多重PCR检测志贺氏菌群/血清型的引物组和试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103451307 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451307 A *CN103451307A* (21)申请号 201310425567.9 (22)申请日 2013.09.17 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 北京卓诚惠生生物科技有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命园路 29 号 创新大厦 A204 (72)发明人 王晓艳 王雷 王彦威 张志强 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 穆宏平 (。

2、54) 发明名称 多重 PCR 检测志贺氏菌群 / 血清型的引物组 和试剂盒 (57) 摘要 本发明公开一种志贺氏菌群 / 血清型多重 PCR 检测引物组和试剂盒。其检测引物组由检测 宋内志贺氏菌、 福氏 1-5 型志贺氏菌、 痢疾型志 贺氏菌、 福氏 6 型志贺氏菌和志贺氏菌属的引物 对组成。本发明建立一种基于普通 PCR 平台的多 重 PCR 检测方法， 利用分析设计得到的所述引物 对， 对待测样品中提取的细菌总 DNA， 在同一反应 体系中进行多重 PCR 反应， 通过对反应产物进行 电泳分析以确定样品是否为志贺氏菌属并判断志 贺氏菌群 / 血清型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 。

3、1 页 说明书 9 页 序列表 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103451307 A CN 103451307 A *CN103451307A* 1/1 页 2 1.一种多重PCR检测志贺氏菌群/血清型的引物组， 其特征在于， 其是由检测宋内志贺 氏菌、 福氏 1-5 型志贺氏菌、 痢疾型志贺氏菌、 福氏 6 型志贺氏菌和志贺氏菌属的引物对 组成 ； 所述检测宋内志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2 所示 ； 所。

4、述检测福氏1-5型志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4 所示 ； 所述检测痢疾型志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示 ； 所述检测志贺氏菌属引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8 所示 ； 所述检测福氏 6 型志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.10 所示。 2.一种对志贺氏菌群/血清型进行多重PCR检测的方法， 其特征在于， 将权利要求1所 述引物组与待测样品提取的总 D。

5、NA 进行多重 PCR 反应， 反应结束后对 PCR 扩增产物进行电 泳分析以确定样品是否为志贺氏菌属并判断志贺氏菌群 / 血清型。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 在进行多重 PCR 反应时， 反应体系中还加 入阳性内对照引物对。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述阳性内对照引物对的上下游引物的 核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.12 所示。 5.根据权利要求2-4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述多重PCR反应按以下步骤进 行 ： a ： 95 4min ； b ： 95 30s， c ： 55-68 30-6。

6、0s， d ： 72 30-120s， b-d 循环 30-35 个反应 ； e ： 72 5-10min。 6. 一种快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求 1 所述的引物组、 阳性 内对照引物对、 阳性内对照模板、 DNA 聚合酶、 反应体系缓冲液、 Mg2+、 dNTP 和去离子水。 权 利 要 求 书 CN 103451307 A 2 1/9 页 3 多重 PCR 检测志贺氏菌群 / 血清型的引物组和试剂盒 技术领域 0001 本发明属微生物检测领域， 涉及志贺氏菌群 / 血清型的多重快速 PCR 检测引物组 和试剂盒。 背景技术 0002 志贺氏菌是一类具有高度传染性。

7、、 危害严重的革兰阴性肠道致病菌， 由其临床感 染所导致的志贺氏菌性痢疾 （shigellosis） 是发展中国家重要的传染病之一， 也是发达国 家腹泻病的主要病原。全球每年的志贺氏菌性痢疾病例近 1.65 亿例， 其中 1.63 亿发生在 发展中国家， 并导致 110 万患者死亡， 其中 60% 以上为 5 岁以下儿童。我国广大农村地区由 于卫生条件差， 经常有因水源或食品受志贺氏菌污染而引起痢疾、 腹泻等疾病流行的报道。 0003 志贺氏菌为志贺氏菌属， 分为四个种群 ： 痢疾志贺氏菌 （A 群） 、 福氏志贺氏菌 （B 群） 、 鲍氏志贺氏菌 （C 群） 和宋内志贺氏菌 （D 群） 。志。

