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1、(10)申请公布号 CN 102965368 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965368 A *CN102965368A* (21)申请号 201210263302.9 (22)申请日 2012.07.27 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中国科学院水生生物研究所 地址 430072 湖北省武汉市武昌区东湖南路 7 号 申请人 首都师范大学 (72)发明人 戴和平 肖伟 魏婷 张超 张晓。
2、华 刘玉倩 (74)专利代理机构 武汉荆楚联合知识产权代理 有限公司 42215 代理人 王健 (54) 发明名称 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元 件盒及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种超敏感型酵母遗传毒性致 癌物生物传感器元件盒及其构建方法， 本发明还 公开了应用元件盒构建超敏感型酵母遗传毒性致 癌物生物传感器的方法， 涉及经过遗传基因改造 的微生物对遗传毒性致癌物的监测。将该生物传 感器元件盒应用于复合 DNA 损伤超敏感型七基因 缺失面包酵母突变株中， 可提高该生物传感器元 件盒的检测灵敏性。因此， 与现有技术相比， 本发 明具有对遗传毒性致癌物检测灵敏度高、 适用于 环。
3、境中低剂量存在的化学致癌物的检测、 对环境 污染物的检测范围广， 操作简便等优点。 该生物传 感器的发明可促进环境有害物质实时监测平台的 建立。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒， 其特征在于， 该元件盒为基于酵 母 DNA 损伤响应的HUG1-yEGFP-CYC1基因片段。 2. 实现权利要求 1 所述的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒的构建方 法， 其特征在于， 该方。
4、法包含下列步骤 ： (1) 从野生面包酵母中提取基因组 DNA 1a、 取野生面包酵母， 接种于 YPD 培养液中， 在 30， 200 转 / 分钟的条件下， 振荡培养 16 小时， 得到野生面包酵母菌液 ； 其中 ： YPD 培养液的配方重量百分比为 ： 酵母膏 1%， 蛋白胨 2%， 葡萄糖 2%， 余者为水 ； 1 、 取野生面包酵母菌液 1.5 毫升， 用 4000 转 / 分钟离心 2 分钟， 取沉淀物悬于 200 微升提取缓冲液中 ； 其中 ： 提取缓冲液的配方为 ： 曲拉通 X-100 2%, 十二烷基磺酸钠 1%, 氯化钠 0.1 摩 尔 , 乙二胺四乙酸 1 毫摩尔 , 三。
5、羟甲基氨基甲烷盐酸盐 10 毫摩尔 , 余者为水， pH 8.0 ； 1c、 加入 0.3 克酸洗玻璃珠、 100 微升酚、 100 微升氯仿， 震荡 3 分钟后， 以 12000 转 / 分 钟离心 10 分钟， 取上层液体 ； 1d、 加入所取液体体积 2 倍的无水乙醇， 在 -20静置 30 分钟， 以 12000 转 / 分钟离心 15 分钟， 去上清， 取沉淀物 ； 1e、 将沉淀物溶解于 20 微升无菌水， 即为野生酵母基因组 DNA ； (2)、 扩增HUG1启动子基因片段 野生面包酵母基因组作为扩增模板， 通过上游引物HUG1 Pro-1: 5 AA CTG CAG GCA A。
6、AA ACT AGA GCC AAG CC 3 和下游引物HUG1 Pro-2: 5 TTA GAC ATA TAG TTT TTT TTT ATT GCT G 3 ， 利用 PCR 技术， 扩增得到HUG1启动子基因片段 ； (3)、 扩增 yEGFP 编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段 质粒 PUG36 作为扩增模板， 通过上游引物yEGFP-1: 5 AAA ACT ATA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3 和下游引物yEGFP-2: 5 TAC ATG ACT TTG TAC AAT TCA TCC ATA C 3 ， 利用 PCR 技术， 扩增得到yEGF。
7、P编码区基因片段 ； 质粒 PUG36 作为扩增模板， 通过上游引物CYC1-1: 5 TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C 3 和下游引物CYC1-2: 5 TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3 ， 扩增得到终止子CYC1基因片段 ； (4)、 将上述HUG1启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段和终止子CYC1基因片段按 摩尔比 1 ： 1 ： 1 的比例作为扩增模板， 通过上游引物HUG1 Pro-1: 5 AA CTG CAG GCA AAA ACT AGA GCC AAG CC 3 和下游引物CY。
