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1、(10)申请公布号 CN 103436456 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436456 A *CN103436456A* (21)申请号 201310423134.X (22)申请日 2013.09.17 CGMCC No.7946 2013.07.19 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 李多川 韩超 (54) 发明名称 表达9家族糖苷水解酶基因C。
2、tAA9a的毕赤酵 母工程菌株 (57) 摘要 本发明是一种表达嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基 因 CtAA9a 的毕赤酵母工程菌 Pichia pastoris GS-CT-9A。 通 过 RT-PCR 方 法 从 嗜 热 毛 壳 菌 Chaetomium thermophilum 获得糖苷水解酶基 因 CtAA9a， 将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达 载体 pPIC9K 中， 然后将得到的糖苷水解酶基因 CtAA9a表达载体pPIC9K/CtAA9a导入到毕赤酵母 GS115 中， 再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基 因CtAA9a的。
3、酵母工程菌GS-CT-9A。 该工程菌表达 的糖苷水解酶 CtAA9A 对内切纤维素酶的活性具 有明显的促进作用， 混合酶比原始内切酶 N24 的 降解纤维素的活性提高 1.3 倍。在 Mn2+条件下， CtAA9A 和 CtAA9A+N24 的纤维素酶活性可分别提 高14倍和2.4倍。 CtAA9A具有良好的热稳定性和 提高纤维素酶活力的能力， 可广泛用于纤维废料 及其它工业领域， 具有重大经济价值和社会价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。
4、1页 说明书5页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103436456 A CN 103436456 A *CN103436456A* 1/1 页 2 1.一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的酵 母工程菌株， 其特征在于该菌为一种毕赤酵母， 通过 RT-PCR 方法从嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9a,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型 表达载体 pPIC9K, 获得表达重组质粒 pPIC9K/CtAA9a, 转化毕赤酵母 GS115, 从中筛选出表 达热稳定。
5、糖苷水解酶基因 CtAA9a 的毕赤酵母工程菌株 GS-CT-9A， 该糖苷水解酶 CtAA9A 对 内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。 权 利 要 求 书 CN 103436456 A 2 1/5 页 3 表达 9 家族糖苷水解酶基因 CtAA9a 的毕赤酵母工程菌株 （一） 技术领域 0001 本发明涉及生物工程， 具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum9 家族糖苷水解酶基因 CtAA9a 的毕赤酵母工程菌株 Pichia pastoris GS-CT-9A。 （二） 背景技术 0002 糖苷水解酶 （英语 ： Glycoside hy。
6、drolases， 又称糖苷酶） 是一种专门水解配糖键 （glycosidic bond） ， 并产生两个较小的糖分子的酵素， 也是自然界中的常见酵素之一。这 类蛋白质在人类的产业上也有所应用， 例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。 0003 嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum 是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该 菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中 50条件下可以产生热稳定的纤维素酶和 9 家族 糖苷水解酶。 0004 嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9A具有微弱的纤维素酶活性， 但对该菌 株产生的内切纤维素酶 N。
7、24 的酶活性具有明显的促进作用 , 可使其活性提高 1.3 倍。在不 同金属离子如 Mn2+的作用下， CtAA9A 和 CtAA9A+N24 的活性可分别提高 14 倍和 2.4 倍。 （三） 发明内容 0005 本发明从嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum 获得内切 -1,4- 葡聚糖 酶基因的 cDNA 序列全长， 命名为 CtAA9a， CtAA9a 基因 DNA 全长 1053bp， 包括信号肽序 列， 起始密码子和终止密码子， 无内含子， 编码 328 个氨基酸。具有信号肽序列 （1-22aa MPSFVSKTLISALAGAASVAAH） 及一个 N 糖基。