8、贺氏菌抗原由菌体抗原 （O 抗原） 和荚 膜抗原 （K 抗原） 组成， O 抗原的特异性好， 据此可对志贺氏菌进行血清学分型。痢疾志贺氏 菌有 13 个血清型， 福氏志贺氏菌有 6 个血清型， 鲍氏志贺氏菌有 18 个血清型， 宋内志贺氏 菌只有一个血清型。其中， 福氏志贺氏菌 6 型与 1-5 型 O 抗原差异较大。四个群的志贺氏 菌均可引起痢疾。 根据志贺氏菌的菌型分布调查， 我国以福氏和宋内志贺氏菌感染为主 ； 痢 疾志贺氏菌 1 型是志贺氏菌暴发的最主要菌株。近年来， 痢疾志贺氏菌型引起的细菌性 痢疾已发展为世界性流行趋势， 我国至少在 10 个省、 区发生了不同规模流行。其他型的痢 。

9、疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌则较少见。 0004 我国对志贺氏菌检测目前采用的主要方法是以国家标准 GB/T4789.5-2012 作为 依据， 采用细菌分离培养、 生化反应和血清学方法鉴定群和血清型。 整个检测获得最终结果 需要 5 天左右， 既费时又费力， 且受限于数据库信息有限。同时， 挑选菌落不全、 菌落不纯、 菌液浓度过高或过低均会影响最终结果的呈现。 0005 分子生物学检测方法为志贺氏菌检测提供了良好的检测工具， 目前国内外均建立 了采用PCR技术对志贺氏菌进行快速检测的技术。 比如中国专利申请号为200710030435.0 的发明专利 “志贺氏菌检测用引物、 检测方法、 检测试剂。

10、盒” ， 提供了一种基于环介导等温 扩增技术检测试剂盒， 试剂盒通过一组志贺氏菌检测引物组和包含该引物组的试剂盒检 测标本中志贺氏菌的特定基因片段， 以确定标本中志贺氏菌的存在情况。中国专利申请 号为 200710026604.3 的发明专利 “一种检测志贺氏菌及其 ipah 毒力岛的方法及其试剂 盒” ， 提供了检测临床样本中志贺氏菌属和 ipah 毒力岛的方法及试剂， 特别是涉及以实时 荧光定量聚合酶链式反应技术检测志贺氏菌属细菌的方法和试剂盒。中国专利申请号为 200510132404.7的发明专利 “用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用 试剂盒” ， 提供了一种用于志贺。

11、氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒， 通过引物扩增16S rRNA、 O抗原编码基因， 将PCR产物与固相芯片进行杂交以检测志贺氏菌 的不同血清型。 0006 采用单重 PCR 或实时荧光 PCR 可以快速的鉴定志贺氏菌种属， 但对群和血清型仍 说 明 书 CN 103451307 A 3 2/9 页 4 需通过分离培养、 生化反应和血清学方法鉴定。 由于食品和临床标本成分复杂， 提取后的核 酸仍有可能带有 PCR 抑制成分， 出现假阴性的结果， 造成志贺氏菌的漏检。 0007 生物芯片可以对志贺氏菌的群和血清型进行系统的鉴定， 但进行生物芯片检测需 要配备昂贵的仪器， 稳定性。

12、差、 重现率低等技术难题和昂贵的成本仍制约它进一步发展和 应用。 发明内容 0008 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种多重 PCR 检测志贺氏 菌群 / 血清型的引物组和试剂盒， 可快速、 特异且敏感地判定志贺氏菌属及鉴别志贺氏菌 群和血清型， 建立一种基于普通 PCR 平台的多重 PCR 检测方法。 0009 为了实现本发明目的， 本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一 种多重 PCR 检测志贺氏菌群 / 血清型的引物组 ： 0010 1、 设计阳性内对照 （IAC） 扩增引物和模板 ： 0011 以 pET28a 质粒为模板设计一对引物， 扩增其中的 11。