8、C1 Pro-2: 5 TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3 ， 扩增得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒， 即基于酵母DNA损 伤响应的HUG1-yEGFP-CYC1基因片段 ； 上述 PCR 的条件为 ： 94 5 分钟 ； 94 45 秒， 55 45 秒， 72 1 分钟， 30 个循环 ； 72 5 分钟。 3. 用权利要求 1 所述的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒构建超敏感 型酵母遗传毒性致癌物生物传感器， 其特征在于， 该构建方法包含下列步骤 ： 3a、 敲除五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中MAG1和。
9、RAD1基因， 获得复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株， 步骤如下 ： 权 利 要 求 书 CN 102965368 A 2 2/2 页 3 3a1、 将质粒 mag1: hisG -URA3-hisG 用限制性内切酶EcoR 和Bgal 进行酶切， 得到敲除组件mag1:hisG -URA3-hisG ； 3a2、 将敲除组件用醋酸锂转化方法转入五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵 母中， 发生同源重组， 通过 SD-Ura 选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株 ； 3a3、 将质粒rad1:Blast 用限制性内切酶 SalI 进行酶切， 得到敲除组件 rad1 。
10、:hisG -URA3-hisG， 将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中， 发生同源重组， 通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺 失突变株， 该突变株即为缺失yap1cwp1cwp2snq2pdr5rad1mag1七个基因 的面包酵母 ； 3b、 将权利要求2步骤 （4） 中的HUG1-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体上, 利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切进行连接， 得到克隆 pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1； 3c、 将克隆 pBluescipt- HUG1-yEGFP-CYC1用。
11、BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切， 得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的基因片段， 再克隆到 pM4366 载体中 , 用Not1内切 酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO； 3d、 将 HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO 片段用醋酸锂转化方法转入复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中， 通过 SD-Ura 选择性平板筛选得到超敏感 型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株。 权 利 要 求 书 CN 102965368 A 3 1/6 页 4 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件。
12、盒及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术， 尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的 监测。 背景技术 0002 面包酵母是一种简单真核生物， 单细胞， 遗传改造操作简单， 培养简便快速且环境 友好， 适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。 目前在环境污染检测技术领域中， 面 包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视， 一些以面包酵母为模式生物的检测系统 得到了发展。 0003 遗传毒性致癌物是指能与DNA反应， 引起DNA损伤而致癌的化学致癌物， 可用生物 化学试验或间接地应用遗传毒性试验方法来鉴定遗传毒性致癌物， 包括直接致癌物、 间接 致癌物及某些无机致癌物。 。