8、化位点和 30 个 O 糖基 化位点。将 CtAA9a 编码的 氨基酸序列在国际基因库中进行检索， 发现属于糖苷水解酶第 9 家族。 0006 构建重组表达质粒载体 pPIC9K/CtAA9a， 利用电转仪进行电击转化 Pichia pastoris GS115， 在 MD 和 MM 培养基上筛选， 经 PCR 鉴定筛选阳性转化子， G418 筛选多拷贝 转化子， 然后进行甲醇诱导表达， 获得毕赤酵母工程菌株 GS-CT-9A。该工程菌株接种于含 BMGY 培养基中， 在 28 200rpm/min 摇床培养 6d 后， 糖苷水解酶的表达量为 3.26mg/ml， 分 子量为 65KDa， 酶。
9、活力为 0.0437U/ml， 9A 在 65下是稳定的， 处理 60min 后仍有 95% 以上的 酶活性 ； 70处理 30min 后仍保持 77% 的活性 ； 80处理 30min 后保持 26% 的活性 ； 90处 理 30min 活性几乎完全丧失。 0007 9家族糖苷水解酶CtAA9A对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶 N24 的酶活性具有明显的促进作用， 混合酶比原始酶 N24 的降解纤维素的能力提高 1.3 倍。 不同金属离子对 CtAA9A 和 CtAA9A+N24 混合酶活性具有促进或抑制作用， 其中在 Mn2+条件 下， CtAA9A 。
10、和 CtAA9A+N24 的纤维素酶活性可分别提高 32 倍和 2.4 倍。 （四） 附图说明 ： 说 明 书 CN 103436456 A 3 2/5 页 4 0008 图 19 家族糖苷水解酶 CtAA9A 的 SDS-PAGE 分析 0009 泳道 1 ： 低分子量蛋白标准 0010 泳道 2 ： 纯化的 9 家族糖苷水解酶 CtAA9A 0011 图 2A:9 家族糖苷水解酶 CtAA9A 的最适温度 B:9 家族糖苷水解酶 CtAA9A 的热稳 定性测定 0012 图 39 家族糖苷水解酶 CtAA9A 对内切纤维素酶 N24 活性的促进作用 0013 图 4 金属离子 Mn2+对 。
11、CtAA9A 纤维素酶及混合酶活性的影响 （五） 具体实施方式 0014 实施例 1 ： 嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum 的分离鉴定 0015 （1） 标本采集 ： 从堆肥中采集。 0016 （2） 分离培养 ： 将采集标本取 0.5 克放置在 PDA 平板上 50培养 3 天后， 进行分离 纯化。操作步骤参考 Cooney and Emerson(1964) 文献。 0017 （3） 鉴定 : 参考 Cooney and Emerson(1964) 和 LaTouche(1950) 文献。 0018 实施例 2 ： 糖苷水解酶基因 CtAA9a 的克隆 0019 。
12、（1） 嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum 总 RNA 的提取 ： 参照 Trizol 试剂盒说 明。 0020 （2） cDNA 第一条链的合成 ： 按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0 试剂盒说明书进行 ： 取 1 2g 总 RNA， 加 RNase Free ddH2O 至 9.5L， 将 RNA 样品在 75变性 5min， 立即在冰浴中冷却 5min， 然后稍微离心一下， 在冰浴中依次加入以下各种 成分 ： 10mmol/L dNTP Mixture2L， 10RT Buffer(Mg2+)2L， 25mmol。
13、/L MgCl24L， Oligo d(T)-Adaptor Primer1L， RNase Inhibiter0.5L， AMV Reverse Transcriptase1L （Final Volume20L） ， 将反应液混合后， 室温下放 10min， 然后 42温育 60min， 再煮沸 5min 以灭活反转录酶。加入 180L DEPC 处理的 ddH2O， 稀释至 200L， 混匀， 稍微离心， 保 存于 -20， 备用。 0021 （3） PCR 反应 （25L） ： cDNA2L,10Buffer2.5L,10mmol/L dNTP2L,25mmol/ LMgCl22L， 上。
14、、 下游引物各 2L， Taq DNA 聚合酶 0.5L(5U/L),ddH2O12L。反应条 件为 94 5min 预变性 ； 94 40s， 56 40s， 72 1min, 共 32 个循环， 72延伸 10min， 4 保存。 0022 上游引物 ： 5 -ATGCCTTCATTCGTTTCGAAG-3 0023 下游引物 ： 5 -TTAGTGGGCAGCAAGGTCAC-3 0024 （4） 基因克隆 ： 取0.5l PCR产物与pMD18-T载体进行连接， 操作步骤按照TAKARA 公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌 DH5 菌株， 在表面涂有氨卞青霉素 (100g/m。
