一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103436619 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436619 A *CN103436619A* (21)申请号 201310378688.2 (22)申请日 2013.08.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) (71)申请人 塔里木大学 地址 843300 新疆维吾尔自治区阿拉尔市虹 桥南路 705 号 (72)发明人 喻华英 石长青 焦海宏 任敏 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性。

2、大肠杆菌的 方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 犊 牛 腹 泻 病 中 鉴 定 非 典 型 性 大 肠 杆 菌 的 方 法， 步 骤 包 括 ： 犊 牛 发 生 腹 泻 后 病 料 的 采 集 与 标 记 ； 细 菌 的 增 菌， 细 菌 的 鉴 定 和 选 择 性 特 殊 培 养 基 培 养， 菌 体 的 处 理 ； 设 计 两 对 诊 断 性 引 物 eaeA，P1 ： 5-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3 ， P2 ： 5-CCAGACGATACGATCCAG-3 ， 预 期 扩 增 出 的 目 的 片 段 大 小， bfpA 基 因 P1 ： 5-TGTA。

3、TATTGGGCAGACC-3 ，P2 ： 5 -CAGGGCGTATTATGTAGA-3 ， 预期扩增出的目的 片段大小 ； PCR 扩增反应 ； 记录革兰氏染色镜检结 果， 大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平 板生长结果， 毒力基因 eaeAPCR 结果 ； 将 eaeA 所 测序列与 GeneBank 中的序列进行比对， 对 eae 序 列进行分析， 对核苷酸序列分析 ； 将蛋白序列在 NCBI 中进行比对， 得到该蛋白的结构域。本发明 结合传统大肠杆菌的选择性特殊培养对样品进行 初步纯化， 获得单菌落， 可提高 PCR 检测的准确 性， 可行性强。 (51)Int.Cl. 权利。

4、要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103436619 A CN 103436619 A *CN103436619A* 1/2 页 2 1. 一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 该犊牛腹泻病中鉴 定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤 ： 步骤一、 犊牛发生腹泻后病料的采集与标记 ； 步骤二、 细菌的增菌， 细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养， 菌体的处理 ； 步 骤 三、设 计 两 对 诊 断 性 引 物 eaeA， P1 ： 5 -CTG。

5、AACGGCGATTACGCGAA-3 ； P2 ： 5 -CCAGACGATACGATCCAG-3 ，预 期 扩 增 出 的 目 的 片 段 大 小 ； bfpA 基 因， P1 ： 5 -TGTATATTGGGCAGACC-3 ； P2 ： 5 -CAGGGCGTATTATGTAGA-3 ， 预期扩增出的目的片段大 小 ； 步骤四、 PCR 扩增反应 ； 步骤五、 记录革兰氏染色镜检结果， 大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平板生 长结果， 毒力基因 eaeAPCR 结果 ； 步骤六、 将 eaeA 所测序列与 GeneBank 中的序列进行比对， 对 eae 序列进行分析， 对核 。

6、苷酸序列分析 ； 步骤七、 将蛋白序列在 NCBI 中进行比对， 得到该蛋白的结构域。 2. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 病 料的采集与标记的具体方法为 ： 犊牛发生腹泻后， 用干净竹签选取含有粘液、 脓血病变成分的粪便， 也可用棉签取黏 附在肛门附近的腹泻粪便， 装于无菌的容器内， 低温保存， 并对病料进行编号， 一月龄 1-24 号， 10 天内 25-30 号。 3. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 细 菌的增菌方法为 ： 在无菌操作台， 用接种环取采集的粪便于 LB 液体培养基中， 放入气浴。

7、恒温振荡器中， 于 37缓慢震荡过夜。 4. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 细 菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为 ： 用接种环挑取增菌液， 在普通琼脂平板进行划线 ； 置于 37恒温培养箱内培养 24h， 每板选取单个菌落， 进行革兰氏染色镜检， 选取阴性 菌 ； 选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平板、 37恒温培养箱 内培养 24h， 观察结果。 5. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 菌 体的处理的方法为 ： 将每一株菌接在两支LB培养液中， 过夜培养， 一支进行5。