13、0004 现已发展了多个基于 DNA 损伤转录响应的遗传毒性致癌物的检测体系， 面对高通 量， 实时监测的现实要求， 我们仍需继续创新， 开发高灵敏， 高应用性的生物传感器。 构建一 个遗传毒性致癌物生物传感器， 除了宿主细胞外， 还需具备以下两个基本元件 ： 感应元件和 连接于此后的报告元件。前者利用其自身功能可对 DNA 损伤进行响应， 并开启后者的表达， 从而产生可检测出的信号。 本发明将这两个元件组合在一起的基因片段称为生物传感器元 件盒。 0005 HUG1(hydroxyurea and UV and gamma radiation induced) 可因细胞被羟基 脲 (hydr。
14、oxyurea) 处理后有显著性上调表达， 因而被视为当细胞受到 DNA 损伤及复制停 滞后可起到转录响应的潜在基因。经研究显示 HUG1 基因受到 MEC1 通路上的基因转录调 控。在面包酵母中， MEC1 是磷脂酰肌醇 3- 激酶家族成员之一， 是一个重要的检验点基因 (checkpoint gene)， 检验点基因可转录诱导大量调节子基因 (regulon gene) 来启动 DNA 修复， 致使细胞周期阻滞， 缓解 DNA 损伤。而研究人员发现存在于 MEC1 检验点信号通路中 的基因在遇到复制阻滞及 DNA 损伤均可转录响应诱导 HUG1 的表达。已有报道证明 HUG1 在 一般条件。
15、下的表达量很低， 但确实受 DNA 损伤信号的显著诱导， 且灵敏度高， 可用作制备生 物传感器的感应元件。 0006 绿色荧光蛋白 (GFP) 是从水母中分离出的天然生物发光蛋白 ； 其性质极其稳定 ； 无需添加任何底物及辅助因子， 即在紫外或蓝光的激发下发出绿色荧光。它在细菌、 真菌、 植 物和动物细胞中表达时都能发出荧光， 具有活体、 原位、 实时表达的特点。 而酵母增强型 绿色荧光蛋白 (yEGFP) 是一种密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白， 它可在酵母细胞中增 强表达。对比此前广泛使用的编码 B-gal 半乳糖苷酶的报告基因 lacZ， GFP 具有直接用于 活体细胞检测， 并可克服利。
16、用酶作为报告基因的一系列缺点 ( 破坏酵母细胞壁， 影响酶活 显色的因素复杂等 )， 检测手段多样、 自动化等一系列优点， 利用绿色荧光蛋白作为制备生 物传感器的效应元件， 使得环境中遗传毒性化合物测评体系更有利地向高通量， 快速， 便捷 的阶段发展。 说 明 书 CN 102965368 A 4 2/6 页 5 0007 利用 SOE 法 (Gene Splicing by Overlap Extension) 进行 PCR 基因片段拼接， 即 通过 PCR 过程中基因片段的交错延伸实现拼接。该方法是利用 PCR 技术在体外进行有效的 基因重组， 而且不需要内切酶消化和连接酶处理， 该技术使。
17、用简易。 由于引物只需要与模板 有效结合， 尤其是 5 端序列不必与模板完全配对， 因此扩增引物的 5 端可以添加两种酶切 位点以便于后期克隆。 0008 流式细胞技术是分析细胞中的一个重要领域， 该技术为细胞学研究手段之一， 能 够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个细胞个体的分析， 而且一个细胞多参 数分析并可分选细胞。这种以流动的方式 ( 相对静态方式 ) 测量细胞与传统的用荧光镜检 测细胞比较， 具有速度快， 精度高， 准确性好的特点。 发明内容 0009 本发明的目的是， 首先提供一种超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 及其构建方法， 。
18、并将生物传感器元件盒应用于复合 DNA 损伤超敏感型面 包酵母七基因缺失突变株中， 得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器， 该生物传感 器大大提高了对检测环境中遗传毒性化学物质的敏感性， 扩大了检测范围， 增强检测手段 的灵活性。 0010 为了达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0011 一、 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 基因片段 的构建方法为 ： 0012 1、 提取野生面包酵母基因组 DNA， 通过特异性引物， 以野生面包酵母基因组 DNA 为 模板， PCR 扩增得到 HUG1 启动子基因片段 ； 0013 2、 提取质粒 P。
