昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010289195.8	申请日：	2010.09.21
公开号：	CN102406670A	公开日：	2012.04.11
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 36/185申请公布日:20120411\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/185申请日:20100921\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K36/185; A61P35/00; A61P37/02; A61K125/00(2006.01)N	主分类号：	A61K36/185
申请人：	中国人民解放军第三军医大学
发明人：	刘晋祎; 曹佳; 敖琳; 杨录军; 黄晓春; 姜晓
地址：	400038 重庆市沙坪坝区高滩岩30号
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内容摘要

本发明是一种昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用。取一定量昆明山海棠去皮根粉碎后加入一定量一定浓度的乙醇溶液在超声设备辅助下多次提取，合并提取液后浓缩，向所得浓缩液加入一定浓度的浓盐酸调节pH值充分混合一定时间后过滤，所得滤液用氯仿萃取多次后保留萃余相，调节该相pH值至碱性，对该碱性溶液用氯仿多次萃取后合并氯仿相，蒸发回收氯仿得总生物碱，或将该碱性溶液通过C18柱进行固相萃取得总生物碱。本发明所得提取物可用于治疗肿瘤及自身免疫性疾病。

权利要求书

1：一种昆明山海棠总生物碱的提取方法，其特征在于提取过程包含以下步骤： (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69％乙醇在超声条件下多次提取； (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45％的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3 调节 pH 值至 9-11，再用氯仿萃取 3-5 次，合并萃取相； (5)40-50℃条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱；或 (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69％乙醇在超声条件下多次提取； (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45％的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3 调节 pH 值至 9-11，将该萃余相通过含 C18 的固相萃取 (Solid-Phase Extraction， SPE) 装置，先用蒸馏水冲洗 30 分钟，再用 30-45％乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。
2：根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 2 中的乙醇用量为昆明山海棠粉重量的 15 倍。
3：根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 2 中的乙醇浓度为 65％。
4：根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 2 中的多次提取为 3 次，第一次为 3 小时，第二次为 2 小时，第三次为 1 小时。
5：根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 3 中的 pH 值为 2-3。
6：根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 4 中的 pH 值为 10。
7：根据权利要求 1 所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用，其特征在于一定量总生物碱中加入适量药用辅料制成各种常用制剂，包括片剂、胶囊剂、注射剂。
8：根据权利要求 7 所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用，其特征在于所得制剂为片剂，处方为总生物碱、淀粉、 7％ -15％淀粉浆、硬脂酸镁。