8、次离心， 弃上清， 收集菌体， 加 入 100L 灭菌水， 悬浮菌体后 100煮沸 5min， 离心作为 PCR 模版， 在 -70冰箱保存。 6. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 扩 增反应条件 ： eaeAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 44.4退火 1min， 72延伸 1min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； bfpAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 51退火 30s， 72延伸 30s， 共 权 利 要 求 书 CN 103436619 。

9、A 2 2/2 页 3 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶， 100V 电泳 30min， 凝胶成像系统拍照观察结果。 7. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 经 革兰氏染色镜检， 得到革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌， 用选择性特殊培养基培养和生化方法 鉴定革兰氏阴性菌。 8. 如权利要求 1 所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 其特征在于， 判 定非典型性 EPEC 的方法为 ： 从分离鉴定的大肠杆菌中， 利用 PCR 技术筛选出四株大肠杆菌含有 eaeA 基因、 bfpA 无 带，。

10、 判定为非典型性 EPEC。 权 利 要 求 书 CN 103436619 A 3 1/8 页 4 一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法 技术领域 0001 本发明属于犊牛腹泻病病因领域， 尤其涉及一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠 杆菌的方法。 背景技术 0002 大肠埃希菌是一种重要的危害严重的肠道致病菌， 它是一组革兰氏阴性菌， 是人 和动物肠道的正常菌群， 多数不致病， 且在肠道中合成 B 族维生素和维生素 K 而被动物利 用。当宿主免疫力低下或大肠杆菌侵入肠外组织和器官时， 可引起肠外感染。有少数菌株 可直接引起肠道感染， 这些大肠杆菌称为致病性大肠杆菌。 0003 根据致病性大。

11、肠杆菌的致病特点分为 5 类 ： 肠产毒性大肠杆菌 ETEC， 肠致病性大 肠杆菌 EPEC， 肠侵袭性大肠杆菌 EIEC， 肠粘附性大肠杆菌 EAEC 和肠出血性大肠杆菌 EHEC 等。 0004 肠产毒性大肠杆菌主要在小肠内繁殖， 致病物质是不耐热肠毒素和耐热肠毒素两 种毒素， 这两种毒素可引起腹泻。肠致病性大肠杆菌在十二指肠、 空肠和回肠上段大量繁 殖， 一般不产生肠毒素， 可引起水样腹泻， 粪便中带有黏液。肠侵袭性大肠杆菌是国际公认 的食物中毒病原菌， 主要黏附结肠黏膜上皮细胞并在此生长繁殖， 死亡后产生内毒素， 引起 肠黏膜细胞的炎性反应和溃疡， 出现血性腹泻。肠出血性大肠杆菌， 可。

12、产生志贺样毒素， 可 导致出血性结肠炎、 严重腹泻和便血。自 1982 年在美国首次从腹泻病人粪便中分离得到肠 出血性大肠埃希菌 （EHEC） O157:H7 以来， 由其引起的食源性疾病在发达国家和一些发展中 国家不断发生， 且呈逐年上升的趋势。 大肠杆菌长期驻留在牛、 羊、 猪、 鸡等家畜家禽的肠道 中， 造成动物的腹泻， 并污染肉奶蛋制品、 水源和粮食等， 给畜牧业生产造成巨大的损失， 对 人们的健康构成了巨大威胁。其感染具有爆发流行趋势、 致病性、 致死性等特点， 已经成为 全球性的公共卫生问题。 0005 在世界范围内， 每年肠致病性大肠杆菌感染给人类和畜牧业造成巨大损失， 每年 引。

13、起 200 百万死亡 （WHO,2002） 。大肠杆菌可导致的疾病 :1. 肠道外感染 : 多为内源性感 染， 以泌尿系感染为主， 如尿道炎、 膀胱炎、 肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、 胆囊炎、 阑尾炎等。 婴儿、 年老体弱、 慢性消耗性疾病、 大面积烧伤患者， 大肠杆菌可侵入血流， 引起败血症。早 产儿， 尤其是生后 30 天内的新生儿， 易患大肠杆菌性脑膜炎。2. 急性腹泻 : 某些血清型大 肠杆菌能引起人类腹泻。其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻， 出现轻度水 泻， 也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性， 一般 2 3 天即愈， 营养不良者可达数周， 也可反复发作。肠出血性大肠杆。