15、L) 的 LB 平板上生长过夜。挑取白色菌落， 在 LB 液体培养基中培养过夜。 0025 （5） 质粒 DNA 的提取 ： 碱法提取质粒 DNA。 0026 （6） 序列测定 ： DNA 双脱氧法测定核苷酸序列， 在上海生物工程有限公司进行。序 列引物为 M13 启动子引物。嗜热毛壳菌 CtAA9a 基因 cDNA 全长 1053bp， 包含起始密码子和 终止密码子， 无内含子， 编码 328 个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索， 发 现属于糖苷水解酶第 9 家族。该序列如下 ： 说 明 书 CN 103436456 A 4 3/5 页 5 0027 (A)SEQ ID NO1 。
16、的信息 0028 （a） 序列特征 ： * 长度 ： 1053 碱基对 ； * 类型 ： 核酸 ； * 链型 ： 双链 ； * 拓扑结构 ： 线性 0029 （b） 分子类型 ： DNA 0030 （c） 假设 ： 否 0031 （d） 反义 ： 否 0032 （e） 最初来源 ： 嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum 0033 （f） 序列描述 ： 0034 0035 0036 （B） SEQ ID NO2 的信息 0037 （a） 序列特征 ： * 长度 ： 328 氨基酸 ； * 类型 ： 氨基酸 ； * 链型 ： 单链 ； * 拓扑结构 ： 线 性 0038 （b。
17、） 分子类型 ： 蛋白质 0039 （c） 序列描述 ： 0040 0041 实施方式 3 ： 表达载体的构建 0042 （1） 根据分离出的 CtAA9a 基因的核苷酸序列设计表达引物， 在引物的 5 端分别引 说 明 书 CN 103436456 A 5 4/5 页 6 入 Ecor I 和 Not 酶切位点 , 下游引物引入 6 个组氨酸序列， 作为纯化标签 ： 0043 上游引物 ： 5 -CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACGGCCACGTCAAGAAT-3 (Ecor I) ； 下 游引物 ： 5 -TTGCGGCCGCTTAGTGGGCAGCAAGGTC-3 (。
18、Not )（组氨酸序列） 0044 (2) 嗜热毛壳菌总 RNA 的提取 : 利用 Trizol 试剂提取。 0045 （3） 反转录合成 cDNA 第一条链 ： 取 2g 总 RNA， 加入 5 反应缓冲液 4L， 10mM dNTP2L， 核糖核酸酶抑制剂 （40 200u/L） 0.5L， 引物 oligodT(1g/L)1L， 反转 录酶 （10u/L） 2L， 42反应 60min， 然后 85 10min 终止反应， 稀释至 200L。 0046 （4） PCR 反应 （25L） ： cDNA2L,10Buffer2.5L,10mmol/L dNTP2L,25mmol/ LMgCl。
19、22L， 上、 下游引物各 2L， Taq DNA 聚合酶 0.5L(5U/L),ddH2O12L。反应条件 为 94 5min 预变性 ； 94 40s， 56 40s， 72 1min, 共 32 个循环， 72延伸 10min， 4保 存。 0047 （5）基因克隆 ： 取 2L PCR 产物与 pMD18 T 载体进行连接， 获得重组质粒 pMD18T/CtAA9a 操作步骤按 TAKARA 公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌 DH5， 在涂有 AMP 的 LB 平板上生长过夜。挑取白色菌落， 在 LB 液体培养基中培养过夜。 0048 （6） 质粒 DNA 提取 ： 碱法提。
20、取质粒 DNA。 0049 （7） 用Ecor I和Not 对重组质粒pMD18-T/CtAA9a产物进行双酶切， 同时用Ecor I和Not 双酶切酵母表达质粒pPIC9K， DNA胶回收试剂盒回收纯化9a基因及载体pPIC9K 片断。 然后进行体外连接， 获得重组质粒pPIC9K/CtAA9a,重组质粒转化大肠杆菌JM109， 在 含 Amp 的 LB 转化平板上挑选单菌落， 提取质粒 DNA， 进行 PCR 和酶切鉴定， 测序确认重组质 粒的读码框正确。 0050 实施例 4. 表达糖苷水解酶基因 CtAA9a 的酵母工程菌株的构建及筛选 0051 （1） 重组表达质粒的线性化:将重组表。
21、达质粒pPIC9K/CtAA9a用限制性内切酶Sac 线性化。 0052 （2） 转化 ： 电击转化酵母菌株 Pichia pastoris GS115 酵母感受态细胞， 转化方法 参见 Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册。 0053 （3） 筛选 ： 用灭菌牙签挑取转化子对应点种在 MM 和 MD 平板上， 30培养 2 4d, 挑取在 MD/MM 平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于 250g/mL、 300g/mL、 400g/mL、 500g/mL、 600g/mLG418 的 YPD 平板上筛选多拷贝转 化子。 0054 实施方式 5 ： 毕赤酵母 。