19、UG36， 通过特异性引物， 以 PUG36 质粒 DNA 为扩增模板， PCR 扩增分别 得到 yEGFP 编码区基因片段 ； 0014 3、 提取质粒 PUG36， 通过特异性引物， 以 PUG36 质粒 DNA 为扩增模板， PCR 扩增分别 得到终止子 CYC1 基因片段 ； 0015 4、 利用SOE法， 通过特异性引物， 以HUG1启动子基因片段、 yEGFP编码区基因片段、 终止子 CYC1 基因片段按照摩尔比 1 1 1 的比例为扩增模板， PCR 扩增得到超敏感型酵 母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 基因片段 ； 0016 二、 超敏感型酵母遗。
20、传毒性致癌物生物传感器元件盒转入复合 DNA 损伤超敏感型 面包酵母七基因缺失突变株基因组中， 应用于遗传毒性致癌物的检测 ： 0017 1、 将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1转入到复 合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中， 形成超敏感型面包酵母遗传毒 性致癌物生物传感器 yap1cwp1cwp2snq2 pdr5radmag1-HUG1-yEGFP-CYC1 ； 其中复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株是在对氧化损伤高敏感性的五基 因缺失面包酵母突变株 ( 专利申请号 ： 2010105941713) 的基础上， 敲。
21、除与 DNA 损伤修复有 关的 MAG1 和 RAD1 基因， 获得缺失 yap1 cwp1 cwp2 snq2 pdr5 rad1 mag1 七基因的面包酵 母突变株。 0018 2、 超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器可利用流式细胞仪技术， 通过测 定绿色荧光蛋白表达的变化情况从而对遗传毒性致癌物进行检测。 说 明 书 CN 102965368 A 5 3/6 页 6 0019 本发明的优点与效果 ： 0020 超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 关键性 优点在于， 它对遗传毒性致癌物有较高的灵敏性， 检测操作简便， 人为误差减小， 也可用。
22、于 直接检测， 具有实现大批量乃至高通量的遗传毒性化合物实时监测的应用潜力。 0021 与宿主为野生型面包酵母相比， 本发明中宿主为复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母 七基因突变株的超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器， 对各类型遗传毒性致癌物 的敏感度均有提高， 对于甲磺酸甲酯 (MMS) 在极低浓度下 (25ppm) 的检测灵敏度提高 50 多 倍 ； 对过氧化氢 (H2O2) 在 0.6mM 浓度的检测灵敏度提高 10 多倍 ； 对大分子致 DNA 损伤化 合物腐草霉素 (Phleomycin) 在 2.5g/ml 浓度的检测灵敏度提高 40 倍 ； 宿主为野生型面 包酵母的遗传毒性。
23、致癌物生物传感器， 不能检测到叔丁基过氧化氢 (t-BHP) 及 DNA 损伤剂 4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)甲基紫精(methyl viologen)引起的DNA损伤信号， 而超敏 感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器均可检测到这两种致 DNA 氧化损伤化合物， 并且 有较高的检测灵敏度。 因此超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器的应用可提高其 检测灵敏度并扩大其检测范围， 更能促进环境遗传毒性致癌物的实时监测平台的建立。 0022 表 1、 超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器与四种现有的面包酵母遗传 毒性 致癌物生物传感器灵敏度的比较分析， 0023 野生型面包 酵母 R。
24、NR3-lacZ 生物传感器 野生型面包 酵母 RNR2-yEGF P 生物传感器 野生型面包 酵母 Rad54-yEG FP 生物传感器 野生型面包酵母 HUG1-yEGFP-C YC1 生物传感器 复合 DNA 损伤超 高灵敏型面包酵母 HUG1-yEFP-CY C1 生物传感器 甲磺基甲酯 25ppm) 9.3 倍 4 倍 4 倍 5 倍 56 倍 过氧化氢 (0.6mM) 约 2 倍 无检测 无检测 2 倍 12 倍 叔丁基过氧化氢 (0.125mM) 无诱导信号 无检测 无检测 无诱导信号 4.5 倍 4- 硝基喹啉 1- 氧 化物 (0.005ug/ml) 无诱导信号 无检测 无检。