14、菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎， 可产生志贺氏毒 素样细胞毒素。此外， 肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌， 有高度传染性， 严重者 可致死。细菌侵入肠道后， 主要在十二指肠、 空肠和回肠上段大量繁殖。 0006 致泻性大肠杆菌是大肠埃希氏菌 （E.coli） 中一类能引起食物中毒和婴儿腹泻 的重要病原菌， 并且它也是引起幼畜腹泻的重要病原菌。随着奶牛场规模扩大和犊牛饲 养密度增加， 犊牛腹泻大肠杆菌病已成为奶牛养殖业重要的疾病。该病主要有初生犊牛 说 明 书 CN 103436619 A 4 2/8 页 5 腹泻和犊牛败血症。其重要特征是能在感染家畜和婴儿的肠上皮细胞或在组织培养细胞。

15、 表面形成特征性的组织病理学损伤， 导致肠道内刷状边缘上皮细胞排列紊乱， 使其功能受 损而造成严重腹泻 , 称为粘附与脱落 （A/E） 。粘附和脱落大肠杆菌类似人的肠致病性大 肠杆菌 （EPEC） ， 通过细菌外膜蛋白紧密素局灶性粘附于小肠上皮细胞表面， 引起粘附和 脱落 （A/E）病变。其中 EPEC， EIEC， EAEC 有共同的致病机制 ： 即能形成吸附擦拭损伤素 （AttachingandEffacingLesionA/E） ， 是由 eae 基因编码的。 0007 Eae(E.coliattachingandeffacing) 基因是位于肠细胞消除表位 （LEE） 致病岛， LEE。

16、 是由三部分组成 ：（1） 紧密素 （eaeA 编码） （2） 三型分泌系统 （EspA 基因编码） （3） 紧密 素转换受体 （Tir 基因编码） ， 其中被称为紧密素 (Intimin 或 Eae) 是编码一个 94-97kDa 的 外膜蛋白， 紧密素属于细菌粘附分子家族， 可介导细菌与肠上皮细胞紧密粘附， 是 EHEC 和 EPEC在人肠道粘膜定居并引起AE损伤所必需的。 其致病特征是细菌与肠上皮细胞紧密 粘附， 肠微绒毛消失， 细菌粘附部位的肠上皮细胞骨架发生改变， 丝状肌动蛋白聚集等。后 来的研究发现在所有能引起AE损伤的EHEC、 EPEC、 弗氏柠檬酸菌和蜂房哈夫尼菌等菌中 都检。

17、测到eae基因或其同源序列， 而肠产毒素大肠杆菌ETEC中则没有这种序列。 研究发现 ： eaeA 基因位于 LEE 致病岛， 核苷酸序列分析表明 ： EPECE2384 69 的 eae 基因含有 2817bp 的开放阅读框 (ORF)， 编码一个含 939 个氨基酸残基的蛋白质分子。EHECEDL933 的 eae 基 因含有 2802bp 的 ORF， 编码一个含 934 个氨基酸残基的蛋白质分子， 不同的 O157 ： H7 菌株 紧密素的 N 端序列是高度保守的， EHEC 和 EPECeae 基因序列从 N 末端起最初的 704 个氨基 酸同源性为 94， 这就为疫苗的研制提供了必。

18、要的候选基因的基础。其余 C 末端氨基酸同 源性为 49， C 末端与肠细胞的特异性粘附有关， 正是这一差别决定 EPEC 和 EHEC 在体内发 生病变的部位不同。EPEC 定居于小肠， 而 EHEC 定居于大肠。 0008 Jerse 和 Kaper 曾 报 道 eae 基 因 表 达 受 一 个 编 码 BFP 菌 毛 的 EAF （EPECadhencefactor) 质 粒 影 响， 该 质 粒 广 泛 分 布 于 各 种 的 EPEC 中。BFP 被 称 为 （Thebundle-formingpilus） 捆绑式菌毛， 又称为型菌毛 （Tfps） ， 该菌毛在细菌的定殖、 黏 附。

