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1、(10)申请公布号 CN 103436613 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436613 A *CN103436613A* (21)申请号 201310365905.4 (22)申请日 2013.08.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 董艳 韩晞 盛平 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 巫蓓丽 (54) 发明名称 IDH1/IDH2 基因突变的荧光 P。
2、CR 检测试剂盒 及其用途 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 IDH1/IDH2 基 因 突 变 的 荧 光 PCR 检测试剂盒及其用途， 具体提供了用于检测 IDH1/IDH2 基因突变的核苷酸序列、 包含该核苷 酸序列的试剂盒及其在检测 IDH1/IDH2 基因突变 中的用途， 所述的核苷酸序列包含特异性 ARMS 引 物、 突变检测通用 TaqMan 探针、 核酸扩增阻滞引 物等。本发明的试剂盒可用于高通量、 低成本快 速检测 IDH1/IDH2 基因突变， 其灵敏度高、 特异性 强、 污染少、 操作快速安全， 可适用于临床常见样 本如新鲜冰冻组织、 石蜡组织， 尤其提供了除病理 组织。
3、之外的非创伤性血清或血浆样本中微量突变 的高灵敏度检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图8页 (10)申请公布号 CN 103436613 A CN 103436613 A *CN103436613A* 1/1 页 2 1. 一种用于检测 IDH1/IDH2 基因突变的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的核苷酸序列 选自下列中的任一组 ： a） 特异性 ARMS 引物， 其序列选自 SEQ ID NO.6 至 SEQ ID NO.9 。
4、任一种或几种 ； 突变检 测通用 TaqMan 探针， 其序列为 SEQ ID NO.3 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为 SEQ ID NO.1， b） 特异性 ARMS 引物， 其序列选自 SEQ ID NO.10 至 SEQ ID NO.12 任一种或几种 ； 突变 检测通用TaqMan探针， 其序列为SEQ ID NO.4 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为SEQ ID NO.2， c） 特异性 ARMS 引物 I， 其序列选自 SEQ ID NO.6 至 SEQ ID NO.9 任一种或几种 ； 特异 性 ARMS 引物 II， 其序列选自 SEQ ID NO.10 至 SEQ ID 。
5、NO.12 任一种或几种 ； 突变检测通用 TaqMan 探针， 其序列为 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2。 2. 根据权利要求 1 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的核苷酸序列还包括能够扩 增 IDH1 野生型及突变型基因组 DNA 和 / 或能够扩增 IDH2 野生型及突变型基因组 DNA 的上 游引物。 3. 根据权利要求 2 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的上游引物序列为 SEQ ID NO.5。 4. 根据权利要求 1 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的核苷酸。
6、序列还包括通用下 游引物。 5. 根据权利要求 4 所述的核苷酸序列， 其特征在于， 所述的通用下游引物序列为 SEQ ID NO.13 或 SEQ ID NO.14。 6.权利要求1-5任一所述的核苷酸序列在制备检测IDH1/IDH2基因突变的试剂中的用 途。 7.一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒包含权 利要求 1-5 任一所述的核苷酸序列。 8. 根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒还包括 PCR 缓冲液、 dNTPs、 MgCl2溶液、 EXtaq 酶或阳性对照样品。 9. 权利要求 7 或 8 所述的试剂盒在制备。
