郁金香查尔酮合成酶TFCHS蛋白及其编码基因和探针.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102965352 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965352 A *CN102965352A* (21)申请号 201210429585.X (22)申请日 2012.10.31 C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 袁媛 史益敏 唐东芹 马晓红 (74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 31236 代理人 郭国中。

2、 牛山 (54) 发明名称 郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 蛋白及其编码基 因和探针 (57) 摘要 本发明涉及一种郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 蛋白及其编码基因和探针， 所述蛋白质为如下 （a） 或 （b） 的蛋白质 ：（a） 由如 SEQ ID NO.4 所示 的氨基酸序列组成的蛋白质 ；（b） SEQ ID NO.4 所 示的氨基酸序列经过取代、 缺失或者添加一个或 几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由 （a） 衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上 述蛋白质的核酸序列， 以及检测上述核酸序列的 探针 ； 本发明为今后利用基因工程技术调控郁金 香 TfCHS 基因的时空表达特性，。

3、 从而改变花色、 创 新花色提供了理论依据， 具有很大的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种如下 （a） 或 （b） 的蛋白质 ： （a） 由如 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； （b） SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列经过取代、 缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有 郁金香查尔酮合成酶活性的由 （a） 衍生的蛋白质。 2. 如权利要求 1 所述的蛋。

4、白质， 其特征是， 所述蛋白质为 SEQ ID NO.4 所示氨基酸序 列经过 1 50 个氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 或者在 C 末端和 / 或 N 末端添加 1 20 个以内氨基酸而得到的序列。 3.如权利要求2所述的蛋白质， 其特征是， 所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列 中 1 10 个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。 4. 一种编码权利要求 1 所述蛋白质的核酸序列。 5. 如权利要求 4 所述的核酸序列， 其特征是， 所述核酸序列具体为 ： （a） 碱基序列如 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示 ； 或 （b） 与 SEQ I。

5、D NO.3 第 1 1179 位所示的核酸有至少 70% 的同源性的序列 ； 或 （c） 能与 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示的核酸进行杂交的序列。 6.如权利要求4所述的核酸序列， 其特征是， 所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1 1179 位所示的核酸序列中 1 90 个核苷酸的缺失、 插入和 / 或取代， 或者在 5和 / 或 3 端添加 60 个以内核苷酸形成的序列。 7. 一种用于检测如权利要求 4 所述核酸序列的探针， 其特征在于， 所述探针为包含有 所述核酸序列 8 100 个连续核苷酸的核酸分子。 权 利 要 求 书 CN 102965352 A 2。

6、 1/8 页 3 郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 蛋白及其编码基因和探针 技术领域 0001 本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因和探针， 具体涉及一 种郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 蛋白及其编码基因和探针。 背景技术 0002 花的颜色是决定花商品价值和观赏价值的重要因素之一。 改变花色， 创新花色， 可 以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵的颜色是花瓣细胞中花色素积累的结果， 花色素 主要包括类黄酮、 类胡萝卜素以及甜菜碱类。 类黄酮作为花色素的一大类， 使花朵产生从黄 到紫的颜色。类黄酮的生物合成途径为可分为三个阶段， 第一阶段是由苯丙氨酸到香豆酰 CoA， 这是许多次。

7、生代谢共有的 ； 第二阶段由香豆酰 CoA 到二氢黄酮醇， 这是类黄酮代谢的 关键反应， 它合成花青素和其它黄酮物质。所有类黄酮合成的前体物都是 4- 香豆酰 CoA 和 丙二酰 CoA 在查尔酮合成酶 （Chalcone synthase CHS） 的作用下产生查尔酮开始的。第三 阶段是各种花色素苷的合成。 0003 由于 CHS 是合成黄烷酮、 黄酮、 黄酮醇及花色苷所必需的酶， 因此被认为是类黄酮 生物合成途径的一个关键酶， 为多基因家族编码。不同 CHS 基因功能上存在明显差异， 在不 同品系中的时空表达特点也不同。利用基因工程技术对 CHS 基因的表达进行调控是改变花 朵颜色的途径之。

