ： （1） 根据所需浓度和配量， 先用吸管按凝胶成分配比准确地吸取各贮液， 在 15ml 的离 心管中配制成凝胶工作液， 均匀混合各成分， 静置 1min， 尽量抽去溶液中的空气。 把混合好
     的凝胶工作液灌入其中。要防止灌胶里有气泡的产生。此后缓慢加入蒸馏水进行水封， 水 层约 0.5cm 左右高度 ； （2） 室温静置 45min 左右后， 水封层与分离胶层之间出现明显界面。倒出水层， 并用 吸纸吸取残留的水分。然后将配制的浓缩胶工作液注入凝胶腔内的分离胶液上面。直至距 离短玻璃上沿 5mm 处， 立即将样品梳子插入凝胶液顶部。此过程也要应避免出现气泡。室 温静置， 1h 后浓缩胶聚合完成。小心取出样品梳子， 将凝胶腔安装在电泳架上， 准备加样 品； （3） 取出在 -70℃中储存的蛋白提取液， 解冻， 快速加入约蛋白提取液一半的 40% 蔗糖 溶液和 2.5μl 的溴酚蓝指示剂， 混匀， 此时正常的蛋白质样品会呈现出深蓝色。 用微量加 样器在样品槽内加样， 10μl 为宜。在样品液上面， 缓慢加入电极缓冲液， 使每个凹槽内空 隙完全被充满。在电泳盒的上槽 （负极） 及下槽 （正极） 内分别倒入电极缓冲液。将电泳槽 置入 4℃冰箱， 准备电泳 ； （4） 电泳与染色 ： 调节电压 60V 电泳约 30min， 待指示剂到分离胶后将电压调节为 120V 电泳约 6h， 当溴酚蓝指示剂迁移至下缘边缘时， 停止电泳， 切断电源 ； 取下凝胶腔， 小心除 去玻璃板， 将凝胶平板放在搪瓷托盘中， 注入染色液， 37℃避光染色至出现蛋白条带为止 ； （5） 拍照与计算 ： 用照相机将染色后的凝胶照相， 测量区带泳动距离 （d） 及指示剂泳动 距离 （D） ， 计算相对迁移率 （Rf） 。 结论 ： 如图 9( 左 ) 所示， 金华猪成纤维细胞苹果酸脱氢同工酶 （MDH） 的酶谱中有 2 个条带靠近阳极的泳动较快的为细胞溶质型 （s-MDH） ， 靠近阴极的泳动较慢的为线粒体型 （m-MDH） , 相对迁移率的 s-MDH 和 m-MDH 的分别为 20.12% 和 35%。如图 9 （右） 所示， 金华猪 成纤维细胞乳酸脱氢同工酶 （LDH） 的酶谱中有 4 个条带从阴极到阳极依次为 LDH1、 LDH2、 LDH3、 LDH4， 相对迁移率分别为 15.87%、 33.33%、 47.62% 和 63.49%。
     六、 核型的制备 1、 选取处于指数生长期、 用较大瓶培养的、 80 ～ 90% 汇合单层培养 细胞加秋水仙素 ： 从冰箱中取出培养瓶， 加秋水仙素， 使其最终浓度为 0.4μg/ml 培 养液 ； 温箱中继续培养 7h ； 2、 采集分裂细胞 ： 胰蛋白酶消化收集细胞。转入离心管中， 以 1000r/min 离心 5min， 收集细胞 ； 3、 低渗 ： 吸除上清液， 加入预热至 37℃、 0.5% KCl 溶液 2ml， 轻轻吹打均匀， 继续加至 8ml， 吹打均匀。37℃温箱中温育 30min ； 4、 预固定 ： 悬液中加入新鲜固定液 1ml， 打匀 （打匀时要轻轻吹打防止细胞破裂） ； 5、 固定 ： 将悬液以 1000r/min 离心 5min， 吸除上清液， 加入新鲜固定液 10ml， 打匀， 室 温静置 20min ； 6、 重固定 ： 重复步骤 6， 离心后小心吸除上清液， 视悬液细胞密度大小， 剩余固定液 0.5 ～ 1.0ml， 吹打均匀 ； 7、 制片 ： 取出在冰箱中预冷的干净载玻片， 待表面有一层水雾出现时， 在距玻片约 50cm 高处用吸管迅速滴上 1 ～ 2 滴细胞悬液。滴片后， 置于室温自然干燥， 将滴片快速通 过酒精灯的外焰上方， 来回 2~3 次， 将样本固定到载玻片上 8、 吉姆萨工作液染色 15min， 自来水冲洗， 室温自然干燥 ；
     9、 镜检染色体核型， 选择分散程度良好、 无丢失、 形态清晰、 背景干净的中期分裂相进 行显微照相。对 100 个细胞的染色体数目进行计数， 对其是否为整二倍体进行分析， 统计 出染色体 2n 众数。