说明书

昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用
    技术领域本发明属于植物提取技术与药物研究领域，具体为昆明山海棠植物中提取总生物碱的方法及该提取方法所得提取物的应用。
     背景技术癌症对人类的健康和生存构成重大威胁，当前和今后相当长的时期内抗肿瘤药物仍是癌症治疗的最主要手段之一。现有的绝大部分肿瘤化疗药物存在选择性低、毒性大的缺点。发现高选择性、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。我国人口世界第一、肿瘤发病率高，抗肿瘤新药开发也是我国新药研究和开发的重点。
     新型抗肿瘤药物的发现面临着化学实体来源以及如何筛选两个关键问题。在抗肿瘤新药来源问题方面，天然产物是我国新药研究和开发的宝贵资源和很好的切入点。昆明山海棠 (Tripterygium Hypoglaucum Hutch(THH)) 是卫矛科雷公藤属植物，主要分布于我国长江以南各省区、西南区以及台湾省，主产于云南省。临床上主要作为免疫抑制剂用来治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、肿瘤等，并具有镇痛、抗炎、抗雄性生育和致突变作用。实验证明 THH 的毒性作用远小于同属植物雷公藤。THH 的主要成份有生物碱、萜类、甙类、糖类、有机酸、多糖等，其中生物碱在临床上的疗效最好且毒副作用最小。
     传统的昆明山海棠总生物碱 (Total alkaloids of THH(THHta)) 提取方法药物浸泡时间过长 ( 加入有机溶剂浸泡时间长达 6 天，如文献 [ 敖琳，曹佳，徐颖等，昆明山海棠总生物碱诱发 HL60 细胞凋亡的观察 . 第三军医大学学报 .2001， 23(11) ： 1273-1275]) 且得到的总生物碱杂质较多，不易分离提纯。本发明克服了以往提取方法存在的问题，一是利用超声提取技术，提高了 THHta 的得率，缩短了浸泡时间从而提高了提取效率；二是在超声萃取的基础上，利用 C18 的亲脂性进行固相萃取，在减少氯仿用量的同时提高了总生物碱的纯度。
     发明内容本发明的目的在于提供一种从昆明山海棠中提取总生物碱的方法，并将其应用于肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。
     本发明利用超声提取技术，将超声提取、溶剂萃取和固相萃取相结合，确定了具体的提取条件对昆明山海棠中的总生物碱进行提取，该提取物经体内外抗肿瘤活性实验表明 THHta 可以抑制 MOLT-4、 HCT116 和 PC3 等肿瘤细胞增殖活性，对 HCT116 细胞裸鼠移植瘤生长也具有明显的抑制作用，具有显著的体内抗肿瘤活性。
     本发明通过以下方法实现发明目的。
     昆明山总生物碱的提取方法步骤如下：
     (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛；
     (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69％乙醇在超声条件下多次提取；
     (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45％的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3 调节 pH 值至 9-11，再用氯仿萃取 3-5 次，合并萃取相；
     (5)40-50℃条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱；
     或
     (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛；
     (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69％乙醇在超声条件下多次提取；
     (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45％的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤；
     (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3 调节 pH 值至 9-11，将该萃余相通过含 C18 的固相萃取装置，先用蒸馏水冲洗 30 分钟，再用 30-45％乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。
     其中步骤 (2) 的超声提取采用济宁金百特电子有限责任公司生产的智能控制连续多功能超声波提取机完成。
     具体实施方式 1. 实验目的
     检测本专利方法所得昆明山海棠总生物碱 (THHta) 体内外抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物开发提供实验依据。
     2. 实验材料
     2.1 供试样品： THHta 经由本专利所述方法得到。
     2.2 实验细胞株：肿瘤细胞株 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3( 购自上海细胞生物研究所细胞库 )。
     2.3 实验动物：
     BALB/c-nu 裸小鼠 18 只， 4 周龄，体重 14.2±0.9g，雌性鼠，由中国医学科学院实验动物所提供， SPF 级，实验动物生产许可证号： ( 京 )2009-0004。
     3. 实验方法与结果
     3.1THHta 对肿瘤细胞的增殖抑制作用
     用不同浓度 (5、 10、 25、 50、 100μg/ml) 的 THHta 处理 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 等 4 种肿瘤细胞，并于药物处理后 48h 进行 MTT 实验。