8、一。如小分子 RNA 干扰沉默 CHS 基因的表达可使花色素合成被打断， 从而 使花色变淡， 甚至变成白色 ； 将CHS的cDNA反向连接于35S启动子上， 再连接双元载体转化 矮牵牛会使花色同紫红色变为粉红色并来有白色， 有些花朵完全呈白色 ； 将菊花 CHS 基因 正义导入菊花栽培品种之后产生了白色花和图案各异的彩瓣花 ； 从三色龙胆中克隆得到的 CHS 基因启动子可在矮牵牛的花瓣唇部特异性表达 ； 将 CHS 反义基因转入蓝猪耳中得到了 具有彩色波浪边缘的花朵等等。 0004 目前， 在很多植物中发现了 CHS 多基因家族， 如矮牵牛、 葡萄、 甘薯、 拟南芥、 角堇 等。但对于球根花卉。

9、郁金香 （Tulipa fosteriana） ， CHS 基因的克隆、 表达模式及 CHS 蛋白 编码序列目前尚不清楚。目前， 未有任何与郁金香 CHS 蛋白及其编码基因相关的文献报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于填补郁金香 CHS 基因家族成员的克隆、 表达模式分析以及郁金 香 CHS 蛋白及其编码基因的空白， 提供了一种郁金香 CHS 蛋白 TfCHS， 本发明还提供了一种 编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针。本发明提供了郁金香 TfCHS 蛋 白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、 不同发育阶段的表达模式， 为今后利用基因工程技 术对 TfCHS 基因的时空表达特。

10、性进行调控， 从而改变花色、 创新花色提供了理论依据， 具有 很大的应用价值。 0006 本发明是通过以下技术方案实现的， 0007 一方面， 本发明提供了一种具有郁金香查尔酮合成酶活性的蛋白质， 所述蛋白质 是由如 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 或由 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序 说 明 书 CN 102965352 A 3 2/8 页 4 列经过取代、 缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由 （a） 衍 生的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、 不同器官内的有无及活性大小存在较大差 异。 0008 优选的， 所述蛋白质为SEQ 。

11、ID NO.4所示氨基酸序列经过150个氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 或者在 C 末端和 / 或 N 末端添加 1 20 个以内氨基酸而得到的序列。 0009 进一步优选的， 所述蛋白质为 SEQ ID NO.4 所示氨基酸序列中 1 10 个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。 0010 另一方面， 本发明还提供一种编码上述蛋白质的核酸序列。 0011 优选的， 所述核酸序列具体为 ： 0012 （a） 碱基序列如 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示 ； 0013 或 （b） 与 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示的核酸有至少 70% 的同。

12、源性的序列 ； 0014 或 （c） 能与 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示的核酸进行杂交的序列。 0015 优选的， 所述核酸序列具体为 SEQ ID NO.3 第 1 1179 位所示的核酸序列中 1 90个核苷酸的缺失、 插入和/或取代， 以及在5和/或3端添加60个以内核苷酸形成的 序列。 0016 此外， 本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针， 所述探针为具有上述核酸 序列 8 100 个连续核苷酸的核酸分子， 该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香 TfCHS 相关的核酸分子。 0017 在本发明中，“分离的” 、“纯化的” DNA 是指， 该 DNA 或片段。

13、已从天然状态下位于其 两侧的序列中分离出来， 还指该 DNA 或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且 已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。 0018 在本发明中， 术语 “TfCHS 蛋白编码序列” 指编码具有郁金香 TfCHS 蛋白活性的多 肽的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.3 所示序列中第 1 1179 位核苷酸序列及其简并序列。该 简并序列是指 ： 位于 SEQ ID NO.3 所示序列的第 1 1179 位核苷酸中， 有一个或多个密码 子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性， 所以与 SEQ ID NO.3所示序列中第11179位核苷酸序。

14、列同源性低至约70%的简并序列也能编码 出 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列。该术语还包括与 SEQ ID NO.3 所示序列中从核苷酸第 1 1179 位的核苷酸序列的同源性至少 70% 的核苷酸序列。 0019 该术语还包括能编码具有与天然的郁金香 TfCHS 相同功能的蛋白的 SEQ ID NO.3 所示序列的变异形式。这些变异形式包括 （但并不限于） ： 通常为 1 90 个核苷酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 5和 / 或 3端添加为 60 个以内核苷酸。 0020 在本发明中， 术语 “TfCHS 蛋白” 指具有郁金香 TfCHS 蛋白活性的 SEQ ID NO.4。