13、76bp 大小的片段， 作为检 测的 IAC。IAC 上游引物序列为 5 -TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3 ， IAC 下游引物的序列为 5 -TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3 。pET28a 的碱基序列如 SEQ ID No.13 所示。 0012 2、 选择志贺氏菌属的检测靶点 0013 侵袭性质粒抗原 H（ipaH） 存在于所有群和血清型的志贺氏菌中， 以多拷贝存在于 染色体和侵袭性大质粒上， 不随传代消失， 是比较理想的检测志贺氏菌属的靶点。 可通过检 测 ipaH 基因的扩增来判定志贺氏菌属。 0014 3、 选择 O 抗原特异性的群和血清型鉴定引物 00。

14、15 通过阅读文献， 选择了志贺氏菌 O 抗原合成途径中的关键基因 wzx 和 wzy 作为 O 抗原特异性的群和血清型鉴定靶点。通过序列比对获得基因保守区域后设计相应的引物。 0016 4、 引物候选方案设计 0017 本发明使用 primer premier6 软件针对所有扩增目标候选基因或者片段设计 1-3 套备用方案。 0018 5、 对扩增目标的引物候选方案进行 Blast 分析 0019 在 Genbank 中对所有引物候选方案进行 Blast 分析， 获得特异性较高的引物方案 作为实验验证用方案， 每一种致病菌可能会选择多个扩增目标， 每个扩增目标会有 1-3 个 实验验证方案。。

15、 0020 6、 对每一个可用实验验证方案进行单重 PCR 验证， 确定引物的可用性， 包括特异 性评估和敏感性评估。 0021 7、 将所有扩增目标的引物混合进行多重 PCR， 验证引物共同扩增时的可用性， 对不 能工作的引物需要按照步骤 2-4 重复设计新的引物进行替换。最终获得本发明提供的一套 特异的引物序列 （详见表 1） 。 0022 表 1. 志贺氏菌属、 群和血清型鉴定多重 PCR 引物汇总表 0023 说 明 书 CN 103451307 A 4 3/9 页 5 0024 注 ： 虽然所选检测目标的基因或者 DNA 片段为保守区域， 但仍有个别碱基插入或 缺失的可能型， PCR。

16、 产物的大小也会随之增加或减少几个 bp， 不影响结果的判断。 0025 基于上述技术方案， 本发明提供了一种多重 PCR 检测志贺氏菌群 / 血清型的引物 组， 其是由检测宋内志贺氏菌、 福氏1-5型志贺氏菌、 痢疾型志贺氏菌、 福氏6型志贺氏菌 和志贺氏菌属的引物对组成 ； 0026 所述检测宋内志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2 所示 ； 0027 所述检测福氏 1-5 型志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4 所示 ； 0028 所述检测痢疾型志贺氏菌引物对的上下游引物的。

17、核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示 ； 0029 所述检测志贺氏菌属引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8 所示 ； 0030 所述检测福氏 6 型志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.10 所示。 0031 本发明还提供了一种对志贺氏菌群 / 血清型进行多重 PCR 检测的方法， 将所述引 物组与待测样品提取的总 DNA 进行多重 PCR 反应， 反应结束后对 PCR 扩增产物进行电泳分 析以确定样品是否为志贺氏菌属并判断志贺氏菌群 / 血清型。 003。

18、2 进一步地， 在进行多重 PCR 反应时， 反应体系中还加入阳性内对照引物对。 0033 所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.12 所示。 0034 该方法通过检测志贺氏菌属的保守序列， 能快速筛检志贺氏菌的同时， 可对国内 最主要的志贺氏菌流行株和暴发株进行系统检测。 同时加入的IAC， 作为质控鉴别假阴性结 说 明 书 CN 103451307 A 5 4/9 页 6 果。 0035 其技术方案具体如下 ： 0036 1、 引物合成 0037 按照表 1 中的引物序列， 在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。 0038 。