7、检测 IDH1/IDH2 基因突变的试剂中的用途。 权 利 要 求 书 CN 103436613 A 2 1/9 页 3 IDH1/IDH2 基因突变的荧光 PCR 检测试剂盒及其用途 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学诊断技术领域， 具体地说， 涉及一种 IDH1/IDH2 基因突变 的荧光 PCR 检测试剂盒及其用途。 背景技术 0002 哺乳动物细胞中的 IDH （异柠檬酸脱氢酶） 家族包括 3 个成员 ： IDH1、 IDH2 和 IDH3。 IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中， IDH2与IDH3存在于线粒体中。 这三种酶都催化异柠 檬酸盐 （isocitrate， ICT）。
8、 氧化脱羧产生 CO2和 - 酮戊二酸 （-ketoglutarate， -KG） 。 这些反应需要二价离子 （Mg2+或 Mn2+） 参与， 并且需要辅助因子 NADP+（IDH1 和 IDH2） 或者 NAD+（IDH3） 作为电子受体， 分别产生 NADPH 或者 NADH。IDH1 和 IDH2 是结构相似的同工异 构酶， 而 IDH3 与 IDH1 和 IDH2 不同， 其酶结构是一个包括两个 IDH3A 亚基、 一个 IDH3B 亚基 和一个 IDH3G 亚基的异四倍体蛋白质。 0003 IDH1 基因定位于 2q33.3。IDH 突变超过 90% 是 IDH1 突变， 几乎都是发。
9、生在酶的 底物结合位点之一的残基 R132 的精氨酸。大约 90% 为精氨酸被组氨酸替代 （R132H） ， 其他 少见类型突变也都发生在 R132 残基， 包括半胱氨酸 （R132C ； 3.6%4.6%） 、 丝氨酸 （R132S ； 0.8%2.5%） 、 甘氨酸 （R132G ； 0.6%3.8%）或亮氨酸 （R132L ； 0.5%4.3%）替代精氨酸。 其中 IDH1 R132C 突变与星形细胞瘤密切相关。有研究者分析了 Li-Fraumeni 综合征家 族 （TP53 种系突变） 中星形细胞瘤患者的 IDH1 突变， 发现所有肿瘤的 IDH1 突变都发生在 R132C， 表明已经。
10、携带 TP53 突变的前体细胞可以产生这个相对稀有的 IDH 突变。IDH1 酶底 物结合位点中还有另外两个保守的精氨酸残基 （8100 和 8109） ， 仅有一篇报道称在两例间 变性少突胶质细胞瘤 （WHO III 级） 和一例星形细胞瘤 （WHO II 级） 中存在 R100Q 突变。 0004 IDH2 基因定位于 15q26.1。所有 IDH 突变中 IDH2 突变仅占 3%5%， 甚至更少。突 变影响 IDH2 保守的精氨酸残基 R172， 导致精氨酸被赖氨酸 （R172K） 、 甲硫氨酸 （R172M） 、 甘 氨酸 （R172G） 或色氨酸 （R172W） 所替代。另外， ID。
11、H2 突变仅在没有 IDH1 突变的胶质瘤中被 检出， 且 IDH2 突变主要发生在少突胶质细胞瘤。 0005 迄今为止， 还没有任何 IDH3 与癌症相关的报道。 0006 IDH1/IDH2 基因突变发生在肿瘤的早期， 并且原发灶和转移灶的 IDH1/IDH2 基因 高度保持一致。一般认为， IDH1/IDH2 基因状态不会因治疗而发生变化。IDH1/IDH2 基因在 多种肿瘤中发生了突变， 其发生率在结直肠癌约为 40%， 胰腺癌为 90% 以上， 肺癌约为 15%。 IDH1/IDH2 基因突变主要集中发生在第 2 外显子的 12 和 13 密码子 （ 90%） ， 这些突变破坏 了 。
12、IDH1/IDH2 蛋白内在的 GTPase 活性， 从而使得 IDH1/IDH2 蛋白处于持续活性状态。 0007 带有IDH突变的弥漫性胶质瘤患者与带有野生型IDH的相比， 具有较长的生存期。 这一规律在WHO IIIII级的星形细胞瘤、 少突胶质细胞瘤和WHO IV级的胶质母细胞瘤中 也相继被证实。 IDH突变肿瘤发生于年轻患者， 年龄是胶质瘤一个已知的预后因素。 实验中 发现， IDH1 突变是患者总生存率最有力的单一预后因素， 其后才是年龄、 肿瘤类型和 MGMT 甲基化状态。预后改善的原因之一可能是突变 IDH 的生物学结果。突变 IDH1 R132H 可能 说 明 书 CN 10。