     结果显示： THHta 能够抑制 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 四种肿瘤细胞的增殖活性，且与剂量呈明显的依赖关系，结果见表 1。THHta 作用 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 细胞 48h 对应的 IC50 值为 1.59、 8.77、 18.86、 49.34μg/ml。
     3.2THHta 对 HCT116 裸鼠移植瘤生长的抑制作用
     将 HCT116 细胞接种于裸鼠皮下，当肿瘤形成且瘤块体积达到 100mm3 左右时，按肿瘤体积将裸鼠随机分为对照组、 THHta 治疗组 (50mg/kg 组、 100mg/kg 组 )。给药方案：腹腔注射给药，每周给药 5 天，间歇两天，连续给药 24 天。对照组给予体重相应的等体积溶剂 ( 含 0.2％ DMSO 的生理盐水 )。实验期间每三天测量一次移植瘤体积参数并计算瘤体积，各
     组平均瘤体积见表 2。根据每次测量的移植瘤体积计算相对瘤体积 (RTV)，并进一步计算相应的相对肿瘤增殖率 (T/C％ )，见表 3。
     结果显示：治疗组 HCT116 裸鼠移植瘤的平均体积与对照组相比，在给药第 6 天后， 100mg/kg 组瘤体积小于对照组，具有显著的统计学差异 (P ＜ 0.01) ；在给药第 9 天至实验结束， THHta 两治疗组瘤体积均显著小于对照组 (P ＜ 0.01)。实验结束时，对照组、 THHta 低剂量、高剂量组移植瘤的平均体积分别是分组给药时肿瘤体积的 9.39 倍、 1.93 倍和 0.83 倍。THHta50mg/kg 组在给药后第 12 天开始相对肿瘤增殖率 (T/C％ ) 小于 40％； THHta100mg/kg 组在给药后第 9 天开始 T/C 值小于 40 ％。实验期间各时间点 T/C 值说明 THHta 能抑制 HCT116 移植瘤在裸鼠体内的增殖生长，且与时间和剂量呈依赖关系。
     表 1.MTT 法法测定 THHta 作用 48h 对以下 4 种肿瘤细胞的抑制率 (％， n ＝ 8， )
     注：与正常组比较， *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01 表 2.HCT116 裸鼠移植瘤体积 (mm3)
     注：与对照组比较， *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01 表 3.THHta 治疗 HCT116 移植瘤的 RTV 及 T/C 值
     注： T/C ＞ 40％视为无效， T/C of ≤ 40％，并经统计学处理 P ＜ 0.05 视为有效。相对肿瘤体积 (RTV) ；相对肿瘤增值率 (T/C)
     3.3 数据处理
     测得指标均用均数 ± 标准差表示，采用 SPSS12.0 软件包进行统计分析，组间比较用 F 检验，两两比较用 q 检验， P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。 4. 结语
     THHta 可显著抑制 MOLT-4、 HL60、 HCT116 及 PC3 肿瘤细胞增殖活性，且呈明显的剂量效应关系。THHta 能够抑制 HCT116 细胞裸鼠移植瘤生长，具有显著的体内抗肿瘤活性。
     实施例 1 ：
     取昆明山海棠去皮根 2kg，粉碎后过 10 目筛，用 10 倍量 61％乙醇浸泡同时置于超声仪器中 3 小时，滤出药液，重复加入 10 倍量 61％乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 30％ HCl 调节 pH 到 2-3 之间，用相当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加入 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，再用相当量氯仿萃取 3 次，合并萃取液在 40-50℃旋转蒸发回收氯仿后得总生物碱 19.8g ；
     实施例 2 ：
     取昆明山海棠去皮根 100g，粉碎后过 10 目筛，用 10 倍量 69％乙醇浸泡同时置于超声仪器中 3 小时，滤出药液，重复加入 10 倍量 69％乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 45％ HC1 调节 pH 到 2-3 之间，用相当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加人 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，将该碱性液通过 C18 固相萃取装置，用水冲洗固相萃取装置 30 分钟，用 45％乙醇冲洗，收集冲洗液后经旋转蒸发回收乙醇得总生物碱 0.97g ；
     实施例 3 ：
     取昆明山海棠去皮根 100g，粉碎后过 10 目筛，用 10 倍量 65％乙醇浸泡同时置于超声仪器中 3 小时，滤出药液，重复加入 10 倍量 65％乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 40％ HCl 调节 pH 到 2-3 之间，用适当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加入 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，将该碱性液通过 C18 固相萃取装置，用水冲洗固相萃取装置 30 分钟，用 50％乙醇冲洗，收集冲洗液后经旋转蒸发回收乙醇得总生物碱 0.95g。7