19、作用、 自动聚集、 生物膜的形成、 运动性和细菌自然传递等起着重要作用， 是 EPEC 又一个 重要致病因子， EBF 是由不同的 bfpA 等位基因组成， bfpA 是编码束霉素蛋白 （bundlin） 基 因， 大小 528bp。BFP 是由反复重复的束霉素亚单位互相缠绕形成如同 “绳” 状结构。bfpA 的亚单位有 9 种 ：（1） 3 个 等位基因， 每个等位基因彼此相似， 所产生的蛋白中 97% 的氨 基酸是一致的。 （2） 6 个 等位基因， 每个等位基因彼此不同， 但所产生的蛋白中 89% 的氨 基酸是一致的， 所有束霉素亚单位编码的蛋白中有 80% 的氨基酸是一致的。在感染同一。

20、种 宿主细胞可产生几种菌毛， 有利于帮助细菌逃避宿主的免疫监视系统， 从而形成持久感染。 种类多样的束霉素蛋白可形成丰富的抗原， 具有一定可免疫原性， 一般 型束霉素的蛋白 免疫原性较差， 5 型束霉素蛋白无免疫原性。 型束霉素的免疫原性较高， 用纯化的束霉 素蛋白免疫兔和小鼠产生相应的抗体， 该抗体识别同一亚型的束霉素的抗体滴度远高于不 同型的绑定素， 种类不同的束霉素蛋白是保守的， 但抗体存在相互交叉识别现象。 动物感染 一种 bfpA 亚型的菌毛后， 该菌毛可在宿主体内组装所有的其他亚型束霉素， 从而形成种类 多样的束霉素蛋白。 0009 随着生物技术的发展， 在分子水平上分析病原菌的基。

21、因多态性格外有意义。选择 大肠杆菌中两个高度保守的致病毒力基因 （eaeA， bfpA） 设计有关引物， 对犊牛腹泻病的 说 明 书 CN 103436619 A 5 3/8 页 6 EPEC 进行标准化分型 ： 典型性 EPEC （TypicalEPEC）（eaeA+， bfpA+） 非典型性 EPEC(Atypical EPEC)（eaeA+， bfpA-） 。典型的 EPEC 主要流行在发展中国家， 引起 2 岁儿童出现腹泻， 非典 型EPEC主要流行发达国家引起腹泻。 然而目前数据统计显示 ： 包括在发展中国家和发达国 家， 非典型 EPEC 的流行趋势高于典型的 EPEC， 而且可出。

22、现长达 14 天的持久腹泻。 0010 目前我国对犊牛腹泻病中 EPEC 的诊断和流行病学调查主要仍处于对菌株的血清 型鉴定， 对是否携带有相应的毒力因子 eaeA， bfpA， 检测 LEE 毒力岛 （毒力岛是细菌染色体 上编码毒力相关基因的特殊区域， 是某些细菌在进化过程中适应环境的变化而获得的毒力 基因， 通过检测 eaeA 基因） 应为鉴定 EPEC 的主要依据。 0011 由于粪便标本中存在着已知和未知的抑制或干扰 PCR 检测的成分， 使得这一技术 在粪标本检测的应用上受到一定程度的限制。 发明内容 0012 本发明实施例的目的在于提供一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 。

23、旨在解决由于粪便标本中存在着抑制或干扰 PCR 检测的成分， 使得粪标本检测受到一定程 度的限制的问题。 0013 本发明实施例是这样实现的， 一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法， 该犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤 ： 0014 步骤一、 犊牛发生腹泻后病料的采集与标记 ； 0015 步骤二、 细菌的增菌， 细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养， 菌体的处理 ； 0016 步 骤 三、设 计 两 对 诊 断 性 引 物 eaeA， P1 ： 5 -CTGAACGGCGATTACGCGAA-3 ； P2 ： 5 -CCAGACGATACGATCCAG-3 ，预 期 扩 增。

24、 出 的 目 的 片 段 大 小 ； bfpA 基 因， P1 ： 5 -TGTATATTGGGCAGACC-3 ； P2 ： 5 -CAGGGCGTATTATGTAGA-3 ， 预期扩增出的目的片段大 小 ； 0017 步骤四、 PCR 扩增反应 ； 0018 步骤五、 记录革兰氏染色镜检结果， 大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平 板生长结果， 毒力基因 eaeAPCR 结果 ； 0019 步骤六、 将 eaeA 所测序列与 GeneBank 中的序列进行比对， 对 eae 序列进行分析， 对核苷酸序列分析 ； 0020 步骤七、 将蛋白序列在 NCBI 中进行比对， 得到该蛋白的结。

