《一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103435690 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103435690 A *CN103435690A* (21)申请号 201310417993.8 (22)申请日 2013.09.13 C07K 14/18(2006.01) C12N 15/51(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 章晓联 闵远琴 (74)专。
2、利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 (54) 发明名称 一种丙型肝炎病毒的 DNA 疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种丙型肝炎病毒的 DNA 疫苗 及其制备方法， 属于分子生物学和感染免疫领域。 本发明的 DNA 疫苗是 HCV-E2 的第 2 个 N- 糖基化 位点产生突变， 即 N423RT 突变为 D423RT。该突变 体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 在 E2基因两 端引入 CpG 序列， 并将突变的片段构建到真核表 达载体上即得到能产生E2 突变体的DNA 疫苗。 本 发明方法简便， 成本低， 制备的 D。
3、NA 疫苗可诱导产 生比野生型 HCVE2 更强的特异性细胞免疫和中和 性抗体， 特异性的杀伤性 CD8+T 活性增强， 并能够 引起较强的 IFN-、 IL4 释放， 有效地中和病毒进 一步感染， 克服了糖基化蛋白质在表达上的困难。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103435690 A CN 103435690 A *CN103435690A* 1/1 页 2 1. 一种 HCV 包膜糖蛋白 E2 。
4、突变体， 其特征在于 ： 包膜糖蛋白 E2 的第 2 个 N- 糖基化位 点发生突变， 即 N423RT 突变为 D423RT。 2.根据权利要求1所述的HCV包膜糖蛋白E2突变体， 其特征在于 ： 其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。 3. 编码权利要求 1 或 2 所述的 HCV 包膜糖蛋白 E2 突变体的基因， 其特征在于 ： E2 基因 序列的 N- 糖基化位点的核苷酸发生了突变。 4. 根据权利要求 3 所述的基因， 其特征在于 ： 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 5. 根据权利要求 3 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因的 N 端引入了菌源性非甲基化 C。
5、pG 序列。 6. 根据权利要求 5 所述的基因， 其特征在于 ： 所述的 CpG 序列为 GACGTT。 7. 一种产生权利要求 1 或 2 所述的的 DNA 疫苗， 其特征在于 ： 包含真核表达载体和权 利要求 3-6 任一项所述的基因。 8. 根据权利要求 7 所述的 DNA 疫苗， 其特征在于 ： 所述的真核表达载体为 pCDNA3.1。 9. 权利要求 7 或 8 所述的 DNA 疫苗的制备方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 在 HCV E2 基因两端引入CpG序列以及酶切位点， 将该片段构建到载体上， 再用定点突变PCR方法将E2 上相应的 N- 糖基化位点的突变， 将突变的片段构。
6、建到真核表达载体。 10. 根据权利要求 9 所述的制备方法， 其特征在于 ： 使用引物 CpG-sE2-F 和 sE2-R 扩 增 E2 基因 ； 使用引物 CpG-sE2-f、 E2N2-Ur 扩增含点突变序列的上游片段， 用引物 E2N2-Df、 sE2-R 扩增含点突变序列的下游片段 ； 再使用 CpG-sE2-F 和 sE2-R 以上游片段和下游片段 为模板扩增得到 E2 第 2 个 N- 糖基化位点突变的片段， 将该片段构建到 pCDNA3.1 上， 得到 产生如 SEQ ID NO.1 所示序列的 E2 突变体的 DNA 疫苗 ； 其中， 所述引物序列如下 ： CpG-sE2-f。