19、2、 DNA 模板提取 0039 使用煮沸法或者商品化试剂盒提取各种群和血清型别志贺氏菌总 DNA 作为检测 样品。 0040 3、 使用普通 PCR 平台构建多重 PCR 检测体系 0041 在确定多重反应体系中引物序列后， 还需要从引物浓度、 退火温度、 反应体系配 置、 反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下 ： 0042 Taq DNA 聚合酶 0.5-3U， 5xPCR buffer（TrisHCl 100mM（PH8.3） ， KCl250mM， tween-200.2%） 5L， 10mm 的 dNTP0.5-1.5L， 25mM 的 MgCl21-5L， 10 引 物 。

20、混 合 物 2.5L( 包括 IAC 在内的待测目标的引物浓度 0.4M-4M)， pET28a0.0003-0.01ng， DNA 模板 2-5L， 去离子水补至 25L。 0043 多重体系的反应条件如下 ： 0044 a ： 95 4min ； 0045 b ： 95 30s， 0046 c ： 55-68 30-60s， 0047 d ： 72 30-120s， b-d 循环 30-35 个反应 ； 0048 h:72 5-10min。 0049 4、 多重 PCR 产物分析和结果判定 0050 将 5L 多重 PCR 产物上样至 2% 琼脂糖凝胶电泳或者使用全自动凝胶电泳分析 PCR。

21、 产物片段大小， 根据片段大小对照表 1 判定菌株是否是志贺氏菌的同时确定其群和血 清型别。 0051 5、 检测体系的验证 0052 针对已经建立的志贺氏菌群和血清型鉴定多重 PCR 检测方法进行特异性验证和 敏感性验证。 0053 特异性验证 ： 选择大肠埃希氏菌 ATCC25922、 阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门 氏菌、 副溶血性弧菌、 单核细胞增生性李斯特氏菌、 霍乱弧菌、 蜡样芽孢杆菌、 空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌、 阪崎肠杆菌、 小肠结肠炎耶尔森氏菌、 嗜水气单胞作为特异性评估用菌株， 进 行核酸提取， 采用前期建立和优化的反应条件进行检测。结果表明所有反应 IAC （阳性内。

22、对 照） 均为阳性。除 IAC 外， 阴性对照和特异性验证菌株无非特异性条带扩增， 重复检测结果 全部一致。表明该检测方法具有较好的特异性， 能够将非目标菌有效区分开。 0054 敏感性验证 ： 对初始浓度为 108CFU/mL 的福氏 2a 型志贺氏菌、 福氏 6 型志贺氏菌、 痢疾型志贺氏菌、 宋内志贺氏菌的菌悬液提取总 DNA， 进一步稀释到 107CFU/mL， 106CFU/ mL， 105CFU/mL， 104CFU/mL， 103CFU/mL。采用前期建立和优化的反应条件进行检测， 所有待检 目标的检测限均在 105CFU/mL， 重复检测结果全部一致， 表明该检测方法具有高度的。

23、敏感性 和重复性。 0055 本发明还提供了一种快速检测试剂盒， 所述试剂盒包括前述的引物组、 阳性内对 说 明 书 CN 103451307 A 6 5/9 页 7 照引物对、 阳性内对照模板、 DNA 聚合酶、 反应体系缓冲液、 Mg2+、 dNTP 和去离子水。 0056 本发明的有益效果在于 ： 0057 本发明建立的志贺氏菌群和血清型鉴定多重 PCR 检测方法， 能够将检测时间从传 统方法的 3-5 天缩短到 2 小时， 达到如下的检测效果 ： 0058 （一） 多重检测 0059 本发明所建立的检测方法能够在一次 PCR 反应中鉴定志贺氏菌属的同时， 筛查福 氏 1-5 型、 福氏。