15、 所 示序列的多肽。 该术语还包括具有与天然郁金香TfCHS相关相同功能的、 SEQ ID NO.4所示 序列的变异形式。这些变异形式包括 （但并不限于） ： 通常为 1 50 个氨基酸的缺失、 插入 和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或为 20 个以内氨基酸。例如， 在本领域 中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末 端和 / 或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金 香 TfCHS 蛋白的活性片段和活性衍生物。 0021 本发明的郁金香 TfCHS 蛋白的变异形式包括 ： 同源。

16、序列、 保守性变异体、 等位变异 说 明 书 CN 102965352 A 4 3/8 页 5 体、 天然突变体、 诱导突变体、 在高或低的严谨条件下能与郁金香TfCHS相关DNA杂交的DNA 所编码的蛋白、 以及利用郁金香 TfCHS 蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。 0022 在本发明中，“郁金香 TfCHS 保守性变异多肽” 指与 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序 列相比， 有至多 10 个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变 异多肽最好根据表 1 进行替换而产生。 0023 表 1 0024 最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val;Leu。

17、;Ile Val Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro;Ala Ala His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg Met(M) Leu;Phe;Ile Leu Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr 。

18、Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr;Phe Tyr Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe 说 明 书 CN 102965352 A 5 4/8 页 6 Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu 0025 0026 本发明还包括郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 蛋白或多肽的类似物。这些类似物与 TfCHS 相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的 差异， 或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种 技术得到， 如通过。

19、辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱变法或其他已知 分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然 L- 氨基酸的残基 （如 D- 氨基酸） 的类似 物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 （如 、 - 氨基酸） 的类似物。应理解， 本发明 的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。 0027 修饰 （通常不改变一级结构） 形式包括 ： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰 化或羧基化。修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行 糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶 （如哺乳动物 的糖基化酶或去糖基化酶） 而完成。修饰形式还包括。

20、具有磷酸化氨基酸残基 （如磷酸酪氨 酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸） 的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化 了溶解性能的多肽。 0028 在本发明中， 可用实时荧光定量 PCR 的方法分析郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 基因 产物的表达模式， 即分析 TfCHS 基因的 mRNA 转录物在细胞中的存在与否和数量。 0029 本发明检测样品中是否存在郁金香 TfCHS 相关核苷酸序列的检测方法， 包括用上 述的探针与样品进行杂交， 然后检测探针是否发生了结合。该样品是 PCR 扩增后的产物， 其 中 PCR 扩增引物对应于郁金香 TfCHS 相关核苷酸编码序列， 并可位于该编码序。

21、列的两侧或 中间。引物长度一般为 15 50 个核苷酸。 0030 此外， 根据本发明的郁金香 TfCHS 核苷酸序列和氨基酸序列， 可以在核酸同源性 或表达蛋白质的同源性基础上， 筛选郁金香 TfCHS 相关同源基因或同源蛋白。 0031 为了得到与郁金香 TfCHS 相关基因的点阵， 可以用 DNA 探针筛选郁金香 cDNA 文 库， 这些探针是在低严谨条件下， 用 32P 对郁金香 TfCHS 相关的全部或部分做放射活性标记 而得的。适合于筛选的 cDNA 文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织 的 cDNA 文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外， 许多这样的 cDN。

22、A 文库也可以购 买到， 例如购自 Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香 TfCHS 相关的基因家族的核苷酸序列。 0032 本发明的郁金香 TfCHS 相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重 组法或人工合成的方法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤 其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA 库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列。当序列较长时， 常常需要进行两次或多 次 PCR 扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次。

23、序拼接在一起。 0033 当获得有关序列后， 可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入 载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 0034 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明的蛋白序列中。 0035 除了用重组法产生之外， 本发明蛋白的片段还可用固相技术， 通过直接 说 明 书 CN 102965352 A 6 5/8 页 7 合 成 肽 而 加 以 生 产 （Stewart 等 人，（1969）固 相 多 肽 合 成， WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J. （1963） J.Am Chem.。

24、Soc 85:2149-2154） 。 在体外合成蛋白质可以 用手工或自动进行。例如， 可以用 Applied Biosystems 的 431A 型肽合成仪 （Foster City， CA） 来自动合成肽。 可以分别化学合成本发明蛋白的各片段， 然后用化学方法加以连接以产 生全长的分子。 0036 利用本发明的郁金香 TfCHS 蛋白， 通过各种常规筛选方法， 可筛选出与郁金香 TfCHS 蛋白相关发生相互作用的物质， 或者受体、 抑制剂或拮抗剂等。 0037 郁金香为世界十大切花之一， 观赏价值极高， 应用广泛， 新花色品种的市场需求也 越来越大。 本发明首次克隆郁金香植物体内类黄酮生物。