25、测 无诱导信号 22 倍 腐草霉素 (2.5ug/ml) 无诱导信号 2 倍 无检测 20 倍 40 倍 0024 表中所示数值为诱导表达倍数， 表示检测得到的信号强度， 与空白对照的检测信 号强度之间相除后的检测结果 ； 无检测表示没有进行检测。 附图说明 0025 图 1、 遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 应用于不同面包酵母 株中对 DNA 烷化剂甲磺酸甲酯 (MMS) 检测灵敏度的比较。 0026 图中横坐标表示 DNA 烷化剂甲磺酸甲酯 (MMS) 的浓度 ； 纵坐标表示生物传感器 对 DNA 烷化剂甲磺酸甲酯 (MMS) 检测所得到的相对荧光强度诱导倍。
26、数 ； - - 曲线表示 遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 应用于野生型面包酵母中对 DNA 烷 化剂甲磺酸甲酯 (MMS) 的检测结果 ； -s- 曲线表示于遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 应用于复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因突变株中对 DNA 烷化剂甲 说 明 书 CN 102965368 A 6 4/6 页 7 磺酸甲酯 (MMS) 的检测结果。 具体实施方式 0027 一、 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒的构建方法包含下列步骤 ： 0028 (1)、 从野生面包酵母中提取基因组 DNA ： 0029 1。
27、a、 取野生面包酵母， 接种于 YPD 培养液中， 在 30， 200 转 / 分钟的条件下， 振荡 培养 16 小时， 得到野生面包酵母菌液 ； 0030 其中 ： YPD 培养液的配方重量百分比为 ： 酵母膏 1， 蛋白胨 2， 葡萄糖 2， 余者 为水 ； 0031 1b、 取野生面包酵母菌液 1.5 毫升， 用 4000 转 / 分钟离心 2 分钟， 沉淀物悬于 200 微升提取缓冲液中 ； 0032 其中 ： 提取缓冲液的配方为 ： 曲拉通 X-100 2， 十二烷基磺酸钠 1， 氯化钠 0.1 摩尔， 乙二胺四乙酸 1 毫摩尔， 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 10 毫摩尔， 余者为水， 。
28、pH 8.0 ； 0033 1c、 加入 0.3 克酸洗玻璃珠、 100 微升酚、 100 微升氯仿， 震荡 3 分钟后， 以 12000 转 / 分钟离心 10 分钟， 吸取上层液体 ； 0034 1d、 加入所取液体体积 2 倍的无水乙醇， 在 -20静置 30 分钟， 以 12000 转 / 分钟 离心 15 分钟， 去上清， 取沉淀物 ； 0035 1e、 将沉淀物溶解于 20 微升无菌水， 即为野生酵母基因组 DNA ； 0036 (2)、 扩增 HUG1 启动子基因片段 0037 野生面包酵母基因组作为扩增模板， 通过上游引物 HUG1 Pro-1 ： 5 AA CTG CAG G。
29、CA AAA ACT AGA GCC AAG CC 3 和下游引物 HUG1 Pro-2 ： 5 TTA GAC ATA TAG TTT TTT TTT ATT GCT G 3 ， 利用 PCR 技术， 扩增得到 HUG1 启动子基因片段 (600bp) 0038 (3)、 扩增 yEGFP 编码区基因片段以及终止子 CYC1 基因片段 0039 质粒 PUG36( 美国 ATCC 公司提供 ) 作为扩增模板， 通过上游引物 yEGFP-1 ： 5 AAA ACT ATA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3 和下游引物 yEGFP-2 ： 5 TAC ATG ACT TTG。
30、 TAC AAT TCA TCC ATA C 3 ， 利用 PCR 技术， 扩增得到 yEGFP 编码区基因片段 (750bp) ； 质粒 PUG36 作为扩增模板， 通过上游引物 CYC1-1 ： 5 TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C 3 和下游引物 CYC1-2 ： 5 TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3 ， 扩增得到终 止子 CYC1 基因片段 (260bp) ； 0040 (4)、 扩增超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 基 因片段将上述扩增得到的HUG1。