24、 6 型、 宋内和痢疾型志贺氏菌。检测方法全面涵盖了我国最主要的志贺氏 菌流行株和暴发株。2 个小时内快速获得检测结果， 节省时间、 人力和物力成本。 0060 （二） 特异性高 0061 本发明所建立检测方法的特异性主要体现在一整套特异性引物的特异性， 所有 引物都经过 Blast 比对分析， 具有高度的保守性和特异性 ； 同时特异性实验表明本发明 的引物能够很好的区分与志贺氏菌种属相近、 生存环境相同的细菌， 包括大肠埃希氏菌 ATCC25922、 阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 副溶血性弧菌、 单核细胞增生性李斯 特氏菌、 霍乱弧菌、 蜡样芽孢杆菌、 空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌。

25、、 阪崎肠杆菌、 小肠结肠炎耶尔 森氏菌、 嗜水气单胞等。 0062 （三） 灵敏度高 0063 本发明所建立的检测方法能够实现 5 个基因的同时检测， 反应体系中每个目标基 因的检测灵敏度均可达到 105CFU/ml， 与单重 PCR 检测敏感度相当 ； 同时不同基因的检测灵 敏度在同一水平线上， 避免了对不同志贺氏菌群和血清型混合感染的漏检。 0064 （四） 成本较低 0065 本发明所建立的多重 PCR 检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本， 原来 单重检测需要 5 次人工和 5 倍时间， 现在使用此方法只需要 1 次人工和 1 个反应的时间 ； 该 多重检测方法同时节省了重复检。

26、测同一个样本的试剂消耗， 最大可节省 50% 以上的试剂成 本。 0066 （五） 预防假阴性结果 0067 体系中添加的 IAC， 可以有效的提示假阴性检测结果。 0068 本发明为志贺氏菌快速筛查提供了完备的解决方案， 能实现食物中毒事件发生和 传染病疫情暴发后的志贺氏菌群和血清型别的快速鉴定， 为合理恰当处置疫情提供可靠的 依据。 0069 本发明克服现有技术操作繁琐、 耗时耗力、 难以开展均一质量控制等缺点和不足， 解决志贺氏菌属及群别和血清型别快速鉴定的难题。基于志贺氏菌属通用和相应的群、 血 清型的 O 抗原编码基因序列， 设计一套志贺氏菌属、 群别和血清型别鉴定的引物序列， 建立。

27、 基于该引物序列的多重 PCR 检测方法， 同时在体系中加入阳性内对照， 一个反应体系中完 成内部质量控制。 附图说明 0070 图 1 为本发明实施例 2 中特异性分析的 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 ； 0071 其中 ： M:AL5000DNA marker ； 1.FS6-1 ； 2.FS6-1 ； 3.FS6-3 ； P. 阳性对照。 0072 图 2 为本发明实施例 2 中敏感性评估的 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 ； 说 明 书 CN 103451307 A 7 6/9 页 8 0073 其中 ： M:AL5000DNA marker ； 1.FS6-1 ； 2.FS。

28、6-1 ； 3.FS6-3。 0074 图 3 为本发明实施例 4 中志贺氏菌群 / 血清型多重 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳 结果 ； 0075 其中 ： M:AL5000DNA marker ； 1. 福氏 2a 型志贺氏菌 ； 2. 福氏 6 型志贺氏菌 ； 3. 宋 内志贺氏菌 ； 4. 痢疾型志贺氏菌 ； 5. 鲍氏志贺氏菌 ； 6. 空白对照 ； 7. 阳性对照。 具体实施方式 0076 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0077 实施例 1 福氏 6 型 O 抗原编码基因 wzx 的引物设计与合成 0078 在 Genbank 中查找福氏 6 型 O 抗原。