7、 ： CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG， sE2-r ： GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC， E2N2-Df ： TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC， E2N2-Ur ： GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。 权 利 要 求 书 CN 103435690 A 2 1/7 页 3 一种丙型肝炎病毒的 DNA 疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学和感染免疫领域， 具体涉及一种丙型肝炎病毒的 DNA 疫苗 及其制备方法。 背景技术 0002 丙型肝炎病毒 （hepati。
8、tis C Virus,HCV） 感染是导致慢性肝炎、 肝癌、 肝硬化的主 要因素之一， 严重影响人类健康， 我国是 HCV 高感染率国家之一， 目前的治疗手段有限， 尚 无有效的治疗和预防性 HCV 疫苗。 0003 HCV为单链正义RNA病毒， 其基因表达产物为含3011个氨基酸的多聚蛋白， 经蛋白 酶剪切后形成多种蛋白 （核衣壳蛋白 Core、 包膜蛋白 E1 和 E2 ； 离子通道蛋白 P7 ； 非结构蛋 白 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B）（Pwalotsky JM,Gastroenterology,2002,122(6):1554 -1568） 。。
9、 E2蛋白对应于多聚蛋白链中的氨基酸序列是384746氨基酸。 HCV包膜糖蛋白为 病毒外壳的主要成分， 在感染中发挥着重要的作用 ： 参与病毒蛋白粒子的装配、 与肝细胞表 面受体结合相互作用介导病毒进入， 并且， E2 是诱导中和抗体的主要抗原区， 故 HCV E2 区 及其编码的抗原是 HCV 疫苗研究的重点 （Fournillier,et al.J.Virol,2001;75:12088） ， 此外， E1、 E2 含有 T、 B 细胞表位， 可以诱导保护性免疫反应， 是保护性抗原。 0004 E2 是高度糖基化的蛋白， 糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节， 可以诱导蛋 白空间构象正确。
10、折叠， 增加蛋白的酶亲水性， 稳定性， 并且可以调节蛋白的抗原性。E2 上含 有11个N-糖基化位点， 并且尽管不同基因型HCV中包膜蛋白E2的氨基酸序列具有可变性， 这些糖基化位点却是高度保守的 （Goffard,A et alJ.Virol,2005,79:8400-8409;Slate r-Handshy et al,Virology,2004,319(1):36-48） ， 这意味着这些糖基化修饰是HCV生活周 期中起重要作用。对这些聚糖的功能分析表明 ： 糖基化修饰在蛋白质折叠、 HCV 进入中起关 键作用， 同时寡糖链可以保护病毒的包膜蛋白被宿主细胞的蛋白酶降解， 还可以遮蔽病毒 。
11、抗原， 使机体不能有效识别病毒， 保护病毒抵抗抗体中和作用， 例如 ： E2 上 423 和 448 （E2N2 和 E2N4） 位糖基化位点突变明显减少 HCVpp（HCV 假病毒） 的感染性， 417， 532 和 645 位的 糖基化修饰 （E2N1， E2N6 和 E2N11） 能够保护 HCVpp 以及 HCVcc（HCV cell culture， 细胞培 养病毒） 抵抗抗体的中和作用 （Reviewed by Helle,viruses,2011） 。另一方面， 通过除去 病毒包膜蛋白的糖苷还可以改变蛋白的免疫原性， 研究表明， E1 的 209 位糖基化位点突变 后， 可以诱导。
12、更强的细胞免疫反应， 305 位突变可增强体液免疫， E2 的 576 位突变可显著增 强特异性细胞免疫反应。但是 E2 上与中和性抗体表位惜惜相关的糖基化修饰位点 N1/N2/ N4/N6/N11 去除后能否在体内诱导产生抗 HCV 中和抗体 （neu-IgG） 仍不清楚， 并且这些位点 中 N- 聚糖删除能否在体内介导产生强的细胞免疫反应国内外均未见报道。 0005 E2对HCV整个生命周期至关重要， 然而至今仍无针对HCV E2的小分子药物或者有 效的广泛性中和抗体， 对 HCV 的治疗手段非常有限。利用经典的蛋白免疫获得抗体的方法 在实际应用中困难重重， 一方面要获得真核表达的含完整糖。