31、启动子基因片段、 yEGFP编码区基因片段和终止子CYC1基因 片段按摩尔比 1 1 1 的比例作为扩增模板， 通过上游引物 HUG1 Pro-1 ： 5 AA CTG CAG GCA AAA ACT AGA GCC AAG CC 3 和下游引物 CYC1 Pro-2 ： 5 TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3 ， 扩增得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒， 即基于酵 母 DNA 损伤响应的 HUG1-yEGFP-CYC1 基因片段 ； 0041 其中 ： PCR 的条件为 ： 94 5 分钟 ； 94 45 秒， 55 45 秒， 。
32、72 1 分钟， 30 个循 环 ； 72 5 分钟。 0042 二、 将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒应用于构建超敏感型酵母 遗传毒性致癌物生物传感器， 该方法包含下列步骤 ： 说 明 书 CN 102965368 A 7 5/6 页 8 0043 (1)、 在五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母 ( 专利申请号为 2010105941713) 的基础上， 再敲除与 DNA 损伤修复有关的 MAG1 和 RAD1 基因， 获得复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株， 步骤如下 ： 0044 1a、将 质 粒 mag1:hisG-URA3-hisG( 参 考 文 献。
33、 ： Jin Chen， et al.(1990) Saccharomyces cerevisiae 3-methyladenine DNA glycosylase has homology to the AlkA glycosylase of E.coli and is induced in response to DNA alkylation damage. The EMBO Journal， vol.9， pp.4569-4575) 用限制性内切酶 EcoR I 和 Bgal II 进行酶切， 得到敲除组件 mag1:hisG-URA3-hisG ； 0045 1b、 将敲除组件用醋酸锂。
34、转化方法转入对氧化损伤高敏感性的面包酵母中， 发生 同源重组， 通过 SD-Ura 选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株 ； 0046 1c、 将质粒 rad1:Blast( 来源于 Dr.E.Perkins NIESH， NC， USA) 用限制性内切 酶 SalI 进行酶切， 得到敲除组件 rad1:hisG-URA3-hisG， 将敲除组件用醋酸锂转化方法 转入六基因缺失的面包酵母突变株中， 发生同源重组， 通过 SD-Ura 选择性平板筛选得到复 合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株， 该突变株即为缺失 yap1cwp1cwp2 snq2pdr5rad1mag1 七。
35、个基因的面包酵母 ； 0047 (2) 将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒 HUG1-yEGFP-CYC1 基因片 段克隆到 pBluescipt 载体 ( 美国 Thermo 公司提供 ) 上， 利用 PstI 内切酶和 EcoR1 内切酶 酶切进行连接， 得到克隆 pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1 ； 0048 (3)、 将克隆 pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1 用 BamH1 内切酶和 EcoR1 内切酶进行 酶切， 得到两端酶切位点为 BamH1 和 EcoR1 的酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统传感元 件UG1-yEGFP-CYC1片。
36、段， 再克隆到pM4366载体(参考文献 ： W.P.Voth， et al.(2001)Yeast vectors for integration at the HO locus.Nucleic Acids Res.Vol.29， E59-9) 中， 用 Not1 内切酶切下片段 HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO， ； 0049 (4)、 将 HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO 片段转入复合 DNA 损伤超敏感 型面包酵母七基因缺失突变株中， 筛选得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器， 上 述转入与筛选方法包含。