29、编码基因 wzx( 福氏 6 型 ) 的全长序列 10 条， 把 10 条 wzx( 福氏 6 型 ) 基因全长序列导入 Mega4 软件中， 使用 alignment 功能比对分析 wzx( 福氏 6 型 ) 基因的保守序列， 获得保守序列区段， 碱基序列如序列表 SEQ ID No.14 所 示。 0079 把 wzx( 福氏 6 型 ) 基因序列输入 primer premier6 软件中， 自动分析获得多种引 物设计方案。在此基础上手动调节引物位置和序列长度， 将 Tm 值设定为 555， GC 含量 35% 65%， 尽可能不产生发夹结构和引物二聚体， 无错误引发产生。将上述手动调节。

30、获得 的引物设计方案在NCBI网站上进行Blast分析， 如果其中任何引物对与非目标菌存在交叉 反应， 需要重新调整引物的位置和序列长度， 直至获得高特异性的 wzx( 福氏 6 型 ) 基因引 物序列。最终获得如表 2 所示的三种 wzx( 福氏 6 型 ) 基因引物备选方案。 0080 表 2 wzx( 福氏 6 型 ) 基因引物备选方案 0081 引物编号上游序列 （5 -3 ）下游序列 （5 -3 ）扩增长度 （bp） FS6-1ACTTGTTAAACCAAGTCTGGAGCACTTAGTAATCCTCCAT143 FS6-2AGCTACCATACCCTTATACTTGGCACTTAG。

31、TAATCCTCCATGA159 FS6-3AGCTACCATACCCTTATACTTGATAGCACTTAGTAATCCTC162 0082 其他基因的引物设计方法与 wzx( 福氏 6 型 ) 基因相同。获得的引物备选方案均 在 invitrogen 公司合成。 0083 实施例 2 志贺氏菌检测引物筛选试验 0084 对表 2 中 wzx( 福氏 6 型 ) 基因引物备选方案进行筛选， 主要评估引物的特异性和 敏感性。 0085 特异性评估 ： 提取大肠埃希氏菌 ATCC25922、 阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门 氏菌、 副溶血性弧菌、 单核细胞增生性李斯特氏菌、 霍乱弧菌、 蜡。

32、样芽孢杆菌、 空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌、 阪崎肠杆菌、 小肠结肠炎耶尔森氏菌、 嗜水气单胞等细菌的总 DNA， 每种细菌取 10L 提取液， 混合成一个综合 DNA 模板， 作为特异性验证用模板， 使用 Nanodrop 测定其 DNA 含量为 183.37ng/L。 0086 用 TE（pH8.0）溶液将引物分别稀释成 100M 的贮存液后， 再配制成相应的使 用液。按照如下操作配置反应体系 ： Taq DNA 聚合酶 0.4L（5U/L） ， 5PCR buffer 说 明 书 CN 103451307 A 8 7/9 页 9 （Tris HCl100mM（PH8.3） ， KCl250m。

33、M， tween-200.2%） 5L， dNTP1.25L（10mM） ， MgCl24L （25mM） ， 待评估引物 1L（10M） ； 特异性验证 DNA 模板 5L， 去离子水补至 25L。按照 如下反应条件进行 PCR 扩增 ： 0087 a ： 95 4min ； 0088 b ： 95 30s， 0089 c ： 62 30s， 0090 d ： 72 45s， b-d 循环 30 个反应。 0091 PCR 扩增产物 5L 使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析结果如图 1 所示。 0092 由图 1 可知， 在阳性对照成立的前提下， 设计的三组志贺氏菌引物对 FS6-1、 FS6-。