13、3436613 A 3 2/9 页 4 阻碍稳定转染的胶质瘤细胞系的生长和转移。 现在对于胶质母细胞瘤和WHO IIIII级星 形细胞瘤来说， IDH 突变状态被认为是独立的正性预后因素。因此， 在临床实践中检测是否 存在 IDH 突变有重要临床意义。同时， 在胶质瘤分类和分级诊断中应该考虑到 IDH 具体突 变情况， 以便临床进行分层治疗和判断预后。 0008 以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学， 但仅靠组织形态学， 特别是立体 定向取材小标本， 组织缺乏典型病变， 常常不能根据肿瘤的密度、 异型性、 血管增生、 坏死等 进行分级。当取材为肿瘤边缘， 尤其低级别胶质瘤， 或肿瘤治疗后判。
14、断是否存在复发情况， 区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生显得十分困难。 直接测序法检测基因突变则存在 步骤繁琐、 工序复杂、 费时费力的不足。 0009 扩增阻碍突变系统 （amplification refractory mutation system， ARMS） 于1989 年建立， 用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性 ARMS 引物， 其 3 末端碱 基与待检测突变型的突变碱基匹配， 用于特异性扩增突变模板。ARMS 的检测灵敏度依赖于 ARMS引物的特异性和反应条件如酶、 镁离子浓度等的优化。 为了增加引物的特异性， 减少引 物与靶 DNA 发生错配时的错配延伸， 。
15、可通过在引物 3 端的第 2-3 个碱基引入另外一个或者 两个错配碱基， 使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。相比于组织病理学诊断方 法， 应用 ARMS 将显著提高 IDH1/IDH2 基因突变检测的效率、 灵敏度及特异性。 发明内容 0010 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种用于检测 IDH1/IDH2 基因突变 的核苷酸序列。 0011 本发明的再一的目的是， 提供上述核苷酸序列的用途。 0012 本发明的另一的目的是， 提供一种 IDH1/IDH2 基因突变的荧光 PCR 检测试剂盒。 0013 本发明的第四个目的是， 提供上述试剂盒的用途。 0014 为实现上述目。
16、的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种用于检测 IDH1/IDH2 基因突变的核苷酸序列， 所述的核苷酸序列选自下列中的任 一组 ： a） 特异性 ARMS 引物， 其序列选自 SEQ ID NO.6 至 SEQ ID NO.9 任一种或几种 ； 突变检 测通用 TaqMan 探针， 其序列为 SEQ ID NO.3 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为 SEQ ID NO.1， b） 特异性 ARMS 引物， 其序列选自 SEQ ID NO.10 至 SEQ ID NO.12 任一种或几种 ； 突变 检测通用TaqMan探针， 其序列为SEQ ID NO.4 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为SE。
17、Q ID NO.2， c） 特异性 ARMS 引物 I， 其序列选自 SEQ ID NO.6 至 SEQ ID NO.9 任一种或几种 ； 特异 性 ARMS 引物 II， 其序列选自 SEQ ID NO.10 至 SEQ ID NO.12 任一种或几种 ； 突变检测通用 TaqMan 探针， 其序列为 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 ； 核酸扩增阻滞引物， 其序列为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2。 0015 优选的， 所述的核苷酸序列还包括能够扩增 IDH1 野生型及突变型基因组 DNA 和 / 或能够扩增 IDH2 野生型及突变型基因组 DNA 的。
18、上游引物。更优选的， 所述的上游引物序列 为 SEQ ID NO.5。 0016 优选的， 所述的核苷酸序列还包括通用下游引物。 更优选的， 所述的通用下游引物 序列为 SEQ ID NO.13 或 SEQ ID NO.14。 说 明 书 CN 103436613 A 4 3/9 页 5 0017 为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 如上任一所述的核苷酸序列在制备检测 IDH1/IDH2 基因突变的试剂中的用途。 0018 为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种 IDH1/IDH2 基因突变的荧光 PCR 检测试剂盒， 所述的试剂盒包含如上任一所述的 核苷酸序。
