羟苯基甘氨酸的手性衍生物及其在药物活性成分合成中的用途 【技术领域】
本发明涉及羟苯基甘氨酸的新手性衍生物，特别是D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸及其衍生物，它的制备，以及在制造活性药物成分中的用途。
【发明背景】
E.K.Harvill和R.M.Herbst[J.Org.Chem.，9，21-30(1944)]公开了外消旋2-(2-羟苯基)甘氨酸，但是他们既没有说它的纯对映体也没有说它的手性衍生物。
外消旋混和物在合成药物活性成分的用途中，具有格外引人注目的缺点，在其工艺的步骤之一中，不得不进行拆分步骤来分离出所要求的光学异构体，一般来说，所述异构体之一可以是非活性或活性非常少的，而另一种存在着高的活性，有时，异构体之一可产生不需要的副作用。这些拆分步骤难以进行并且代价高昂。因此，从实用角度考虑，在可获得具有专一构型的最终手性产物的工艺中从合适的异构体起始是方便易行的。
发明概要
本发明提供一种羟苯基甘氨酸的新手性衍生物，以及它们的盐、溶剂化物或半溶剂化物，它具有D构型和通式(I)：其中R是氢，羟基，氯根，-NH2，-NHW，这里的W是C1-C4烷基或芳基，-OR，而R是C1-C4烷基；和Z是氢，-CONH2，-C(CH3)＝CHOOY，这里的Y是甲基或乙基。
这些式I化合物可用来制备药物，特别是β-内酰胺抗生素。
术语“C1-C4烷基”意指烷基部分具有1-4个碳原子，可为直链或支链。
术语“芳基”意指含有至少6个碳原子的芳族基团。
本发明还覆盖了式I化合物的金属盐，特别是其碱金属和碱土金属的盐，以及酸和碱的加成盐，特别是盐酸盐，和使用有机溶剂得到的溶剂化物或半溶剂化物。
优选地式I化合物中，
Z是氢且R是-OH；
Z是-C(CH3)＝CHCOOY，这里的Y是甲基或乙基，且R是-O-K+或O-Na+；
Z是-HCl且R是-Cl，与二噁烷成半溶剂化物；
Z是氢且R是-NH2，-NHW，这里的W是C1-C4直链烷基或是芳基；
Z是-H.HCl且R是-OR，这里的R是C1-C4直链烷基；以及
Z是-CONH2，R是-OH。
特别优选的化合物如下：
(a)D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸；
(b)D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸盐酸盐；
(c)D-(-)-N-1-(甲氧羰基丙烯-2-基)-α-氨基-α-(2-羟苯基)乙酸钾；
(d)D-(-)-N-1-(甲氧羰基丙烯-2-基)-α-氨基-α-(2-羟苯基)乙酸钠；
(e)D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸甲基酯盐酸盐；
(f)D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸酰胺。
通过下面反应路线所示的方法可得到这些式I化合物。
反应路线
如路线所示，在水杨醛(4)、氰化钠和碳酸铵之间通过Bucherer-Berg反应直接合成D，L-5-(2-羟苯基)-海因(3)时仅仅得到聚合产物。因此，必须利用间接途径，其中芳环的羟基被保护，为甲基醚[2-甲氧基苯甲醛(1)]。根据Henze和Speer所述方法(J.Am.Chem.Soc.，64，523(1942))，2-甲氧基苯甲醛(1)与氰化钠和碳酸铵之间的反应产生相应的甲氧基化的衍生物(2)。化合物(2)醚基用48％氢溴酸水解得到中等产率的D，L-5-(2-羟苯基)-海因(3)。为了通过酶催化途径得到D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸，可以使用相应的外消旋海因(3)，这将利用生物催化剂方法用D-(-)氨基酸水解，所述生物催化剂含有的酶具备海因酶和甲氨酰酶的活性。所述生物催化剂是一种微生物，诸如一些不同的微生物菌株，如放射形土壤杆菌[SergeRunser，Nicolas Chinksi和Eric Ohleyer，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1990)33：382-388]，成晶节杆菌[A.Mller，C.Syldatk，M.Schulze和F.Wager，Enzyme Microb.Technol.