22、Pichia pastoris GS115 的诱导表达和活性检测 0055 （1） 将阳性转化子接种于含 25mL BMGY 培养基中， 30 250rpm/min 摇床培养 24h （OD600达26） ， 离心收集菌体， 将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中， 至OD600值为1.0， 30250rpm/min继续培养， 每24h补充甲醇至终浓度为0.5%， 每24h取样， 室温10， 000g离 心 5min， 取上清进行 SDS-PAGE 分析。 0056 （2） 酶活性检测 ： 酶活性测定采用 DNS 法， 反应体系及反应条件为 100L 的酶液， 加入200L的0.5%微晶纤维素。
23、， 100L的醋酸缓冲液 （0.4mol/L、 pH5.0） 60反应30min， 加入400L DNS试剂， 煮沸10min， 在540nm波长下测定光吸收值。 对照组用失活的酶液做 对照。以失活酶液的活性定义为 100%， 测定糖苷水解酶 CtAA9A 的相对酶活性。重复三次， 取平均值。蛋白含量测定采用 Bradford 法。 说 明 书 CN 103436456 A 6 5/5 页 7 0057 （3） 重组糖苷水解酶 CtAA9A 的最适反应温度、 pH 及热稳定性 ： 诱导表达的重组糖 苷水解酶经过GE公司的HisTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重 。
24、组蛋白质， 获得电泳均一的纯化蛋白， 用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。 在不同温度和 pH 条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力， 将最高的酶活力定义为 100， 分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性 ； 将重组糖苷水解酶在不同的温度下保 温 30min， 检测剩余酶活力。重复三次， 取平均值。 0058 实施方式 6 ： 9 家族糖苷水解酶对内切纤维素酶 N24 活性的促进作用及不同金属 离子对其活性的影响 0059 （1） 糖苷水解酶对内切纤维素酶 N24 活性的促进作用 0060 采用 DNS 法， 分别测定 CtAA9A、 N24 及混合酶在 N24 最适反应条件下。
25、的内切纤维素 酶活性， 混合酶为 CtAA9A 和 N24 等体积混合， 反应体系为 ： CtAA9A50L， N2450L， 200L 的 0.5%CMC-Na， 100L 的醋酸缓冲液 （0.4mol/L、 pH5.0） 50反应 30min， 加入 400L DNS 试剂， 煮沸10min， 在540nm波长下测定光吸收值。 以不加糖苷水解酶CtAA9A的反应体系中 的酶活性定义为 100%， 分别计算糖苷水解酶 CtAA9A、 内切纤维素酶 N24 以及混合酶的相对 酶活性。重复三次， 取平均值。 0061 （2） 金属离子 Mn2+对糖苷水解酶 CtAA9A 纤维素酶活性的影响 00。
26、62 在反应体系中加入不同的金属离子， 使其终浓度为 1mmol/L， 在糖苷水解酶 CtAA9A 最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性， 不加金属离子反应体系中的酶活性定义 为100%， 计算不同金属离子条件下糖苷水解酶CtAA9A的相对酶活性。 重复三次， 取平均值。 0063 （3） 金属离子 Mn2+对混合酶活性的影响 0064 在反应体系中加入不同的金属离子， 使其终浓度为 1mmol/L， 在内切纤维素酶 N24 最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性， 不加金属离子反应体系中的酶活性定义 为 100%， 计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次， 取平均值。 006。
27、5 实施方式 7 ： 表达 CtAA9a 基因的毕赤酵母工程菌株 GS-CT-9A 的保藏 0066 表达 CtAA9a 基因的毕赤酵母工程菌株 GS-CT-9A 的保藏单位 ： 中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） ； 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研 究所 ； 保藏日期 ： 2013年7月19日 ； 酵母工程菌株编号为 ： CGMCC No.7946 ； 毕赤酵母工程 菌株的分类命名为 ： 巴氏毕赤酵母 Pichia pastoris。 说 明 书 CN 103436456 A 7 1/4 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103436456 A 8 2/4 页 9 0003 序 列 表 CN 103436456 A 9 3/4 页 10 0004 序 列 表 CN 103436456 A 10 4/4 页 11 序 列 表 CN 103436456 A 11 1/3 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103436456 A 12 2/3 页 13 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103436456 A 13 3/3 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 103436456 A 14 。