25、构域。 0021 进一步， 病料的采集与标记的具体方法为 ： 0022 犊牛发生腹泻后， 用干净竹签选取含有粘液、 脓血病变成分的粪便， 也可用棉签 取黏附在肛门附近的腹泻粪便， 装于无菌的容器内， 低温保存， 并对病料进行编号， 一月龄 1-24 号， 10 天内 25 30 号。 0023 进一步， 细菌的增菌方法为 ： 0024 在无菌操作台， 用接种环取采集的粪便于 LB 液体培养基中， 放入气浴恒温振荡器 中， 于 37缓慢震荡过夜。 0025 进一步， 细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为 ： 0026 用接种环挑取增菌液， 在普通琼脂平板进行划线 ； 0027 置于 37。

26、恒温培养箱内培养 24h， 每板选取单个菌落， 进行革兰氏染色镜检， 选取 说 明 书 CN 103436619 A 6 4/8 页 7 阴性菌 ； 0028 选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平板、 37恒温培 养箱内培养 24h， 观察结果。 0029 进一步， 菌体的处理的方法为 ： 0030 将每一株菌接在两支 LB 培养液中， 过夜培养， 一支进行 5 次离心， 弃上清， 收集菌 体， 加入 100L 灭菌水， 悬浮菌体后 100煮沸 5min， 离心作为 PCR 模版， 在 -70冰箱保 存。 0031 进一步， 扩增反应条件 ： 0032 eaeAPCR 反。

27、应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 44.4退火 1min， 72延伸 1min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； 0033 bfpAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 51退火 30s， 72延伸 30s， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； 0034 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶， 100V 电泳 30min， 凝胶成像系统拍照观察结果。 0035 进一步， 经革兰氏染色镜检， 得到革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌， 用选择性特殊培 养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。 0036 。

28、进一步， 判定非典型性 EPEC 的方法为 ： 0037 从分离鉴定的大肠杆菌中， 利用 PCR 技术筛选出四株大肠杆菌含有 eaeA 基因、 bfpA 无带， 判定为非典型性 EPEC。 0038 本发明提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法结合传统大肠杆菌的 选择性特殊培养对样品进行初步纯化， 获得单菌落， 可提高 PCR 检测的准确性， 利用 PCR 方 法针对大肠杆菌中的高度保守性毒力基因eaeA和bfpA基因作为标志性的诊断基因设计引 物， 可特异性的检测出非典型性大肠杆菌， 提高病原体的检出率， 用于临床快速诊断。本方 法是将大肠杆菌的选择性特殊培养和 PCR 相结合来快速诊。

29、断非典型 EPEC 的一种可行性的 方法。 附图说明 0039 图 1 是本发明实施例提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法流程图 ； 0040 图 2 是本发明实施例提供的革兰氏染色镜检结果示意图 ； 0041 图 3 是本发明实施例提供的大肠杆菌在麦康凯琼脂平板生长结果示意图 ； 0042 图 4 是本发明实施例提供的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板生长结果示意图 ； 0043 图 5 是本发明实施例提供的大肠杆菌 eaeAPCR 扩增结果示意图 ； 0044 图 6 是本发明实施例提供的蛋白的结构域 PRK15318 的示意图 ； 0045 图 7 是本发明实施例提供的基因比对获得的基因。

30、树示意图。 具体实施方式 0046 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0047 图 1 示出了本发明提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法的流程。为 说 明 书 CN 103436619 A 7 5/8 页 8 了便于说明， 仅仅示出了与本发明相关的部分。 0048 本发明的实施例提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步 骤 ： 0049 步骤一、 犊牛发生腹泻后病料的采集与标记 ； 0050 步骤二、 细菌的增菌， 细菌的鉴定。