13、基化修饰的 E2 蛋白 （ 70KD） 产量极低且纯化困难， 而采用原核表达系统获得的 E2 蛋白仅有 35KD， 缺乏糖基化修饰， 说 明 书 CN 103435690 A 3 2/7 页 4 不能保持原有的构型， 以此作为抗原缺乏一些关键的抗原表位， 另一方面， HCV E2 蛋白的免 疫保护性较低， 需要进一步改造。利用 DNA 疫苗可以在基因水平方便的对抗原进行某些改 造， 并且制备方法简单。DNA 疫苗已经广泛地应用于乙型肝炎病毒， 狂犬病毒和人类获得免 疫缺陷病毒的预防和治疗中。它的基本原理是将编码抗原的基因片段直接通过肌肉注射 或基因枪等方法直接导入宿主体内， DNA 转入体内后。
14、即可表达相应的蛋白抗原， 其中， 内生 （源） 性蛋白抗原经 MHC 类途径呈递， 诱导产生细胞毒性淋巴反应 （CTL） 效应性 CD8+T 细 胞， 而可溶性抗原蛋白释放到细胞外后， 被专职抗原递呈细胞 （APC） 摄取， 然后经 MHC 类 途径呈递， 活化 CD4+T 细胞， 及其随后产生抗体的 B 细胞活化， 因此 DNA 免疫可全面诱导机 体的免疫反应。在制备 DNA 疫苗时还可引入菌源性的非甲基化 CpG DNA 作为佐剂， 它是指 以 CpG 为核心的寡核苷酸序列， 主要是通过与 TLR9 识别发挥免疫促进作用， 具有增强巨噬 细胞， DC 细胞以及 B 细胞的功能， 激活小鼠免。
15、疫细胞的最佳 CpG 序列为 GACGTT， 激活人免疫 细胞的最佳 CpG 序列为 GTCGTT(reviewed by M.Krieg)。 发明内容 0006 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种具有更强免疫保护 性的 HCV 包膜糖蛋白 E2 突变体以及编码该突变体的基因。 0007 本发明的另一目的在于提供产生上述突变体的 DNA 疫苗。 0008 本发明的再一目的在于提供上述 DNA 疫苗的制备方法。 0009 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0010 一种 HCV 包膜糖蛋白 E2 突变体， 其第 2 个 N- 糖基化位点发生突变， 即 N423RT 突 。
16、变为 D423RT， 使 N 糖基化修饰不能进行， 所述的突变为将天冬酰胺突变为天冬氨酸 ； 所述的 HCV 包膜糖蛋白 E2 突变体的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0011 编码上述 HCV 包膜糖蛋白 E2 突变体的基因， E2 基因序列的 N- 糖基化位点的核苷 酸发生了突变， 突变为能编码天冬氨酸的核苷酸。 0012 优选的， 编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的HCV包膜糖蛋白E2突变体的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0013 上述基因的 N 端还引入了菌源性非甲基化 CpG 序列， 较佳的 CpG 序列为 GACGTT。 0014 。
17、一种产生上述突变体的 DNA 疫苗， 包含真核表达载体和上述基因 ； 所述的真核表 达载体优选为 pCDNA3.1。 0015 上述 DNA 疫苗的制备方法， 包括如下步骤 ： 在 HCV E2 基因两端引入 CpG 序列以及 酶切位点， 将该片段构建到载体上， 再用定点突变 PCR 方法将 E2 上相应的 N- 糖基化位点突 变， 将突变的片段构建到真核表达载体上即得到所述 DNA 疫苗。 0016 优选的， 使用引物 CpG-sE2-F 和 sE2-R 扩增 E2 基因， 在 E2 基因两端引入 CpG 序列 及酶切位点 BamH 、 Hind ； 使用引物 CpG-sE2-f、 E2N2。
18、-Ur 扩增含点突变序列的上游片 段， 用引物 E2N2-Df、 sE2-R 扩增含点突变序列的下游片段， 再使用 CpG-sE2-F 和 sE2-R 以上 游片段和下游片段为模板扩增得到 E2 第 2 个 N- 糖基化位点突变为天冬氨酸的片段， 将该 片段构建到 pCDNA3.1 上， 得到产生如 SEQ ID NO.1 所示序列的 E2 突变体的 DNA 疫苗 ； 其 中， 所述引物序列如下 ： 0017 CpG-sE2-f ： CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG， 说 明 书 CN 103435690 A 4 3/7 页 5 0018 sE2-r ：。