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1、(10)申请公布号 CN 102406670 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102406670 A *CN102406670A* (21)申请号 201010289195.8 (22)申请日 2010.09.21 A61K 36/185(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61K 125/00(2006.01) (71)申请人中国人民解放军第三军医大学地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩 30 号 (72)发明人刘晋祎曹佳敖琳杨录军黄晓春姜晓 (54) 发明名称昆明山海棠总生物碱的提取方。

2、法及该提取物的应用 (57) 摘要本发明是一种昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用。取一定量昆明山海棠去皮根粉碎后加入一定量一定浓度的乙醇溶液在超声设备辅助下多次提取，合并提取液后浓缩，向所得浓缩液加入一定浓度的浓盐酸调节 pH 值充分混合一定时间后过滤，所得滤液用氯仿萃取多次后保留萃余相，调节该相 pH 值至碱性，对该碱性溶液用氯仿多次萃取后合并氯仿相，蒸发回收氯仿得总生物碱，或将该碱性溶液通过 C18 柱进行固相萃取得总生物碱。本发明所得提取物可用于治疗肿瘤及自身免疫性疾病。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12。

3、)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页 CN 102406673 A1/1 页 2 1. 一种昆明山海棠总生物碱的提取方法，其特征在于提取过程包含以下步骤： (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69乙醇在超声条件下多次提取； (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； (4)滤液用氯仿萃取3-5次，所得萃余相用Na2CO3调节pH值至9-11，再用氯仿萃取3-5 次，合并萃取相； (5)40-50条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱；或。

4、 (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69乙醇在超声条件下多次提取； (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3调节 pH 值至 9-11，将该萃余相通过含 C18 的固相萃取 (Solid-Phase Extraction， SPE) 装置，先用蒸馏水冲洗 30 分钟，再用 30-45乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。 2. 根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述。

5、步骤 2 中的乙醇用量为昆明山海棠粉重量的 15 倍。 3. 根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 2 中的乙醇浓度为 65。 4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤2中的多次提取为3次，第一次为 3 小时，第二次为 2 小时，第三次为 1 小时。 5. 根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 3 中的 pH 值为 2-3。 6. 根据权利要求 1 所述的提取方法，其特征在于所述步骤 4 中的 pH 值为 10。 7. 根据权利要求 1 所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用，其特征在于一定量总生物碱中加入适量药。

6、用辅料制成各种常用制剂，包括片剂、胶囊剂、注射剂。 8. 根据权利要求 7 所述提取方法所得提取物在抗肿瘤及抗自身免疫性疾病中的应用，其特征在于所得制剂为片剂，处方为总生物碱、淀粉、 7 -15淀粉浆、硬脂酸镁。权利要求书 CN 102406670 A CN 102406673 A1/5 页 3 昆明山海棠总生物碱的提取方法及该提取物的应用技术领域 0001 本发明属于植物提取技术与药物研究领域，具体为昆明山海棠植物中提取总生物碱的方法及该提取方法所得提取物的应用。背景技术 0002 癌症对人类的健康和生存构成重大威胁，当前和今后相当长的时期内抗肿瘤药物仍。

7、是癌症治疗的最主要手段之一。现有的绝大部分肿瘤化疗药物存在选择性低、毒性大的缺点。发现高选择性、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。我国人口世界第一、肿瘤发病率高，抗肿瘤新药开发也是我国新药研究和开发的重点。 0003 新型抗肿瘤药物的发现面临着化学实体来源以及如何筛选两个关键问题。在抗肿瘤新药来源问题方面，天然产物是我国新药研究和开发的宝贵资源和很好的切入点。昆明山海棠 (Tripterygium Hypoglaucum Hutch(THH) 是卫矛科雷公藤属植物，主要分布于我国长江以南各省区、西南区以及台湾省，主产于云南。

8、省。临床上主要作为免疫抑制剂用来治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、肿瘤等，并具有镇痛、抗炎、抗雄性生育和致突变作用。实验证明 THH 的毒性作用远小于同属植物雷公藤。THH 的主要成份有生物碱、萜类、甙类、糖类、有机酸、多糖等，其中生物碱在临床上的疗效最好且毒副作用最小。 0004 传统的昆明山海棠总生物碱(Total alkaloids of THH(THHta)提取方法药物浸泡时间过长 ( 加入有机溶剂浸泡时间长达 6 天，如文献敖琳，曹佳，徐颖等，昆明山海棠总生物碱诱发HL60细胞凋亡的观察.第三军医大学学报.2001， 23(11) ： 1273-。

9、1275)且得到的总生物碱杂质较多，不易分离提纯。本发明克服了以往提取方法存在的问题，一是利用超声提取技术，提高了 THHta 的得率，缩短了浸泡时间从而提高了提取效率；二是在超声萃取的基础上，利用 C18 的亲脂性进行固相萃取，在减少氯仿用量的同时提高了总生物碱的纯度。发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种从昆明山海棠中提取总生物碱的方法，并将其应用于肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。 0006 本发明利用超声提取技术，将超声提取、溶剂萃取和固相萃取相结合，确定了具体的提取条件对昆明山海棠中的总生物碱进行提取，该提取物经体内外抗肿瘤活性实验表明 TH。