31、和选择性特殊培养基培养， 菌体的处理 ； 0051 步 骤 三、设 计 两 对 诊 断 性 引 物 eaeA， P1 ： 5 -CTGAACGGCGATTACGCGAA-3 ； P2 ： 5 -CCAGACGATACGATCCAG-3 ，预 期 扩 增 出 的 目 的 片 段 大 小 ； bfpA 基 因， P1 ： 5 -TGTATATTGGGCAGACC-3 ； P2 ： 5 -CAGGGCGTATTATGTAGA-3 ， 预期扩增出的目的片段大 小 ； 0052 步骤四、 PCR 扩增反应 ； 0053 步骤五、 记录革兰氏染色镜检结果， 大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平 板生。

32、长结果， 毒力基因 eaeAPCR 结果 ； 0054 步骤六、 将 eaeA 所测序列与 GeneBank 中的序列进行比对， 对 eae 序列进行分析， 对核苷酸序列分析 ； 0055 步骤七、 将蛋白序列在 NCBI 中进行比对， 得到该蛋白的结构域。 0056 作为本发明实施例的一优化方案， 病料的采集与标记的具体方法为 ： 0057 犊牛发生腹泻后， 用干净竹签选取含有粘液、 脓血病变成分的粪便， 也可用棉签 取黏附在肛门附近的腹泻粪便， 装于无菌的容器内， 低温保存， 并对病料进行编号， 一月龄 1-24 号， 10 天内 25 30 号。 0058 作为本发明实施例的一优化方案，。

33、 细菌的增菌方法为 ： 0059 在无菌操作台， 用接种环取采集的粪便于 LB 液体培养基中， 放入气浴恒温振荡器 中， 于 37缓慢震荡过夜。 0060 作为本发明实施例的一优化方案， 细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方 法为 ： 0061 用接种环挑取增菌液， 在普通琼脂平板进行划线 ； 0062 置于 37恒温培养箱内培养 24h， 每板选取单个菌落， 进行革兰氏染色镜检， 选取 阴性菌 ； 0063 选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平板、 37恒温培 养箱内培养 24h， 观察结果。 0064 作为本发明实施例的一优化方案， 菌体的处理的方法为 ： 006。

34、5 将每一株菌接在两支 LB 培养液中， 过夜培养， 一支进行 5 次离心， 弃上清， 收集菌 体， 加入 100L 灭菌水， 悬浮菌体后 100煮沸 5min， 离心作为 PCR 模版， 在 -70冰箱保 存。 0066 作为本发明实施例的一优化方案， 扩增反应条件 ： 0067 eaeAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 44.4退火 1min， 72延伸 1min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； 0068 bfpAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 51退火 30s， 72延伸 30s， 共 。

35、30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存 ； 0069 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶， 100V 电泳 30min， 凝胶成像系统拍照观察结果。 说 明 书 CN 103436619 A 8 6/8 页 9 0070 作为本发明实施例的一优化方案， 经革兰氏染色镜检， 得到革兰氏阴性菌、 革兰氏 阳性菌， 用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。 0071 作为本发明实施例的一优化方案， 判定非典型性 EPEC 的方法为 ： 0072 从分离鉴定的大肠杆菌中， 利用 PCR 技术筛选出四株大肠杆菌含有 eaeA 基因、 bfpA 无带， 判定为非典型性 EPEC。 0。

36、073 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 0074 1 材料 0075 病料来源于阿拉尔市十团牛场， 采自 1 30 日龄犊牛的 30 份腹泻粪便。 0076 1.1 试剂 0077 10tagplusBuffer、DNTPMisture、TagplusNNApolymerase、 DL2000marke,6loadingBuffer、 EB、 1TAE、 EDTA,Tris 碱、 冰醋酸、 胰蛋白胨、 酵母提取 物、 氯化钠 （NaCl) 琼脂糖、 氢氧化钠 （NaOH） 、 无水氯化钙、 无水乙醇、 95% 乙醇、 75% 乙醇、 普 通琼脂培养基、 30% 甘油、。

37、 蒸馏水， 均购自 TIANGEN 公司 ； 高压灭菌的 0.1molCaCl2。LB 固体 培养基 ； 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 （离心柱型） ： 购自天根公司 ； 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA 片段试剂盒 ： 购自 TaKaRa 公司 ； 质粒小提试剂盒 ： 购自天根公司。 0078 1.2 仪器 0079 PCR 仪 ：（TC-5000BibbyscientificLtd） ； 电泳仪 ：（DYY-12 北京市六一仪器厂） ； 紫 外分析仪 ：（JY02S 北京君意电泳仪设备有限公司） ； 凝胶成像分析系统 ：（Tanon-4100 上海 天能科技有限公司） ； 小型离心机 ：（Si。