19、 GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC， 0019 E2N2-Df ： TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC， 0020 E2N2-Ur ： GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。 0021 本发明具有如下优点和效果 ： 本发明的HCV包膜糖蛋白E2突变体可诱导产生比野 生型 HCV E2 更强的特异性细胞免疫 （CTL） 和中和性抗体 （neutralizing antibody,NAb） ， 特异性的杀伤性 CD8+T 活性增强， 并能够引起较强的 IFN-、 IL4 释放， 因而可以有效地清 除病毒， 在体外能有效地中和病毒感。
20、染。本发明方法简便， 成本低， 制备的 DNA 疫苗以真核 表达质粒DNA为免疫原， 直接偶联CpG佐剂联合免疫， 克服了糖基化蛋白质在原核和真核表 达上的困难， 有效地中和病毒进一步感染。 附图说明 0022 图 1 是免疫后小鼠血清中 E2 特异性抗体的滴度结果图。 0023 图 2 是免疫印迹检测免疫后小鼠血清中和抑制 HCV 的 NS3 的表达结果图。 0024 图 3 是乳酸脱氢酶释放实验检测小鼠细胞毒性 T 细胞特异性杀伤活性的结果图， 横坐标表示效靶细胞的比例。 0025 图 4 是酶联免疫斑点法检测免疫后小鼠脾脏中淋巴细胞免疫水平结果图 ； 其中， A ： 淋巴细胞释放 IFN。
21、- 的水平， B ： 淋巴细胞释放 IL4 的水平。 具体实施方式 0026 以下实施例用于进一步说明本发明， 但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0027 实施例 1 0028 构建分泌型糖基化单点缺失突变的 E2 突变体的真核重组质粒 0029 利用 PCR 从 1a 型 HCV 基因组序列 （基因序列号为 GenBank Acc.No.AY958062） 中 扩增出可表达分泌型 E2 蛋白 （Secreted E2,sE2） 的 E2 的基因序列， 同时在该序列 N 端起 始密码子 （ATG） 上游引入菌源性非甲基化 C。
22、pG 序列 （GACGTT） ， 进一步将该片段构建到真核 表达载体 pcDNA3.1(-)（Invitrogen） 上。再通过 PCR 定点突变方法将 sE2 上第 2 个 N- 糖 基化位点 （N423RT） 的天冬酰胺突变为天冬氨酸 （D423RT） ， 获得重组质粒分别命名为平 N2。 0030 本实施例中所用到的引物如下表所示 ： 0031 0032 （表中斜体示酶切位点， 加下划线部位为菌源性非甲基化 CpG 序列， 小写字母示定 点突变位置） 。 说 明 书 CN 103435690 A 5 4/7 页 6 0033 其 中， 通 过 CpG-sE2-F 和 sE2-R 用 来 。
23、构 建 引 入 CpG 的 sE2 的 野 生 型 质 粒 pcDNA3.1-sE2， 即WT。 野生型质粒pcDNA3.1-sE2作为模板， 以CpG-sE2-f引物搭配点突变所 在位置下游引物 （Ur） 经 PCR 获得包含点突变序列的上游片段， 以 sE2-r 引物搭配点突变所 在位置上游引物 （Df） 获得包含点突变序列的下游片段， 最后通过上下游片段 overlap PCR 获得包含该点突变的全长基因。将包含突变位点的全长基因片段构建到 pcDNA3.1(-) 上， 即得到相应的 N- 糖基化位点突变质粒 N2。 0034 PCR 反应体系如下 ： 0035 含 N2 突 变 位 点。
24、 的 上 游 产 物 获 取 ： pcDNA3.1-sE21ng， 10mM dNTPs2L， 10M CpG-sE2-F1L， 10uM E2N2-Ur1L， 10Pfu buffer5L， 1.25U/L Pfu 酶 1L， ddH2O39L ； 0036 含 N2 突 变 位 点 的 下 游 产 物 获 取 ： pcDNA3.1-sE21ng， 10mM dNTPs2L， 10M sE2-R1L， 10uM E2N2-Df1L， 10Pfu buffer5L， 1.25U/L Pfu 酶 1L， ddH2O39L ； 0037 反应条件为 ： 94 2min ； 94 30s， 60 3。