34、2、 FS6-3 与大肠埃希氏菌 ATCC25922、 阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 副溶血 性弧菌、 单核细胞增生性李斯特氏菌、 霍乱弧菌、 蜡样芽孢杆菌、 空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌、 阪崎肠杆菌、 小肠结肠炎耶尔森氏菌、 嗜水气单胞等生境相似、 高频并存的菌均无交叉反 应。因此可认为， 三对引物 FS6-1、 FS6-2、 FS6-3 均具有较好的特异性。 0093 敏感性评估 ： 选择福氏 6 型志贺氏菌进行培养， 调整菌液浓度至 108CFU/mL， 梯度 稀释到105CFU/mL， 作为FS6引物敏感性评估的模板。 体系配置如下 ： Taq DNA聚合酶0.4L （5U。

35、/L） ， 5PCR buffer（TrisHCl100mM（PH8.3） ， KCl250mM， tween-200.2%） 5L， dNTP1.25L（10mM） ， MgCl24L（25mM） ， 待评估引物 1L（10M） ； 模板 2L， 去离子水 补至 25L。 0094 PCR 反应条件同特异性实验。 0095 PCR 扩增产物 5L 使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析结果如图 2 所示。由图 2 可以看 出， 三个引物对均可以达到 105CFU/mL， 其中引物对 FS6-3 的条带亮度最高， 其次是 FS6-1、 FS6-2。 0096 综合敏感性和特异性评估结果， 选择 FS6。

36、-3 作为 wzx（福氏 6 型） 基因扩增的最终 引物。 0097 其他志贺氏菌属、 群和血清型检测引物的评估方法与福氏 6 型引物相同。 0098 实施例 3 志贺氏菌群和血清型鉴定多重 PCR 检测试剂盒的组建 0099 该试剂盒由 2 反应体系缓冲液、 DNA 聚合酶、 10 引物混合液、 阳性对照、 去 离 子 水 构 成， 其具体组分如下 ： 2PCR Buffer（TrisHCl40mM（PH8.3） ， KCl100mM， tween-200.08%， 0.0006ng/L pET28a， 1mm dNTP、 8mm MgCl2） ； 25DNA 聚合酶 （2U/L） ； 10。

37、 引物混合液 ( 包括 IAC 引物在内的每种引物浓度均为 2um)， 阳性对照 （福氏 2a 型、 福 氏 6 型、 痢疾型和宋内志贺氏菌的混合模板， 每种 106CFU/mL） 。 0100 试剂盒检测的反应体系为 25L， 其配置如下 ： 2PCR Buffer12.5L ； 25DNA 聚合酶 1L ； 10 引物混合液 2.5L ； 模板 2L， 去离子水 7L。 0101 实施例 4 试剂盒的操作和结果判断 0102 1、 核酸的提取 0103 取增菌液或划线培养的菌落溶于水中， 按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取模 板 DNA。用 NanoDrop 测定提取总 DNA 的浓度。 。

38、0104 2、 反应体系的配制 0105 取200L的PCR管配置25L的反应体系， 其配置如下 ： 2PCR Buffer12.5L ； 说 明 书 CN 103451307 A 9 8/9 页 10 25xDNA 聚合酶 1L ； 10 引物混合液 2.5L， 模板 2L， 去离子水 7L。 0106 3、 PCR 反应 0107 将 PCR 管放入 Bio-Rad C1000 型 PCR 仪中， 开启热盖后， 按照如下程序进行 PCR 反 应 ： 95 4min ； 95 30s， 62 30s， 72 90s， 30 个循环 ； 72 5min。 0108 4、 琼脂糖凝胶电泳分析 P。

39、CR 产物 0109 取 5L 的 PCR 产物与 1L 的 6xloading buffer 混匀， 加入到琼脂糖凝胶的加样 孔中。 采用2%的琼脂糖凝胶， 5V/cm电泳60min， 使用凝胶成像仪显示扩增目标条带的大小。 0110 5、 结果判断 0111 PCR 扩增结果如图 3 所示， 由图 3 可知 ： 0112 A. 包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增， 空白对照有 IAC 的扩 增， 其他检测有目标条带和 （或） IAC 的扩增， 表明所有 PCR 反应均成立， 排除假阴性的结果。 否则视实验无效， 需要重复。 0113 B. 所有志贺氏菌都有一条 210bp 的 。