(1988)，Vol.10：618]或者假单胞菌属的种[K.Yokozeki，S.Nakamori，Ch.Eguchi，K.Yamada和K.Mitsugi，Argic.Biol.Chem.51(2)，355-362(1987)]。进行这些方法时，微生物可以游离或固定，使用本领域常规技术即可。另外，可用声处理或纯化的且固定的酶得到的酶提取物来构成生物催化剂。在生物体系的工作条件下，D，L-5-(2-羟苯基)-海因(3)自发地外消旋，因此，按照反应路线所示反应的顺序可得到完全转化的D-(-)-氨基酸。整个细胞的酶催化反应可在磷酸盐缓冲液中进行，PH控制在6.9-7.5之间，温度于35-45℃之间而优选39-42℃之间。海因的浓度可在3％-10％之间变化，优选3％。
如反应路线所示，将D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸(6)与碳酸钠或碳酸钾或者氢氧化钠或氢氧化钾，及乙酰乙酸甲酯或乙酯在水-醇介质中进行反应，可得到D-(-)-N-1-(烷氧羰基丙烯-2-基)-α-氨基-α-(2′-羟苯基)乙酸(7)的钠盐或钾盐。可使用低分子量的链烷醇类，诸如甲醇，乙醇，异丙醇，异丁醇等醇类。如果所用的碱是碳酸盐，之后可方便地将其筛去，因为它在水-醇介质中不溶。
按照Williams等人的方法[美国专利US 3925418(1974)]，在二噁烷中利用与光气的反应并用HCl气体下打开环酸酐(8)(Leuchs酸酐)可产生D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸(9)盐酸盐。该盐酸盐可作为半溶剂化物与二噁烷分开。简单讲，为得到化合物(9)，可将粒度小于200微米(μm)的氨基酸(6)以1∶10(w∶v)的比例悬浮在二噁烷中，并且使光气通过10分钟，以每摩尔氨基酸用1.8摩尔光气的总量通过。反应混和物加热到64℃，反应一旦完成，消除剩余光气并真空浓缩溶液。然后加入甲苯和二噁烷的混和物，使盐酸气流通过一小时。加入产品结晶的晶体以使它结晶是必要的。
另一种方法是将亚硫酰氯与二甲酰胺形成的加合物反应也可得到化合物(9)[R.Maggi等人，意大利专利IT 22323A/79]。为此，在二噁烷中于10℃以下将事先制备的加合物加到氨基酸盐酸盐(6)中。一旦添加完成，将其经15分钟加热到20-30℃。上述情况中加入晶种以得到最终产物是必要的。
为制备其中R1是1-4碳原子烷基的式(10)类型的酯，可以通过常规方式直接从手性氨基酸(6)原料起始，例如，用溶于相应醇中的亚硫酰氯，或者通过氯化物盐酸盐(9)与相应的醇类反应。
最后，通过使用化学或酶手段可以得到D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酰胺(11)。使用化学手段时，可用相应的氨基酸(6)甲酯或乙酯与铵的水溶液反应[J.of Organic Chemistry，52，4379(1987)；Org.，Syn.Coll.，vol.4，516-536(1955)]，或者与氨和氯化铵的混和物反应[Org.，Syn.Coll.，vol.4，486(1963)]。当式(11)化合物中R2是1-4碳原子烷基时，可用D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸(9)氯化物盐酸盐与相应的胺反应来直接制备该化合物。
可利用酶手段从外消旋酰胺通过与带有氨肽酶活性的生物催化剂反应来得到D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酰胺(11)。所述这种生物催化剂可由游离或固定的微生物构成，它们含有L-氨肽酶活性，诸如属于假单胞菌属putida菌的菌株[Roos，E.C..Mooiweer，H.H.；Heimstra，J.J.，Org.Chem.(1992)，57，6769]，在这种情况下，带有L-氨肽酶活性假单胞菌属putida菌新鲜细胞(新发酵)的悬浮液可在磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.0)条件下添加到外消旋酰胺溶液中。4小时后，用苯甲醛处理将D-酰胺与L-氨基酸分开。这种方法的另一个选择方案中，所述生物催化剂由带有L-氨肽酶活性的酶提取物构成，或者由带有所述活性的纯化酶构成[Meijer，E.M.；Boesten，W.H.J.；Schoemaker，H.E.；和vanBalken，J.A.M.；等人，Biocatalysts in Organic Synthesis，Elsevier，Amsterdam，(1985)，135-156]，优选固定的酶。