     结论 ： 对染色体数目统计得到二倍体数在中细胞中所占的比例为 85%， 即 2n ≠ 38 所占比例为 15%， 这达到了建系正常的二倍体要求的 75%-80%。
     七、 脂质体介导的质粒 DNA 转染体外培养细胞 方法 ： 1、 荧光蛋白报告质粒 （pEGFP-N3) 的制备 ： 按照说明书， 提取纯化 pEGFP-N3 荧光蛋白报 告质粒， 用紫外分光光度计测定质粒得到的质粒浓度为 0.15µg/ml 质粒 DNA， OD260/OD280 值为 1.75~1.83 之间， 结果表明制得的质粒 DNA 纯度、 浓度等适合用于转染成纤维细胞。
     2、 细胞转染 （1） 将成纤维细胞用 96 孔细胞培养板含 10 % 胎牛血清的 DMEM 培养液中。
     （2）37℃ ,5 %CO2 , 饱和湿度培养细胞直到细胞长至 50 % ～ 80 % 汇合。
     （3） 取适量 DMEM 培养液 ( 无抗生素、 血清 ) 加入 DNA 混匀此为 A 液， 静置。
     （4） 向 DMEM 培养液 ( 无抗生素、 血清 ) 中加入脂质体 ( L;ipofwctamineTM2000) 混匀此为 B 液 , 静置 5min。
     （5） 将 A 液与 B 液慢慢混匀， 室温静置 20min。
     （6） 于转染前用 PBS 清洗细胞两次。
     （7） 向培养板中加入 A 液与 B 也的混合物 , 放置于 37℃ ,5 %CO2 , 饱和湿度培养 箱中孵育 18 ～ 48h, 中途 6h 后换入新鲜含 10 % 胎牛血清及抗生素的 DMEM 培养液。
     3、 细胞转染效率的观察 ： 488nm 激发光下观察细胞的转染数， 计算转染率。
     结论 ： 如图 10 所示， 在 48h 细胞的转染率最高， 转染率为 32.4%。转染 72h 后阳性 细胞和转染有荧光的细胞的荧光强度开始减弱。
     此过程中细胞的转染率在 32.4% 和一般的细胞转染率相比转染效率较高， 适合于 以后的应用研究。
     八、 细胞凋亡的检测 方法 ： 按细胞凋亡检测试剂盒 （武汉博士德生物有限公司， 产品编号 MK1024） 说明书进 行试验。
     观察结果 ： 此过程采用的细胞凋亡检测试剂盒可以将凋亡细胞的细胞核染成棕黄 色， 在普通显微镜下观察统计凋亡细胞， 计算凋亡率。
     结论 ： 如图 11 所示， 检测培养传代的 50 代细胞的凋亡率。结果显示， 细胞的凋亡 率为 2.0%， 此凋亡率比其它实验所示的凋亡率高可能是由于所用的方法不同， 或者是采用 相同的方法而采用的观察细胞凋亡的准则不同所引起的。
     实施例 2 1） 初代培养 ： 快速从怀孕母猪子宫中取出 40 日龄的胚胎， 用加双抗的 PBS 清洗 3 次 ； 用 3 眼科剪和眼科镊分离背最长肌， 再用加双抗的 PBS 清洗 3 次， 然后剪成 1~0.5mm 的组织块 ； 将组织块移入培养瓶并涂布均匀， 倒置培养瓶， 放入 37℃， 体积百分数为 5%CO2 的培养箱中 培养 3h ； 组织块完全贴壁后加入 10ml 的培养液， 培养液成分 ： DMEM+10% 胎牛血清继续培养 8 个小时 ；2） 传代培养 ： 倒出步骤 1) 过程中的培养液， 六用 PBS 清洗 2 次后， 用胰蛋白酶消化后 加入 10ml 的培养液终止消化 ； 消化后的细胞平均分成三瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养箱中培 养至冻存前 24h ； 其余实施方法如实施事例 1 3) 细胞冻存 ： （1） 准备冻存前 24h 弃除原有培养液并更换新的培养液 10ml， 继续培养 24h; （2） 倒出培养瓶中的培养液， 用 PBS 清洗 2 次后， 用胰蛋白酶消化后加入 10ml 的培养液 终止消化 ； （3） 用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数 ； （4） 1000rpm 离心细胞 5min， 去上清， 加入 1ml 的冻存液， 轻轻的吹打细胞使其悬浮 ; 细胞冻存液成分 ： 体积百分数为 50% 胎牛血清、 体积百分数为 40%DMEM 及体积百分数为 10%DMSO ； （5） 把细胞移到冻存管中， 用封口膜封口 ； （6） 将装有细胞的冻存管转移到 4℃冰箱中放置 1h， 然后转入 -20℃冰箱中放置 2h， 再 移入到 -70℃的冰箱中过夜， 最后快速将其移入到液氮中长期保存， 并做好相应的记录。