40、ipaH 扩增条带 ； 在此基础上， 宋内志贺氏菌有 一条 505bp 的扩增条带， 1-5 型的福氏志贺氏菌有 372bp 的扩增条带， 痢疾型志贺氏菌有 279bp 的扩增条带， 福氏 6 型有一条 162bp 的扩增条带。阳性对照为福氏 2a 型、 福氏 6 型、 宋内、 痢疾 I 型志贺氏菌的混合模板， 所有的条带均有扩增， 表明本试剂盒有检测混合感染 的能力。 0114 实施例 5 试剂盒的保存期试验 0115 以 105CFU/mL 的福氏 2a 型、 福氏 6 型、 宋内、 痢疾 I 型志贺氏菌混合模板为评估用 检测样本。将组建完毕的试剂盒放置于 -20保存， 分别取 0、 10。

41、、 20、 30、 60、 90、 120、 150 和 180 天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表 3 所示 ： 0116 表 3 保存期试验结果 0117 保存期目标基因阳性个数 （包括 IAC） 第 0 天6 个 第 10 天6 个 第 20 天6 个 第 30 天6 个 第 60 天6 个 第 90 天6 个 第 120 天6 个 第 150 天6 个 第 180 天6 个 说 明 书 CN 103451307 A 10 9/9 页 11 0118 注 ： 阳性内对照每次检验均为阳性。 0119 实施例 6 试剂盒的特异性试验 0120 选择大肠埃希氏菌 ATCC25922、。

42、 阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 副溶血性 弧菌、 单核细胞增生性李斯特氏菌、 霍乱弧菌、 蜡样芽孢杆菌、 空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌、 阪 崎肠杆菌、 小肠结肠炎耶尔森氏菌、 嗜水气单胞等与志贺氏菌种属相近， 存在环境相似的细 菌作为待检细菌。 应用本发明试剂盒检测这些待检细菌， 阳性内对照均为阳性， 证明检测系 统成立 ； 待检细菌均未出现非特异性的杂带。且对目标菌检测时， 除特异性条带外， 无杂带 产生。表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌， 具有较好的特异性。 0121 实施例 7 试剂盒的敏感性试验 0122 评估用检测样本 ： 选择 4 个特定检测的志贺氏菌菌株 ： 福。

43、氏 2a 型、 福氏 6 型、 宋 内、 痢疾 I 型志贺氏菌， 1 个非检测目标菌株 ： 鲍氏型。将 5 个模板的浓度分别调整至 109CFU/mL， 等比例混合成综合模板。将综合模板梯度稀释成 108CFU/mL， 107CFU/mL， 106CFU/ mL， 105CFU/mL， 104CFU/mL 的检测样品。 0123 使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的混合模板。根据实例 4 进行操作和结果 判断， 试剂盒检测 5 个目标基因 ( 不含 IAC) 的敏感性试验结果如表 4 所示 ： 0124 表 4 试剂盒检测志贺氏菌敏感性试验结果 0125 0126 从表 4 看出， 试剂盒检测。

44、福氏 1-5 型、 福氏 6 型、 痢疾型、 宋内志贺氏菌和其他型 别志贺氏菌的敏感度均可以达到 105CFU/mL。 0127 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103451307 A 11 1/6 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 103451307 A 12 2/6 页 13 0003 序 列 表 CN 103451307 A 13 3/6 页 14 0004 序 列 表 CN 103451307 A 14 4/6 页 15 0005 序 列 表 CN 103451307 A 15 5/6 页 16 0006 序 列 表 CN 103451307 A 16 6/6 页 17 序 列 表 CN 103451307 A 17 1/1 页 18 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103451307 A 18 。