25、0s， 72 2min， 30 循环 ； 72 7min。 0038 全长 PCR 产物的获取 ： 含 N2 突变位点的上游产物 1L+ 下游产物 1L， 10mM dNTPs1L， 10M CpG-sE2-F1L， 10M sE2-R1L， 10Pfu buffer5L， 1.25U/L Pfu 酶 1L， ddH2O39L ； 反应条件为 ： 94 2min ； 94 30s， 60 30s， 72 2min， 30 循环 ； 72 7min。 0039 质粒的构建过程 ： 将扩增得到的 sE2 片段或有位点突变的 sE2 片段通过酶切位 点 BamH 、 Hind 连接到 pcDNA3.。
26、1(-) 上， 用连接产物转化 DH5， 提取质粒 ； 重组质粒经 PCR、 酶切及测序鉴定正确后表明质粒构建成功。 0040 实施例 2 0041 材料准备以及小鼠免疫过程 0042 采用 OMEGA Biotek 公司的无内毒素的质粒 DNA 抽提试剂盒 （Endo Free Plasmid MaxiKit） ， 获得重组的 sE2 野生型质粒 pcDNA3.1-sE2（WT） 以及 N- 糖基化位点突变体质粒 N2， 进行浓度测定并调整各组质粒浓度至2g/L。 进一步用鳌试剂 （湛江安度斯生物有限 公司） 检测所得重组质粒中内毒素残留量， 检测结果显示所得质粒DNA中内毒素含量均小于 0。
27、.06Edotoxin Unit/g DNA， 符合基因治疗用质粒 DNA 制品的细菌内毒素残留量标准 （小 于 0.1EU/g） 。 0043 原核表达 sE2 蛋白的制备 ： 利用分子克隆的技术将 HCV 基因组上第 384-661 个碱 基构建到原核表达载体 pET28a 载体上 （Invitrogen） ， 所表达的蛋白为去掉信号肽和 C 端 疏水区的 sE2 蛋白， 分子量为 34KD（真核表达时信号肽最终会被切除， 而原核表达时细菌 中无此机制， 此外信号肽和 C 端的疏水区高度疏水， 不利于可溶性蛋白的获取， 因此此处 去掉信号肽和 C 端疏水区） 。将该重组质粒转化入 BL21。
28、 菌株中大量表达 sE2 蛋白， 并通过 NI-NTA（Invitrogen） 纯化所得蛋白， 经 Sigma 公司的去内毒素试剂 （Endotoxin Removal Solution） 去除内毒素。 0044 免 疫 剂 量 以 及 分 组 ： 实 验 分 为 四 组， 即 载 体 pcDNA3.1(-)、 野 生 型 质 粒 pcDNA3.1-sE2WT、 突变体质粒 N2， 并用 PBS（0.01M pH7.4） 做阴性对照。每组设 6 只小鼠， 处理剂量为每只小鼠 50g 质粒以及 500U IL-2（免疫佐剂） ， 总体积为 50L， 通过基因导 入仪将不同质粒或PBS分别导入小鼠。
29、大腿肌肉内， 每2周一次， 共免疫三次， 两周后用20g 说 明 书 CN 103435690 A 6 5/7 页 7 原核表达 sE2 蛋白加强免疫一次， 最后一次免疫后 2 周处死小鼠检测相应指标， 具体如下 ： 0045 （1） DNA 疫苗免疫小鼠抗血清抗体效价比较 0046 眼球采血， 并制备小鼠血清， 酶联免疫吸附法 （ELISA） 检测针对 E2 蛋白的抗体效 价 ： 使用原核表达 sE2 蛋白 （浓度 ： 5g/mL） 包被 96 孔 ELISA 板子， 每孔 100L， 37 1 小 时。载体 pcDNA3.1(-)、 野生型质粒 pcDNA3.1-sE2WT、 突变体质粒 。
30、N2 以及 PBS 组血清分 别按照 1:400， 1:800， 1:51200 做倍比稀释后加入 96 孔板， 4湿盒中孵育过夜， PBST （PBS 缓冲液 +0.05%Tween20） 洗板三次后加入 1:6000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗 鼠二抗 （HRP-goat anti mouse IgG， Thermo 公司） ， 37孵育 1 小时， PBST（PBS 缓冲液 +0.05%Tween20） 洗板三次后加入 TMB 显色液 （碧云天） 显色 5 分钟后用 2M 浓硫酸终止显色 反应。酶标仪于 OD490 吸光度处读处板， 按照实验组 OD490的数值为 PBS 阴性对照孔。