19、列。 0019 优选的， 所述的试剂盒还包括 PCR 缓冲液、 dNTPs、 MgCl2溶液、 EXtaq 酶或阳性对照 样品。 0020 为实现上述第四个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 如上所述的试剂盒在制备检测 IDH1/IDH2 基因突变的试剂中的用途。 0021 需要说明的是， 所述的核酸扩增阻滞引物与野生模板完全匹配， 其末端磷酸化， 从 而抑制 IDH1/IDH2 基因突变区野生型 DNA 扩增 ； 所述的 ARMS 引物共 7 种， 分别用于检测 IDH1 基因 R132H、 R132C、 R132S、 R132G 这 4 种突变型及 IDH2 基因 R172K、 R172M。
20、、 R172G 这 3 种突变类型 ； 7 条 ARMS 引物分别在 3 末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配， 同时在 其 3 末端倒数 2-3 位增加一个或者两个碱基错配， 以增加其特异性 ； 所述的阳性对照样品 是分别包含 IDH1 基因第 132 号密码子 4 种突变类型及 IDH2 基因第 172 密码子 3 种碱基置 换突变类型的质粒基因组 DNA。 0022 本发明优点在于 ： 本发明将核酸扩增阻滞引物和ARMS突变特异性引物相结合， 用于检测IDH1/IDH2基因 突变， 实验结果证实本发明的试剂盒具备以下优点 ： 1. 特异性强 ： 设计的 ARMS 引物分别针对 IDH1 。
21、基因第 132 和 IDH2 基因第 172 密码子 的七种特异突变序列， 能特异性扩增相应突变模板 DNA ； 在 ARMS 引物的 3 末端倒数 2-3 位 增加一个或者两个碱基错配， 可以增加 ARMS 引物的特异性 ； 在 PCR 反应体系中加入野生型 IDH基因特异性的核酸扩增阻滞引物， 通过抑制野生型基因组DNA扩增从而富集突变型DNA 的扩增， 进一步提高了检测的特异性。 0023 2. 敏感性高 ： 在 PCR 反应液中加入野生型 IDH 基因特异性的核酸扩增阻滞引物， 通过特异性地抑制野生型模板的扩增， 从而达到对微量突变模板的富集作用， 提高检测敏 感性， 检测 IDH 基。
22、因突变敏感度达 0.1-1% （即突变基因组 DNA 达到基因总 DNA 的 0.1-1% 即 可检出） ， 而直接测序法检测 IDH 突变的敏感度约为 10% （即突变基因组 DNA 达到基因总 DNA 的 10% 才能检出） 。 0024 3. 检测过程为闭管反应， 显著降低了污染及结果偏差的可能性。 0025 4. 操作简单快速， 从标本送检到得出结果可在三个小时以内完成。而直接测序法 检测步骤繁琐 ： 送检标本提取 DNAPCR 扩增验证 PCR 产物 （电泳）纯化 PCR 产物 直接测序， 且其经历两个 PCR 产物的电泳过程， 污染机会大， 不适合在医院大规模开展。 0026 5.。
23、 结果判读明确、 客观， 若需要亦可对结果进行定量分析。 0027 6. 高通量， 一次最多可检测 12 例。 0028 7. 安全 ： 整个体系中不包含有毒有害物质， 无需 PCR 产物的后处理， 对操作员和环 境都无危害。 附图说明 说 明 书 CN 103436613 A 5 4/9 页 6 0029 图 1 为用本发明所述荧光 PCR 检测试剂盒检测间变性胶质细胞瘤阳性样本的 IDH 突变的扩增曲线图， 该样本经测序证实为 IDH1 第 132 密码子 CGTGAT 突变阳性。 0030 图2为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测弥漫性星形胶质细胞瘤阳性样本的 IDH 突变的扩增曲线图。
24、， 该样本经测序证实为 IDH1 第 132 密码子 CGTTGT 突变阳性。 0031 图 3 为用本发明所述荧光 PCR 检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的 IDH 突 变的扩增曲线图， 该样本经测序证实为 IDH1 第 132 密码子 CGT GGT 突变阳性。 0032 图 4 为用本发明所述荧光 PCR 检测试剂盒检测继发性胶质母细胞瘤阳性样本的 IDH 突变的扩增曲线图， 该样本经测序证实为 IDH1 第 132 密码子 CGT AGT 突变阳性。 0033 图 5 为用本发明所述荧光 PCR 检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的 IDH 基 因突变的扩增曲线图 ； 该样本经。