10、Hta 可以抑制 MOLT-4、 HCT116 和 PC3 等肿瘤细胞增殖活性，对 HCT116 细胞裸鼠移植瘤生长也具有明显的抑制作用，具有显著的体内抗肿瘤活性。 0007 本发明通过以下方法实现发明目的。 0008 昆明山总生物碱的提取方法步骤如下： 0009 (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； 0010 (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69乙醇在超声条件下多次提取；说明书 CN 102406670 A CN 102406673 A2/5 页 4 0011 (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分。

11、混合后过滤； 0012 (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3调节 pH 值至 9-11，再用氯仿萃取 3-5 次，合并萃取相； 0013 (5)40-50条件下，旋转蒸发萃取相回收氯仿后得总生物碱； 0014 或 0015 (1) 昆明山海棠去皮根粉碎后过 5-15 目筛； 0016 (2) 加昆明山海棠去皮根 10-40 倍量 61-69乙醇在超声条件下多次提取； 0017 (3) 合并提取液，浓缩后加入 30-45的浓盐酸调节 pH 值至酸性，充分混合后过滤； 0018 (4) 滤液用氯仿萃取 3-5 次，所得萃余相用 Na2CO3。

12、调节 pH 值至 9-11，将该萃余相通过含 C18 的固相萃取装置，先用蒸馏水冲洗 30 分钟，再用 30-45乙醇冲洗，收集该冲洗液经旋转蒸发回收乙醇后得总生物碱。 0019 其中步骤 (2) 的超声提取采用济宁金百特电子有限责任公司生产的智能控制连续多功能超声波提取机完成。具体实施方式 0020 1. 实验目的 0021 检测本专利方法所得昆明山海棠总生物碱 (THHta) 体内外抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物开发提供实验依据。 0022 2. 实验材料 0023 2.1 供试样品： THHta 经由本专利所述方法得到。 0024 2.2 实验细胞株：肿瘤细胞株 HL。

13、60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3( 购自上海细胞生物研究所细胞库 )。 0025 2.3 实验动物： 0026 BALB/c-nu裸小鼠18只， 4周龄，体重14.20.9g，雌性鼠，由中国医学科学院实验动物所提供， SPF 级，实验动物生产许可证号： ( 京 )2009-0004。 0027 3. 实验方法与结果 0028 3.1THHta 对肿瘤细胞的增殖抑制作用 0029 用不同浓度 (5、 10、 25、 50、 100g/ml) 的 THHta 处理 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 等 4 种肿瘤细胞，并于药物处理后 48h 进。

14、行 MTT 实验。 0030 结果显示： THHta 能够抑制 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 四种肿瘤细胞的增殖活性，且与剂量呈明显的依赖关系，结果见表 1。THHta 作用 HL60、 MOLT-4、 HCT116 及 PC3 细胞 48h 对应的 IC50值为 1.59、 8.77、 18.86、 49.34g/ml。 0031 3.2THHta 对 HCT116 裸鼠移植瘤生长的抑制作用 0032 将 HCT116 细胞接种于裸鼠皮下，当肿瘤形成且瘤块体积达到 100mm3左右时，按肿瘤体积将裸鼠随机分为对照组、 THHta 治疗组 (50mg/kg。

15、组、 100mg/kg 组 )。给药方案：腹腔注射给药，每周给药 5 天，间歇两天，连续给药 24 天。对照组给予体重相应的等体积溶剂 (含0.2DMSO的生理盐水)。实验期间每三天测量一次移植瘤体积参数并计算瘤体积，各说明书 CN 102406670 A CN 102406673 A3/5 页 5 组平均瘤体积见表 2。根据每次测量的移植瘤体积计算相对瘤体积 (RTV)，并进一步计算相应的相对肿瘤增殖率 (T/C )，见表 3。 0033 结果显示：治疗组 HCT116 裸鼠移植瘤的平均体积与对照组相比，在给药第 6 天后， 100mg/kg 组瘤体积小。