25、合成途径第一个关键酶查尔酮合成 酶 TfCHS 蛋白的编码序列， 并采用荧光实时定量 PCR 的方法分析 TfCHS 基因的表达模式， 为 今后利用基因工程技术对 TfCHS 基因的时空表达特性进行调控， 从而改变花色、 创造新花 色品种提供了理论依据， 具有很大的参考价值。 附图说明 0038 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述， 本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显 ： 0039 图 1 为本发明的 TfCHS 基因与百合查尔酮合成酶基因 mRNA 的核苷酸序列的同源 比较 （GAP） 结果 ； 0040 图 2 为本发明的 TfCHS 基因与百合查尔酮合成酶基因 。

26、mRNA 的核苷酸序列的同源 比较 （GAP） 结果 ； 0041 图 3 为本发明的 TfCHS 蛋白与百合查尔酮合成酶的氨基酸序列的同源比较 （FASTA） 结果， 其中， 相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。 具体实施方式 0042 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等分子克隆 ： 实验室手册 （New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条。

27、件。 0043 实施例 1、 郁金香 TfCHS 基因的克隆 0044 1. 植物材料的获得 0045 将健康、 大小一致的郁金香球茎 （Tulipa fosteriana Shangnongzaoxia ， 已通过 上海市农作物品种审定委员会审定。编号 ： 沪农品认花卉 2011 第 004 号） 按常规种植并进 行田间管理， 待花朵完全开放， 花瓣完全着色时采集花瓣组织， 用于提取 RNA ； 0046 2.RNA 的抽提 0047 用 “RNA prep pure 植物总 RNA 提取试剂盒” 抽提总 RNA（RNA prep pure Plant Kit ： 天根生化科技 （北京） 有。

28、限公司） 。用甲醛变性胶电泳鉴定 RNA 的完整性， 然后在分光光 度计 （Thermo Scientific NANODROP 1000Spectrophotometer） 上测定 RNA 的纯度及浓度 ； 0048 3. 基因的全长克隆 0049 根据 CHS 基因的氨基酸保守序列， 利用同源性基因克隆原理， 采用 RACE 方法 说 明 书 CN 102965352 A 7 6/8 页 8 （3 -Full RACE Core Set Ver.2.0 ： 宝生物工程 （大连） 有限公司， SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit ： Clontech L。

29、aboratories,Inc.） 进行 cDNA 全长克隆， 分三个阶段进 行 ： 0050 （1） RT-PCR 获得基因中间片段 0051 将提取的 RNA 进行反转录 （Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit ： 宝生物工程 （大连） 有限公司） ， 以第一链 cDNA 为模板， 利用引物 F1（SEQ ID NO.1） 和 R1 （SEQ ID NO.2） 进行PCR， 扩增得到约840bp片段， 回收并连接到pMD18-T Simple vector载 体上， 用RV-M和M13-47作为通用引物， 采用终止物荧光标记(Big-Dye,。

30、Perkin-Elmer,USA) 的方法， 在 ABI 377 测序仪 （Perkin-Elmer,USA） 上进行测序。测序结果通过在 NCBI 网站 进行 BLAST（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 比对已有的数据库 （GenBank） ， 知其核酸 序列及编码蛋白与已知的百合属查尔酮合成酶基因的同源性很高， 故初步认为它是一个查 尔酮合成酶基因 ； 0052 （2） 3 RACE 0053 二轮巢式 PCR 完成 3末端序列的扩增 ； 0054 第一轮 ： Outerprimer+CHS3-1(5 -TGTCGTCTGCTCTGAAATCACTGCC-3 。

31、) 0055 第二轮 ： Innerprimer+CHS3-2(5 -AGCCAGACCATCCTCCCAGATTCGG-3 ) 0056 Outerprimer 和 Innerprimer 为试剂盒提供。3 RACE 得到 TfCHS 的 3末端 序列 （约 590bp） ， 回收， 连接到 pMD18-T Simple vector 载体上， 用 RV-M 和 M13-47 作为通 用引物， 采用终止物荧光标记 （Big-Dye,Perkin-Elmer,USA）的方法， 在 ABI 377 测序仪 （Perkin-Elmer,USA） 上进行测序。测序结果通过在 NCBI 网站进行 BL。