25、测序证实为 IDH2 第 172 密码子 AGGAAG 突变阳性。 0034 图 6 为用本发明所述荧光 PCR 检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的 IDH 突 变的扩增曲线图 ； 该样本经测序证实为 IDH2 第 172 密码子 AGGATG 突变阳性。 0035 图7为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测阳性对照样本IDH2基因第172密码 子 AGGGGG 碱基置换突变的扩增曲线图， 该突变形式在中国胶质瘤患者人群中比较少见。 0036 图8为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测间变性胶质细胞瘤阳性样本的IDH1 基因野生型的扩增曲线图。 0037 图 9 为用本发明所述荧光 PCR。
26、 检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的 IDH2 基因野生型的扩增曲线图。 具体实施方式 0038 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0039 实施例 1 引物、 探针的设计及验证 1 实验方法 1.1 模板 DNA 的收集 收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的 50 例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻组织块， 从组织中提取基因组 DNA 供以下的实验应用。用荧光 PCR 方法检测 IDH1 基因第 132、 IDH2 基因 172 密码子常见 7 种碱基置换突变。 0040 1.2 引物设计 设计并筛选能特异性检测上述 7 种碱基置换突变的特异性 ARMS 引物各一条及参照引 物。
27、一条， 设计通用下游引物一条， 设计并筛选通用 TaqMan 探针一条， 设计并筛选核酸扩增 阻滞引物一条， 各探针、 引物序列分别具体如下 ： IDH1 核酸扩增阻滞引物的序列如 SEQ ID NO.1 所示 ： 5 -TTACTTGATCCCCATAAGCATAACG -PO4-3 IDH2 核酸扩增阻滞引物的序列如 SEQ ID NO.2 所示 ： 5 -cgccatgggcgtgcc -PO4-3 IDH1 突变检测通用 TaqMan 探针的序列如 SEQ ID NO.3 所示 ： 5 -FAM-AATGTGCCACTATC ACTCCTGATGAGAAGAG -BHQ1-3 IDH2。
28、 突变检测通用 TaqMan 探针的序列如 SEQ ID NO.4 所示 ： 5 -FAM-AAACATCCCACGCCTAGTCCCTG -BHQ1-3 IDH1 参照引物的序列如 SEQ ID NO.5 所示 ： 5 -AGCTATAAAGAAGCATAATGTTGGC -3 说 明 书 CN 103436613 A 6 5/9 页 7 针对IDH1基因132号密码子CGTCAT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.6所示 ： 5 -CTTACTTGATCCCCATAAGCATGCT-3 针对IDH1基因132号密码子CGTTGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.7所示。
29、 ： 5 -CTTACTTGATCCCCATAAGCATGAGA-3 针对IDH1基因132号密码子CGTGGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.8所示 ： 5 -CTTACTTGATCCCCATAAGCATAAGC-3 针对IDH1基因132号密码子CGTAGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.9所示 ： 5 -CTTACTTGATCCCCATAAGCATGGCT -3 针对 IDH2 基因 172 号密码子 AGG AAG 的特异性 ARMS 引物序列如 SEQ ID NO.10 所 示 ： 5 -TcgccatgggcgtgCAT -3 针对 IDH2 基因 17。
30、2 号密码子 AGG ATG 的特异性 ARMS 引物序列如 SEQ ID NO.11 所 示 ： 5 - cgccatgggcgtgCGT -3 针对 IDH2 基因 172 号密码子 AGG GGG 的特异性 ARMS 引物序列如 SEQ ID NO.12 所 示 ： 5 -TcgccatgggcgtACAC -3 另 检 测 IDH1 的 通 用 下 游 引 物 的 序 列 如 SEQ ID NO.13 所 示 : 5 - TTATTGCCAACATGACTTACTTGA-3 检 测 IDH2 的 通 用 下 游 引 物 的 序 列 如 SEQ ID NO.14 所 示 : 5 - CT。