16、于对照组，具有显著的统计学差异 (P 0.01) ；在给药第 9 天至实验结束， THHta 两治疗组瘤体积均显著小于对照组 (P 0.01)。实验结束时，对照组、 THHta 低剂量、高剂量组移植瘤的平均体积分别是分组给药时肿瘤体积的 9.39 倍、 1.93 倍和 0.83 倍。THHta50mg/kg 组在给药后第 12 天开始相对肿瘤增殖率 (T/C ) 小于 40 ； THHta100mg/kg 组在给药后第 9 天开始 T/C 值小于 40。实验期间各时间点 T/C 值说明 THHta 能抑制 HCT116 移植瘤在裸鼠体内的增殖生长，且与时间和剂量呈依赖关系。 00。

17、34 表 1.MTT 法法测定 THHta 作用 48h 对以下 4 种肿瘤细胞的抑制率 (， n 8，) 0035 0036 注：与正常组比较， *P 0.05， *P 0.01 0037 表 2.HCT116 裸鼠移植瘤体积 (mm3) 0038 0039 注：与对照组比较， *P 0.05， *P 0.01 0040 表 3.THHta 治疗 HCT116 移植瘤的 RTV 及 T/C 值 0041 说明书 CN 102406670 A CN 102406673 A4/5 页 6 0042 注： T/C 40视为无效， T/C of 40，并经统计学处理 P 0.05 视。

18、为有效。相对肿瘤体积 (RTV) ；相对肿瘤增值率 (T/C) 0043 3.3 数据处理 0044 测得指标均用均数标准差表示，采用 SPSS12.0 软件包进行统计分析，组间比较用 F 检验，两两比较用 q 检验， P 0.05 为差异有统计学意义。 0045 4. 结语 0046 THHta 可显著抑制 MOLT-4、 HL60、 HCT116 及 PC3 肿瘤细胞增殖活性，且呈明显的剂量效应关系。THHta 能够抑制 HCT116 细胞裸鼠移植瘤生长，具有显著的体内抗肿瘤活性。 0047 实施例 1 ： 0048 取昆明山海棠去皮根 2kg，粉碎后过 10 目筛，。

19、用 10 倍量 61乙醇浸泡同时置于超声仪器中 3 小时，滤出药液，重复加入 10 倍量 61乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 30 HCl 调节 pH 到 2-3 之间，用相当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加入 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，再用相当量氯仿萃取 3 次，合并萃取液在 40-50旋转蒸发回收氯仿后得总生物碱 19.8g ； 0049 实施例 2 ： 0050 取昆明山海棠去皮根 100g，粉碎后过 10 目筛，用 10 倍量 69乙醇浸泡同时置于超声仪器中3小时，滤出药。

20、液，重复加入10倍量69乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 45 HC1 调节 pH 到 2-3 之间，用相当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加人 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，将该碱性液通过 C18 固相萃取装置，用水冲洗固相萃取装置 30 分钟，用 45乙醇冲洗，收集冲洗液后经旋转蒸发回收乙醇得总生物碱 0.97g ； 0051 实施例 3 ：说明书 CN 102406670 A CN 102406673 A5/5 页 7 0052 取昆明山海棠去皮根 100g，粉碎后过 10 目筛，用 10 倍量 65乙醇浸泡同时置于超声仪器中3小时，滤出药液，重复加入10倍量65乙醇两次，浸泡同时分别置于超声仪器中 2 小时和 1 小时，滤出药液后与第一次药液合并，浓缩。加 40 HCl 调节 pH 到 2-3 之间，用适当量的氯仿萃取 3 次，保留水相。加入 Na2CO3，调节 pH 到 9-11，将该碱性液通过 C18 固相萃取装置，用水冲洗固相萃取装置 30 分钟，用 50乙醇冲洗，收集冲洗液后经旋转蒸发回收乙醇得总生物碱 0.95g。说明书 CN 102406670 A 。

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