通过本领域常规方法可得到式(I)化合物的碱金属和碱土金属盐。
本发明提供新的手性羟苯基甘氨酸衍生物，诸如D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸(6)和D-(-)-酰胺，D-(-)-N-氨甲酰基，D-(-)-酯和D-(-)-氯化物盐酸盐类型的其他衍生物。这些式(I)化合物可用作中间体来制备新范围的β-内酰胺抗生素，方法是通过用氯化物盐酸盐或Dane盐(D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸的钠盐或钾盐与乙酰乙酸甲酯或乙酯反应得到的烯胺)[Dane等人，Ang.Ch.Interna t.Ed.1，658(1962)]与6-APA、7-ACA和7-ADCA的核进行化学酰化，或者通过酰胺或酯与相应的青霉素或头胞菌素环的酶催化反应。这些化合物的R构型是优选的，如已证实的，当抗生素中侧链的构型是R时，其生物活性大于相应的S构型衍生物。
实施例1
D，L-5-(2-甲氧苯基)-海因(2)
4克(0.0293摩尔)2-甲氧基苯甲醛、9.1克(0.948摩尔)碳酸铵和2.6克(0.0399摩尔)氰化钾的混和物悬浮在50ml的50％甲醇-水混和物中。将反应混合物在50-60℃维持3小时，使其完全溶解。利用旋转蒸馏装置去除甲醇后，残留物用50ml水稀释，加热直至再溶解，活性炭处理并缓慢留下结晶。得到超过2-甲氧基苯甲醛85-90％的产率。其熔点(189℃)与文献的相符(Harvill和Herbst；上面已述)。
实施例2
D，L-5-(2-羟苯基)-海因(3)
6克D，L-5-(2-甲氧苯基)-海因悬浮在30ml 48％的氢溴酸内。将悬浮液置于中等回流条件下2-3小时，得到完全溶解。随后利用高分辨液相色谱(HPLC)[HP柱125×4，流量1.8ml/min；λ＝212nm；洗脱：磷酸盐缓冲液/甲醇(90/10)，pH＝2.5]进行反应，直至甲氧基衍生物消失。冷却后过滤，得到56％产率的白色膏状物，熔点243℃(手册记载：240-244℃，分解)[Harvill和Herbst；上面已述]。
IR(KBr的压片)λ＝3349(f)，3252(f)，3038(f)，2762(m)，1716(f)，1596(m)，1458(m)，1429(m)，1363(m)，1194(m)，748(f)cm-1。
实施例3
酶方法得到D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸(6)
将3％浓度的D，L-5-(2-甲氧苯基)-海因(3)放入磷酸盐缓冲液，pH＝8。之后按照以下等式放入生物催化剂(完整的土壤杆菌属radiobacter细胞)：其中Rs是干的残留物而Ra是测量的生物基质的专一活性(此种情况下是用16小时内产生65％转化率的海因克数和干残留物克数的比例定义的)。其进行温度为40℃。整个反应的pH保持在7.5。
利用HPLC[HP柱125×4，流量1.8ml/min；λ＝212nm；洗脱：磷酸盐缓冲液/甲醇(90/10)，pH＝2.5]观察到反应在48小时后结束。
反应混合物用98％的硫酸酸化到pH＝0.5，生物菌通过过滤分离或者通过离心分离。上清液浓缩至大约20％的氨基酸浓度。随后，用50％的氢氧化钠中和至pH＝4.3-4.5。出现第一种沉淀，是氨基酸和硫酸盐的混和物。过滤后母液用甲醇处理，大多数的盐沉淀出来。以旋转蒸馏浓缩甲醇/水混和物至干。将两部分沉淀出并于热的纯甲醇中再溶解。最后残留的盐消失后，过滤甲醇并干燥。相对起始海因的产率是95％。
旋光度(c＝1，HCl 1N)＝-1580
熔点(未校准)＝193-194℃。
原-氨基-酸的结构与所进行的谱线测定相符：
质谱(FAB技术)：分子离子m/e 167。
1H NMR(DMSO-d6)δ＝12ppm(sa，COOH)；10(sa，1H，OH)，8.8(sa2H，NH2)，6.7-7.2(m，4H，邻位体系的芳香氢)，4.6(s，CH).