38、gmal-13LabwayScience） 。 0080 2 方法 0081 2.1 病料的采集与标记 0082 犊牛发生腹泻后， 用干净竹签选取含有粘液、 脓血等病变成分的粪便或用棉签或 其他无菌的东西取黏附在肛门附近的腹泻粪便 30 份， 装于无菌的容器内， 低温保存。然后 对病料进行编号， 一月龄 1-24 号， 10 天内 25 30 号。 0083 2.2 细菌的增菌 0084 在无菌操作台， 用接种环取少量采集的粪便于 LB 液体培养基中， 放入气浴恒温振 荡器中， 于 37缓慢震荡过夜。 0085 2.3 细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养 0086 用接种环挑取少许增菌液， 在普。

39、通琼脂平板进行划线。然后置于 37恒温培养箱 内培养24h， 每板选取单个菌落， 进行革兰氏染色镜检， 选取阴性菌。 选取革兰氏阴性单个菌 落接种麦康凯琼脂平板、 伊红美蓝琼脂平板、 37恒温培养箱内培养 24h， 观察实验结果。 0087 2.4 菌体的处理 0088 将每一株菌接在两支 LB 培养液中， 过夜培养， 一支进行 5 次离心， 弃上清， 收集菌 体， 加入 100L 灭菌水， 悬浮菌体后 100煮沸 5min， 离心作为 PCR 模版， 在 -70冰箱保 存。 0089 2.5 根 据 eaeAGeneBank(M58154.1)， bfpAGeneBank(Z12295.1)。

40、 上 已 经 发 表的肠致病性大肠杆菌的 eaeA 与 bfpA 毒力基因序列， 分别设计两对诊断性引物 eaeA， P1 ： 5 -CTGAACGGCGATTACGCGAA-3 ； P2 ： 5 -CCAGACGATACGATCCAG-3 ， 预期扩 增出的目的片段大小分别为 918bp。bfpA 基因， P1 ： 5 -TGTATATTGGGCAGACC-3 ； P2 ： 说 明 书 CN 103436619 A 9 7/8 页 10 5 -CAGGGCGTATTATGTAGA-3 ， 预期扩增出的目的片段大小分别为 412bp。该引物由上海生 物工程公司合成。 0090 2.3PCR 扩。

41、增反应条件 0091 反应体系 （50L） ： DNA 模板 1L， dNTP4.0L（含 MgCl2） ， 10PCRBuffer5.0l， Tag 酶 0.2L, 引物 P11L， 引物 P21L， ddH2O38L， 总体积为 50L。 0092 PCR 扩增条件 ： 0093 eaeAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 44.4退火 1min， 72延伸 1min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存。 0094 bfpAPCR 反应条件 ： 95预变性 5min， 94变性 1min， 51退火 30s， 72延伸 30s， 共 。

42、30 个循环， 最后 72延伸 10min， 4保存。 0095 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶， 100V 电泳 30min， 凝胶成像系统拍照观察结果。 0096 3 实验结果 0097 3.1 采集 30 份犊牛腹泻粪便。分离培养得到 251 株， 经革兰氏染色镜检， 革兰氏 染色镜检结果如图 2 所示， 得到 100 株革兰氏阴性菌， 革兰氏阳性菌有 151 株。用选择性特 殊培养基培养和生化方法鉴定 100 株革兰氏阴性菌， 得到在麦康凯琼脂平板长出红色单菌 落， 大肠杆菌在麦康凯琼脂平板生长结果如图 3 所示 ； 在伊红美蓝琼脂平板长出黑色带金 属光泽的为大肠杆菌， 大肠杆菌在伊。