31、两倍以上的 最高稀释倍数定为该组的抗体滴度。实验结果显示 （见图 1） ， N2 免疫后小鼠能增强血清抗 体滴度。 0047 （2） 中和性抗体的检测 （免疫印迹法， 即抑制病毒感染后检测病毒蛋白含量变化） 0048 将处于对数生长期的 Huh7.5.1 细胞铺入 24 孔板， 每孔 2105细胞， 次日长到 80% 汇合度。将载体 pcDNA3.1(-)、 野生型质粒 pcDNA3.1-sE2WT、 突变体质粒 N2 以及 PBS 组小 鼠的血清用 DMEM 培养基按照 1:200 的比例稀释后， 与 5106拷贝的 HCVcc 在 37共孵育 1 小时， 反应体系为 200L， 感染上述铺。
32、好的 Huh7.5.1 细胞， 同时设置只添加等体积 DMEM 的培养基对照组， 以及不含免疫小鼠血清只添加培养基和病毒的阳性对照组。37作用 6 小时后将Huh7.5.1细胞换为正常的完全培养基 （DMEM+10%FBS） ， 继续培养72小时后收获细 胞提取细胞的总蛋白， 并定量后， 进行 SDS-PAGE 和免疫印记 （western blot） 检测病毒蛋白 NS3 的表达情况 （以肌动蛋白 -actin 为内参） 。结果如图 2 所示， 与野生型 HCV sE2 组相 比， N2 组免疫小鼠的血清对 HCVcc 感染有更明显的中和作用。 0049 （3） CD8+T CTL 特异性杀。
33、伤活性的检测 0050 上述免疫后的小鼠处死后， 用淋巴细胞分离液分离脾细胞， 进行细胞计数， 调整 细胞浓度到 1107个 /mL， 作为效应细胞 （Effect cells,E） 。稳定转染野生型 E1E2 融合 基因的 CT26 细胞 （小鼠结肠癌细胞， ATCC 号为 ： CRL-2638）为靶细胞 （Target cells,T） （Liu M,et al.Vaccine2007,6572-6580） ， 调整细胞浓度为 1105个 /mL。设定效靶细胞 的比例 （E:T） （效应细胞与靶细胞的比例） 为 25:1、 10:1、 5:1、 2.5:1， 按照 Promega 公司的 。
34、CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay 试剂盒 （货号 ： G1780） 通过乳酸脱氢 酶释放实验 （LDH 实验） 检测 CD8+TCTL 特异性杀伤活性。具体步骤如下 ： 0051 1） 免疫小鼠脾脏细胞的制备 （效应细胞） 0052 1.1） 小鼠无菌剪开腹腔， 取出脾脏， 置于装有无血清 RPMI1640 培养液的小皿中， 钢网研磨成细胞悬液， 经 200 目尼龙网过滤 ； 0053 1.2） 滤液 300g 室温离心 5 分钟， 弃上清 ； 0054 1.3） 沉淀加入 pH7.2 的 Tris-NH4Cl5mL， 毛细吸管吹打混匀， 37。
35、水浴 1 分钟， 以 破除红细胞 ； 300g 离心 5min， 用无菌 PBS（0.01M， pH7.4） 洗涤一次 ； 0055 1.4）细胞沉淀用含 5%FBS 的 RPMI1640 培养基悬浮， 定容计数， 调细胞浓度至 1107/mL， 备用。 0056 2） 稳定表达 E1E2 的 CT26 细胞的准备 （靶细胞） 说 明 书 CN 103435690 A 7 6/7 页 8 0057 将 在 培 养 瓶 中 生 长 至 90% 融 合 的 CT26 细 胞 用 PBS 洗 涤 一 次，用 0.25%Trypsin-EDTA 消化， 定容计数后调整细胞浓度为 1105个 /mL 备。
36、用。 0058 3） LDH 实验检测小鼠细胞毒性 T 细胞 （CTL） 杀伤活性 0059 3.1） 将效应细胞按照2.5106个/mL、 1106个/mL、 0.5106个/mL、 2.5105个 /mL 的浓度加入到 96 孔板中， 100L/ 孔 ； 0060 3.2） 靶细胞为稳定表达 E1E2 的 CT26 细胞， 浓度为 1105个 /mL， 100L/ 孔 ； 0061 3.3） 同时设置靶细胞自然释放孔， 靶细胞最大释放孔， 效应细胞自然释放孔等 ； 0062 3.4） 将 96 孔培养板 250g 离心 4min， 以混匀效靶细胞， 37培养 4 小时 ； 0063 3.5。