氨基酸与氰化钾的反应可制备中间体氨甲酰基衍生物[T.Suzuki，K.Igarishi，K.Hass和K.Tuzimura，Agr.Biol.Chem.，37，(2)，41-416，(1973)]，它的谱线特征：
质谱(FAB技术)：421.2(2M++1)，211.1(M++1)，168.1；154.1；136.1；79
IR(净)λ＝3950，3340，1675，1534，1450，1375，1290，1110cm-1
13C NMRδ＝173.51c；158.57c；155.107c；129；125.2c；119.19；115.69；52.061.
1H NMRδ＝12.4ppm(sa，COOH)；9.8(sa，OH)，6.7-7.2(m，芳香氢)，6.5(d，NH，J＝7.3Hz)；5.7(s，NH2)；6.35(d，CH，J＝7.3Hz)。
实施例4
D-(-)-N-1-(甲氧羰基-丙烯-2-基)-α-氨基-α-(2-羟苯基)乙
酸的钾盐(DANOTO)(7)
200ml无水异丙醇(KH＜0.5％)置于500ml体积的烧瓶内并将20克的D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸悬浮其中。随后，加入7.76克过筛的99.5％碳酸钾(200μm目)，14.4ml的乙酰乙酸甲酯和1ml2-乙基己酸。反应在70℃保持5小时，使其得到完全溶解。趁热用滤纸过滤残留的混浊物。透明溶液冷却到20℃并过滤。最后用100ml异丙醇洗涤。于70℃真空干燥所得产物。干重：30.8克。产率：85％。
旋光度(c＝4，水)＝-870
核磁共振谱线与标题结构相符。
1H NMR(DMSO)δ＝9.35(d，NH，J＝12Hz)；6.7-7.1(m，4H，芳环)，5(d，CH，J＝12Hz)；4.4(s，＝C-H)；3.5(s，OCH3)，1.55(s，CH3)。
实施例5
D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸氯化物盐酸盐(9)
按照Willams等人的步骤(US 3925418，上面已述)得到二噁烷半溶剂化物的氯化物盐酸盐，产率87％。利用与甲醇苏打的电势评估，产物长度大于95％。
旋光度：(c＝1，甲醇)＝-1170
实施例6
D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸甲酯盐酸盐(10)
从氯化物盐酸盐(9)得到标题化合物。为此，D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸氯化物盐酸盐再悬浮于氯仿(1∶10w.v.)中，经2小时慢慢添加无水甲醇，使摩尔超过3∶1。一旦添加完成，使反应再回流2小时。然后蒸除过量醇。然后过滤产物并用氯仿洗涤。对对起始氯化物盐酸盐的产率超过98％。
旋光度：(c＝1，甲醇)＝-1250
1H RMN(D2O)δ＝7.2-6.1ppm(m，芳香H)；4.72(s，CH)，3.7(s，OCH3)。
质谱(FAB技术)＝分子离子m/e 217.5。
实施例7
D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酰胺(11)
D-(-)-2-(2-羟苯基)甘氨酸甲酯盐酸盐(10)于0℃溶解在25％氨水。氨水对所添加的酯的摩尔比必须超过3∶1。在此温度2小时后，用乙酸乙酯提取产物。硫酸钠干燥有机提取相，真空蒸去溶剂。得到相对所添加酯超过70％产率的酰胺，基本没有游离的氨基酸。
旋光度(c＝1，HCl 1N)＝-1270
1H NMR(DMSO)δ＝9.8ppm(sa，OH)；7.5(s，CONH2)，7(s，NH2)；6.7-7.1(m，芳香氢)；4.6(s，CH)。