43、红美蓝琼脂平板生长结果如图 4 所示， 由此分离得到 大肠杆菌 50 株。 0098 3.2 毒力基因 eaeAPCR 结果如图 5 所示 ： 0099 从50株临床分离鉴定的大肠杆菌中， 利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有eaeA 基因、 bfpA 无带， 可以判定为非典型性 EPEC(AtypicalEPEC)（eaeA+， bfpA-） ， 其阳性率为 8%。 0100 3.3 测序结果 0101 3.3.1 将 eaeA（菌号 4-8-8， 4-8-8-1， 3-8-2， 6-3） 所测序列与 GeneBank 中的序列 进行比对， 得出序列与 GeneBank 中的 eaeA 序列。

44、完全一致， 将所得序列呈递 GeneBank 数据 库， 获得序列基因登陆号为 ： JQ350701， JQ350702， JQ350703， JQ350704。利用 DNAstar 软件 对 eaeA4-8-8， 4-8-8-1， 3-8-2， 6-3 序列进行分析， 得到共同一致的序列， 序列如基因序列 表所示。 0102 DNAstar 软件对核苷酸序列分析得到 306 个氨基酸 ： 0103 LNGDYAKDTALGMASSQASSQLQAWLQHYGTAEVNLQSGNNFDGSSLDFLLPFYDSENMLAFGQVGAR YIDSRFTANLGAGQRFFLPENMLGYNVFI。

45、DQDFSGDNTRLGIGGEYWRDYFKSSVNGYFRMSGWHESYNKKDYDER PANGFDIRFNGYLPSYPALGAKLMYEQYYGDNVALFNSDKLQSNPGAATVGVNYTPIPLVTMGIDYRHGTGNEND LLYSMQFRYQFDKPWSQQIEPQYVNELRTLSGSRYDLVQRNNNIILEYKKQDILSLNIPHDINGTEHSTQKIQLI VKSKYGLDRIVW。 0104 将蛋白序列在 NCBI 中进行比对， 得到该蛋白的结构域 ： PRK15318， 如图 6 所示。 0105 与其他大肠杆菌 eaeA 序列进行比对， 得到基因树。

46、如图 7 所示。 0106 得到试验中呈递的 eaeA4-8-8， 4-8-8-1， 3-8-2， 6-3 的基因序列与 GeneBank 中其 它大肠杆菌 eaeA 的序列完全一致。从 50 株大肠杆菌中得到 4 株 eaeA+， bfpA-， 属于非典型 性大肠杆菌。非典型 EPEC 可引起幼龄动物长达 14 天的持久腹泻。由此可以得出 ： 在所采 说 明 书 CN 103436619 A 10 8/8 页 11 样品地区致犊牛腹泻的大肠杆菌中存在着非典型 EPEC， 它的致病作用值得临床兽医工作者 的进一步关注。 0107 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在。

47、本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 0108 申请人名称 ： 塔里木大学 0109 发明名称 ： 一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法 0110 序列表中序列的个数 ： 1 个序列 0111 序列标识符 ： ID 号 ： JQ350701， JQ350702， JQ350703， JQ350704 0112 序列的长度 ： 917bp 0113 序列的类型 ： DNA 0114 序列来源的生物名称 ： 大肠杆菌 0115 是核苷酸或氨基酸序列 : 为核苷酸序列 0116 核苷酸序列 ： 0117 CTGAACGGCGATTACG。

48、CGAAAGATACCGCTCTTGGTATGGCCAGCAGCCAGGCTTCGTCACAGTTGCA GGCCTGGTTACAACATTATGGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAGAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGAC TTCTTATTACCGTTCTATGATTCCGAAAACATGCTGGCATTTGGTCAGGTCGGTGCGCGTTACATTGACTCCCGC TTTACGGCAAATTTAGGTGCTGGCCAGCGTTTTTTCCTTCCTGAAAATATGTTGGGCTATAACGTCTTCATTGAT CAGGATTTTTCTGGTGATAATACCCGTTTAGGTATTGGTGGCGAATACTGGCGAGACTATTTCAAAAGTAGCGTT AACGGCTATTTCCGCATGAGCGGCTGGCATGAGTCATACAATAAGAAAGACTATGATGAGCGCCCGGCAAATGGT TTTGATATCCGCTTTAATGGCTATTTACCATCATATCCTGCATTAGGCGCCAAACTGATGTACGAACAGTATTAT GGTGAT。