37、下列步骤 ： 0050 4a、 将复合 DNA 损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株接种到 1 毫升 YPD 培养 液， 30， 200 转 / 分钟振荡条件下， 培养 16 小时 ； 0051 4b、 再加入 YPD 培养液 2 毫升， 30， 200 转 / 分钟， 培养 4 小时 ； 0052 4c、 取 1 毫升 4b 中的酵母， 以 2500 转 / 分钟离心 2 分钟， 取沉淀物 ； 0053 4d、 将沉淀物悬于 100 毫摩 / 升的 400 微升醋酸锂中， 以 2500 转 / 分钟离心 2 分 钟， 取沉淀物 ； 0054 4e、 将沉淀物悬于 100 毫摩 / 升的 10。
38、0 微升醋酸锂中 ； 0055 4f、 将 2.0 毫克 / 毫升的鲑鱼精单链 DNA 1 微升煮沸 5 分钟， 冰浴后与片段 HO-hi sG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO 0.1 1 微克一起加入到步骤 4e 的醋酸锂中， 室温放 置 5 分钟 ； 0056 4g、 再加入 280 微升浓度为 50的聚乙二醇 4000 ； 0057 4h、 振荡至混匀， 30静置 45 分钟 ； 0058 4i、 加入 39 微升二甲基亚砜， 42热激 5 分钟 ； 说 明 书 CN 102965368 A 8 6/6 页 9 0059 4j、 4000 转 / 分钟离心 2 。
39、分钟， 取沉淀物， 并将沉淀物悬于 200 微升无菌水中 ； 0060 4k、 4000 转 / 分钟离心 2 分钟， 取沉淀物， 悬于 100 微升无菌水中， 然后再涂于 SD-Ura 营养缺陷型培养基平板， 30培养箱中培养 3 天， 生长出单菌落， 该单菌落即超敏感 型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株 ； 0061 其中 SD-Ura 选择性平板的配方为 ： 酵母氮源无氨基酸无硫酸铵 0.17， 硫酸铵 0.5， 葡萄糖 2， 腺嘌呤 0.2， 色氨酸 1， 组氨酸 1， 亮氨酸 1， 赖氨酸 1， 琼脂粉 2， 余者为水 ； 0062 三、 超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器用于检。
40、测遗传毒性致癌物的方法， 该方法包含下列步骤 ： 0063 1、 将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株接种于 YPD 培养液中， 30， 200 转 / 分钟下振荡培养 16 小时 ； 0064 2、 将过夜培养的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液用新鲜的 YPD 选择性培养液稀释到细胞密度 OD600为 0.1 ； 0065 3、 取 1 毫升稀释后的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液， 加入 DNA 损伤烷化剂甲基磺酸甲酯， 培养 8 小时 ； 0066 4、 取 200 微升超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液， 4000 转 / 分 钟离心 2。
41、 分钟， 弃上清， 取沉淀物 ； 加入 200 微升 0.1M PBS 溶液， 悬浮沉淀物 ； 再次 4000 转 / 分钟离心 2 分钟， 弃上清， 取沉淀物 ； 加入 500 微升 0.1M PBS 溶液， 悬浮沉淀物 ； 0067 其中0.1M PBS溶液配方为 ： 称取8克氯化钠， 0.2克氯化钾， 3.68克十二合磷酸一 氢钠， 0.24 克磷酸二氢钾， 溶于双蒸水中， 用氢氧化钠调节 pH 值为 7.4， 定容至 1 升 ； 0068 5、 加入 1 毫克每毫升的溴化丙啶 (PI) 溶液 3 微升， 混匀， 置于冰上， 黑暗保存直至 使用流式细胞仪进行检测 ； 0069 6、 用流。
42、式细胞仪对样品进行检测， 同时设定 FITC 及 PE 两激光通道 ； 0070 7、 用Flow Jo流式数据分析软件输出分析数据， 数据中的Mean值即检测样品的平 均荧光强度数值 ； 0071 8、 按照步骤1至步骤7的方法测定未经甲基磺酸甲酯处理的超敏感型酵母遗传毒 性致癌物生物传感器酵母株平均荧光强度数值， 作为空白对照 ； 0072 9、 当经甲基磺酸甲酯处理的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株溶 液平均荧光强度数值与空白对照的平均荧光强度数值之比大于 2 时表明检出 DNA 损伤信 号。 说 明 书 CN 102965368 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102965368 A 10 。