31、GGTCGCCATGGGCGT-3。 0041 1.3 反应体系的优化 （1） 引物浓度的优化 ： 在反应体系其它条件相同的情况下， 将引物浓度分别从 0.1M 至 1.6M 作倍比连续稀释， 通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是 0.3M。 0042 （2）探针浓度的优化 ： 在反应体系其他条件相同的情况下， 将探针浓度分别从 0.05M 至 0.5M 作倍比连续稀释， 通过对试验结果的分析比较， 确定最佳探针浓度是 0.1M。 0043 （3） 退火温度的优化 ： 在反应体系其它条件相同的情况下， 进行梯度 PCR （54 62退火温度） ， 通过对试验结果的分析比较， 确定最佳退火温。
32、度是 57。 0044 （4） 酶的优化 ： 在反应体系中加入各种酶， 通过对试验结果的分析比较， 确定最佳 酶是 EXtaq 酶。 0045 经优化， 反应体系为 25L， 包括 ： qPCR 混合反应液 19.75L、 通用下游引物各 0.75L（终浓度 0.3M） 、 参照引物或者突变特异性 ARMS 引物各 0.75L（终浓度 0.3M） 、 通用 TaqMan 探针 0.25L（终浓度 0.1M） 、 核酸扩增阻滞引物 1.5L（终浓度 0.6M） 、 模 板 DNA 2.0L（终浓度 1300ng/L） 。所述 qPCR 混合反应液组分及其终浓度为 ： PCR buffer 终浓度。
33、为 1 ； dNTPs 终浓度为 0.2mM ； EXtaq 酶终浓度为 0.05U/l ； MgCl2终浓度为 4mM。 0046 1.4 实时荧光定量 PCR 扩增 每个样本的突变检测在两管中进行， 分别为参照管和突变管。每管均加入 qPCR 混合反 应液和模板 DNA， 参照管中加入参照引物和 IDH1 通用 TaqMan 探针， 突变管中加入 7 种 ARMS 说 明 书 CN 103436613 A 7 6/9 页 8 引物和两种通用 TaqMan 探针 （IDH1 通用 TaqMan 探针和 IDH2 通用 TaqMan 探针） 进行 IDH1/ IDH2基因突变的荧光PCR检测。。
34、 PCR反应条件为 ： 95预变性10分钟， 95 10秒， 56 45 秒， 扩增反应 40 循环， 在 56 45 秒阶段收集荧光。 0047 2 实验结果 在临床病理诊断的 50 例脑胶质细胞瘤样本中共检测出 24 例 IDH 突变阳性样本， 经测 序验证， 15 例样本发生 IDH1 基因第 132 密码子 CGT CAT 突变， 2 例样本发生 IDH1 基因 第 132 密码子 CGT TGT 突变， 2 例样本发生 IDH1 基因第 132 密码子 CGT GGT 突变， 1 例 样本发生 IDH1 基因第 132 密码子 CGT AGT 突变， 1 例样本发生 IDH2 基因第。
35、 172 密码子 AGG AAG 突变， 1 例样本发生 IDH2 基因第 172 密码子突变， 1 例样本发生 IDH2 基因第 172 密码子 AGG ATG 突变。另外 1 例样本 IDH1/IDH2 基因分型荧光 PCR 检测判读为 IDH1 第 132 密码子 CGTCAT 突变阳性， 该样本经测序显示为突变阴性， 经 T-A 克隆证实 CGTCAT 突变阳性， 阳性克隆率约为 6%。其余检测结果与直接测序结果均相符合。 0048 上述结果表明应用本发明的引物、 探针检测肿瘤组织 IDH1/IDH2 基因突变灵敏度 高， 可检测临床样本中的微量突变模板 （ 10%） ； 结果可靠， 。
36、与突变检测 “金标准” 直接测序 法的结果符合率 95%。此外该方法检测速度快， 操作简单， 结果判读客观， 闭管反应污染 少， 非常适合于在临床中大规模开展。 0049 实施例 2 试剂盒一 试剂盒中含有下列试剂和材料 ： 引物溶液 ： (1)IDH1 核酸扩增阻滞引物， 序列 SEQ ID NO.1， 5mol/L ； (2) ARMS 引物， 序列为 SEQ ID NO.6-9 中任一种或几种， 5mol/L ； (3) IDH1 突变检测通用 TaqMan 探针， 序列 SEQ ID NO.3， 5mol/L ； (4) 参照引物， 序列 SEQ ID NO.5， 5mol/L。 00。