37、） 加入试剂盒中提供的 10L 裂解液 （10lysis buffer） 到靶细胞孔中， 此为 最大 LDH 释放组 ； 加入 10L 裂解液 （10lysis buffer） 到 RPMI-1640 培养液中， 此为体 积校正组， 继续培养 45 分钟 ； 0064 3.6） 250g 离心 4min， 每孔吸取 50L 上清到酶标板相应孔中 ； 0065 3.7） 解冻稀释液， 恢复至室温后， 加入底物瓶内， 混匀后， 每孔加 50L 稀释底物， 37孵育 10min， 每孔加入 50L 终止液， 1 小时内读板。 0066 3.8） 特异性杀伤效率按以下公式计算 ： 0067 特异性杀伤。
38、率 （%） （实验组释放实验组自发释放靶细胞自发释放） / 靶细胞 最大释放靶细胞自发释放） 100%。 0068 结果如图 3 所示， E2N- 糖基化位点突变体免疫小鼠后增强了小鼠的 CTL 特异性杀 伤活性， 其中 N2 诱导产生的 CTL 活性最高， 与 WT 相比有显著性差异 （*p0.05） 。 0069 （5） 免疫后小鼠脾脏细胞释放 HCV E2 特异性细胞因子 IFN- 及 IL4 的检测 （酶联 免疫斑点实验法 （ELISPOT） ） 0070 将上述免疫后的小鼠处死后， 用淋巴细胞分离液分离脾细胞， 进行细胞计数， 调整 细胞浓度到 3106个 /mL， 按照达科为公司的。
39、 ELISPOT 试剂盒 （货号 ： G1780） 检测脾脏细胞 释放的细胞因子的水平。具体步骤如下 ： 0071 5.1） 免疫小鼠脾脏细胞的制备同上 ； 0072 5.2） 200L/ 孔 1640 培养基活化试剂盒中所提供的预包被有 IFN- 或 IL4 捕捉 抗体的 96 孔板， 室温放置 5-10min ； 0073 5.3） 弃去培养基， 加入 3105/100L 脾细胞悬液， 同时设阳性对照组加入刺激物 植物血球凝聚素 PHA（工作浓度 8g/mL， ） ， sE2 蛋白 （工作浓度 5g/mL） 刺激组， 无刺激物 对照组 ； 0074 5.4） 37、 5%CO2培养箱中静置。
40、培养 30 小时 ； 0075 5.5） 弃去培养液， 加入冰冷的双蒸水， 200L/ 孔， 置于 4 10min 以裂解细胞 ； 0076 5.6） 弃去上清， 试剂盒中所附 wash buffer 洗板 5 次， 每次 1min， 最后一次在滤纸 上拍干 ； 0077 5.7） 加入 100L/ 孔试剂盒所附 IFN- 或 IL4 检测抗体， 37孵育 1h ； 0078 5.8） 弃去上清， 洗板 5 次， 每次 1min， 最后一次在滤纸上拍干 ； 0079 5.9） 加入 100L/ 孔试剂盒所附生物素标记二抗， 37孵育 1 小时 ； 0080 5.10） 弃去上清， 洗板 7 次。
41、， 最后一次在滤纸上拍干 ； 0081 5.11） 加入 100L/ 孔酶底物， 室温， 避光 30min ； 说 明 书 CN 103435690 A 8 7/7 页 9 0082 5.12） 弃上清， 自来水冲洗后室温通风处自然晾干。 0083 电脑扫描斑点， 分析斑点数目， 结果如图 4 所示， 糖基化修饰单点删除后不同程度 增强了小鼠脾脏细胞 IFN- 的产生水平， 其中 N2 诱导产生的 IFN- 水平最高 （图 4A） ， 并 且与野生型 E2 相比， N2 诱导产生的 IL4 水平也有显著增强 （图 4B） 。 0084 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不。
42、受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103435690 A 9 1/5 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103435690 A 10 2/5 页 11 0003 序 列 表 CN 103435690 A 11 3/5 页 12 0004 序 列 表 CN 103435690 A 12 4/5 页 13 0005 序 列 表 CN 103435690 A 13 5/5 页 14 序 列 表 CN 103435690 A 14 1/2 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103435690 A 15 2/2 页 16 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103435690 A 16 。