     所述的胰酶消化的步骤为 ： 向培养瓶中加入 37℃预热的质量百分数为 2% 的胰蛋 白酶 1.5ml， 在显微镜下观察体积百分数为 90% 的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒掉， 用手轻 磕细胞培养瓶使细胞脱落， 加入 10ml 新的培养液。
     所述的冻存细胞进行复苏步骤为 ： 将冻存管从液氮中取出后放入 37℃水浴中， 晃 动 1min 后， 把细胞移入到加入了 10ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去上清， 加入 2ml 的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶， 放置于 37 ℃， 5%CO2 的培养箱中培养。
     实施例 3 1） 初代培养 ： 快速从怀孕母猪子宫中取出 40 日龄的胚胎， 用加双抗的 PBS 清洗 4 次 ； 用 3 眼科剪和眼科镊分离背最长肌， 再用加双抗的 PBS 清洗 4 次， 然后剪成 1~0.5mm 的组织块 ； 将组织块移入培养瓶并涂布均匀， 倒置培养瓶， 放入 39℃， 体积百分数为 5%CO2 的培养箱中 培养 4h ； 组织块完全贴壁后加入 10ml 的培养液， 培养液成分 ： DMEM+10% 胎牛血清继续培养 12 个小时 ； 2） 传代培养 ： 倒出步骤 1) 过程中的培养液， 六用 PBS 清洗 3 次后， 用胰蛋白酶消化后 加入 15ml 的培养液终止消化 ； 消化后的细胞平均分成三瓶， 放入 37℃， 5%CO2 的培养箱中培 养至冻存前 28h ； 3) 细胞冻存 ： （1） 准备冻存前 26h 弃除原有培养液并更换新的培养液 15ml， 继续培养 24~26h; （2） 倒出培养瓶中的培养液， 用 PBS 清洗 3 次后， 用胰蛋白酶消化后加入 10~15ml 的培 养液终止消化 ； （3） 用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数 ； （4） 1000rpm 离心细胞 5min， 去上清， 加入 1.5ml 的冻存液， 轻轻的吹打细胞使其悬 浮 ; 细胞冻存液成分 ： 体积百分数为 50% 胎牛血清、 体积百分数为 40%DMEM 及体积百分数为 10%DMSO ；（5） 把细胞移到冻存管中， 用封口膜封口 ； （6） 将装有细胞的冻存管转移到 4℃冰箱中放置 2h， 然后转入 -20℃冰箱中放置 3h， 再 移入到 -70℃的冰箱中过夜， 最后快速将其移入到液氮中长期保存， 并做好相应的记录。
     所述的胰酶消化的步骤为 ： 向培养瓶中加入 39℃预热的质量百分数为 2% 的胰蛋 白酶 2ml， 在显微镜下观察体积百分数为 95% 的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒掉， 用手轻磕 细胞培养瓶使细胞脱落， 加入 15ml 新的培养液。
     所述的冻存细胞进行复苏步骤为 ： 将冻存管从液氮中取出后放入 39℃水浴中， 晃 动 2min 后， 把细胞移入到加入了  15ml 全培养基离心管中， 1000r/min 离心 5min 后去 上清， 加入 2ml 的培养基， 将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶， 放置于 37℃， 5%CO2 的培养箱中培养， 其余步骤与实施例 1 相同。