37、50 实施例 3 试剂盒二 试剂盒中含有下列试剂和材料 ： 引物溶液 ： (1)IDH2 核酸扩增阻滞引物， 序列 SEQ ID NO.2， 5mol/L ； (2) ARMS 引物， 序列为SEQ ID NO.10-12中任一种或几种， 5mol/L ； (3) IDH2突变检测通用TaqMan探针， 序列 SEQ ID NO.4， 5mol/L。 0051 实施例 4 试剂盒三 试剂盒中含有下列试剂和材料 ： 引物溶液 ： (1)IDH1 核酸扩增阻滞引物， 序列 SEQ ID NO.1， 5mol/L ； (2)IDH2 核酸扩 增阻滞引物， 序列SEQ ID NO.2， 5mol/L 。
38、； (3) ARMS引物， 包含SEQ ID NO.6-9中的任一种 或几种以及SEQ ID NO.10-12中的任一种或几种， 每管5mol/L ； (3)PCR通用下游引物， 一 种序列为 SEQ ID NO.13， 5mol/L， 另一种序列为 SEQ ID NO.14， 5mol/L ； (4) IDH1 突变 检测通用TaqMan探针， 序列SEQ ID NO.3， 5mol/L ； (5) IDH2突变检测通用TaqMan探针， 序列 SEQ ID NO.4， 5mol/L ； (6) 参照引物， 序列 SEQ ID NO.5， 5mol/L。 0052 实施例 5 试剂盒四 1、。
39、 引物溶液 ： (1)IDH1 核酸扩增阻滞引物， 序列 SEQ ID NO.1， 5mol/L ； (2)IDH2 核酸 扩增阻滞引物， 序列SEQ ID NO.2， 5mol/L ； (3) ARMS引物， 包含SEQ ID NO.6-9中的任一 种或几种以及SEQ ID NO.10-12中的任一种或几种， 每管5mol/L ； (3)PCR通用下游引物， 一种序列为 SEQ ID NO.13， 5mol/L， 另一种序列为 SEQ ID NO.14， 5mol/L ； (4) IDH1 突 说 明 书 CN 103436613 A 8 7/9 页 9 变检测通用 TaqMan 探针， 序。
40、列 SEQ ID NO.3， 5mol/L ； (5) IDH2 突变检测通用 TaqMan 探 针， 序列 SEQ ID NO.4， 5mol/L ； (6) 参照引物， 序列 SEQ ID NO.5， 5mol/L ； 2、 10PCR 缓冲液 ； 3、 dNTPs， 2.5mol/L ； 4、 MgCl2溶液， 1M ； 5、 EXtaq 酶， 5U ； 6、 阳性对照样品， 为IDH1基因第132密码子4种碱基置换突变 （CGTCAT， CGTTGT， CGT GGT， CGT AGT） 中的任一种质粒基因组 DNA， 或者为 IDH2 基因第 172 密码子 3 种碱 基置换突变 （。
41、AGG AAG， AGG ATG， AGG GGG） 中的任一种质粒基因组 DNA。 0053 实施例 6 试剂盒的使用方法 具体包括以下步骤 ： (1)设计并筛选可检测包含IDH1基因第132号密码子序列的通用TaqMan探针、 核酸扩 增阻滞引物及 4 种 ARMS 引物 ； 设计并筛选可检测包含 IDH2 基因第 172 号密码子序列的通 用TaqMan探针、 核酸扩增阻滞引物及3种ARMS引物 ； 设计并筛选可检测某保守基因片段的 TaqMan 探针、 1 种上游引物和下游引物。 0054 1、 从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组 DNA 作为模板 DNA ； 2、 进行实时荧光定量。
42、 PCR 扩增 ： 每个样本的突变检测在两管中完成进行， 每管加入 qPCR 混合反应液和模板 DNA， 参照管中加入参照引物和对应的通用 TaqMan 探针， 突变管中 加入所需的 ARMS 引物和对应的通用 TaqMan 探针， 并加入对应的核酸扩增阻滞引物， 进行 IDH1/IDH2 基因突变的荧光 PCR 检测 ； 3、 结果判读 ： 参照孔扩增曲线阳性， 突变孔均无扩增曲线或者其与参照孔的扩增曲线 Ct 12， 该 样本结果判断为野生型 ； 参照孔扩增曲线阳性， 相应突变孔扩增曲线阳性， 且其与参照孔的扩增曲线 Ct 10， 该样本结果判读为突变型 ； 参照孔扩增曲线阳性， 相应突变。
43、孔扩增曲线阳性， 且其与参照孔的扩增曲线 10 Ct 12， 该样本结果判读为可疑突变型 ； 如重复检测一次均显示扩增曲线阳性， 且 Ct 12， 则该样本结果判读为突变型 ； 参照孔扩增曲线阴性， 提示该样本提取失败， 需要重新提取 DNA 核酸。 0055 其中， 步骤 1 中的模板 DNA 可以选择自新鲜冰冻或者石蜡包埋的肿瘤组织、 外周 血细胞、 体液的脱落细胞中提取 ； 步骤 2 中进行 PCR 扩增反应的条件为 ： 92 96预变性 10 15min ； 92 97变性 10 15s ； 58 62退火 40s ； 40 45 个循环。 0056 实施例 7 试剂盒临床应用一 1、。
44、 方法 ： 收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的 20 例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻 组织块， 从组织中提取基因组 DNA， 使用实施例 2 的试剂盒 （其中 ARMS 引物序列为 SEQ ID NO.6） 检测这 20 例有无 IDH1 基因 132 号密码子 CGT CAT 突变。 0057 PCR 反应体系 ： （1）突变管 ： PCR 缓冲液为 1 ； dNTPs 为 1.0mM ； MgCl2为 3mM ； EXtaq 酶为 0.05U/L ； PCR 通用下游引物为 lM ； IDH1 突变检测通用 TaqMan 探针为 0.5M ； IDH1 核酸扩增阻滞引 说 明 书 CN 10。
45、3436613 A 9 8/9 页 10 物为 0.9M ； ARMS 引物为 0.3M ； 待检测 DNA 模板 100ng/L ； （2） 参照管 ： 基本同突变管， 用参照引物替代 ARMS 引物， DNA 模板为阳性对照样品， 具体 为 IDH1 基因 132 号密码子 CGT CAT 突变的质粒基因组 DNA。 0058 PCR 反应条件 ： 96预变性 10min ； 95变性 12s ； 60退火 40s ； 40 个循环。 0059 2、 结果 ： 在临床病理诊断的20例脑胶质细胞瘤样本中共检测出9例IDH1基因132 号密码子 CGT CAT 突变阳性样本， 经测序验证， 结。
46、果一致。 0060 实施例 8 试剂盒临床应用二 1、 方法 ： 收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的 20 例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻 组织块， 从组织中提取基因组 DNA， 使用实施例 3 的试剂盒 （其中 ARMS 引物包含两种， 序列 分别为 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.11） 检测这 20 例有无 IDH2 基因 172 号密码子 AGG AAG 及 IDH2 基因 172 号密码子 AGG ATG 突变。 0061 PCR 反应体系 ： （1）突变管 ： PCR 缓冲液为 1 ； dNTPs 为 0.5mM ； MgCl2为 2mM ； EXtaq 酶为 0.。
47、05U/L ； PCR 通用下游引物为 0.5M ； IDH2 突变检测通用 TaqMan 探针为 0.5M ； IDH2 核酸扩增阻滞 引物为 0.9M ； ARMS 引物各为 0.3M ； 待检测 DNA 模板 50ng/L ； （2） 参照管 ： 基本同突变管， 用参照引物替代 ARMS 引物， DNA 模板为阳性对照样品， 具体 为 IDH2 基因 172 号密码子 AGG AAG 突变的质粒基因组 DNA。 0062 PCR 反应条件 ： 96预变性 10min ； 95变性 12s ； 60退火 40s ； 40 个循环。 0063 2、 结果 ： 在临床病理诊断的20例脑胶质细胞。
48、瘤样本中共检测出5例IDH2基因172 号密码子 AGG AAG 突变阳性样本、 5 例 IDH2 基因 172 号密码子 AGG ATG 突变阳性样本， 经测序验证， 结果一致。 0064 实施例 9 试剂盒临床应用三 1、 方法 ： 收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的 40 例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻 组织块， 从组织中提取基因组DNA， 使用实施例5的试剂盒 （其中ARMS引物包含四种， 序列分 别为 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.12） 检测这 20 例有无 IDH1 基因 132 号密码子 CGT CAT 突变、 IDH1 基因 132 号密码子 CGT AGT 突变、 IDH2 基因 172 号密码子 AGG AAG 突变及 IDH2 基因 172 号密码子 AGG GGG 突变。 0065 PCR 反应体系 ： （1）突变管 ： PCR 缓冲液为 1 ； dNTPs 为 0.5mM ； MgCl2为 2mM ； EXtaq 酶为 0.05U/L ； PCR 通用下游引物为 0.5M ； IDH1 突变检测通用 TaqMan 探针为 0.5M ； IDH2 突变检测通用 TaqMan 。