32、AST（http:/blast. ncbi.nlm.nih.gov/） 比对已有的数据库 （GenBank） ， 知其核酸序列及编码蛋白与已知的百 合属查尔酮合成酶基因的同源性高 ； 0057 （3） 5 RACE 0058 5端的序列通过使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit获得， 以5RACE ready cDNA 为模板， 通过引物 UPM （试剂盒提供） 与 CHS 5-1 （5 -ATGAAGCGGTTGACGGAGGGG CGGA-3） 扩增获得 TfCHS 的 5末端序列 （约 510bp） ， 回收连接后用同上面一样的方法进 行测序 ； 。

33、0059 将通过上述 3 种方法获得的序列的测序结果进行拼接， 将拼接序列提交 BLAST 分 析， 结果证明从郁金香中新得到的 TfCHS 基因确为一个与查尔酮合成酶相关的基因 ； 将测 序结果结合 NCBI 的 ORF Finding（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）预测， 发现了 TfCHS 基因的起始密码子与终止密码子 ； 根据获得的序列， 分别从起始密码子和终止密码 子处设计特异性引物 ORF-F （5 ATGGCGAATGTCGATGAGATCCGGC-3） 和 ORF-R （5 -TCAGTT GGAGGTGATTGGAAGGCTG-3） ， 以郁。

34、金香cDNA为模板进行PCR， 扩增得到1179bp郁金香TfCHS 蛋白的全长编码基因序列 （如 SEQ ID NO.3 所示） 。 0060 实施例 2、 郁金香 TfCHS 基因的序列信息与同源性分析 0061 本发明新的郁金香 TfCHS 全长 CDS 开放阅读框序列为 1179bp， 详细序列见 SEQ ID NO.3所示的序列， 根据CDS开放阅读框序列推导出郁金香TfCHS的氨基酸序列， 共392个氨 基酸残基， 分子量为 42861.3 道尔顿， 等电点 （pI） 为 5.90， 详细序列见 SEQ ID NO.4 所示序 列 ； 说 明 书 CN 102965352 A 8 。

35、7/8 页 9 0062 将郁金香 TfCHS 的 CDS 开放阅读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用 BLAST 程序 在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索， 结果发现它与 百合CHS基因 （GenBank登陆号HQ161731.1） 在核苷酸水平上具有86%的相同性， 如图1和图 2 所示 （Query ： 郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 的编码序列， Sbjct ： 百合查尔酮合成酶。

36、的 mRNA 序列） ； 在氨基酸水平上， 它与百合 CHS 基因 （GenBank 登陆号 ACX31605.1） 也有 94% 的一致 性和 99% 的相似性， 如图 3 所示 （Query ： 郁金香查尔酮合成酶 TfCHS 的编码序列， Sbjct ： 百 合查尔酮合成酶的氨基酸序列） 。由此可见， 郁金香 TfCHS 基因与百合 CHS 基因无论从核酸 还是蛋白水平上都存在较高的同源性。 0063 实施例 3、 郁金香 TfCHS 基因在花朵不同发育阶段及在郁金香不同组织中的表达 差异 0064 1.材料的获得 ： 在郁金香花朵的4个不同发育阶段 （花蕾， 花瓣未着色 ； 花蕾， 花。

37、瓣 开始着色 ； 花朵部分开放， 花瓣未完全着色 ； 花朵完全开放， 花瓣完全着色） ， 于田间采取其 花瓣， 同时采取其叶片、 地上茎、 花部器官雄蕊、 雌蕊、 花瓣 （各着色阶段花瓣的混合样） ， 将 样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中， 接着转入 -80超低温冰箱中贮存待用 ； 0065 2.RNA的提取 ： 利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒 （RNA prep pure Plant Kit ： 天根生化科技 （北京） 有限公司） 提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中 的 RNA ； 0066 3.RNA 的完整性、 纯度、 浓度的确定 ： 用普通琼脂糖凝。

38、胶电泳 （胶浓度 1.2% ； 0.5TBE 电泳缓冲液 ； 150v， 15min） 检测完整性， 电泳条带中最大 rRNA 亮度应为第二条 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍， 否则表示 rRNA 样品的降解， 纯度较好的 RNA， A260/A280以及 A260/A230 约为 2.0 左右 ； 用分光光度计测定 OD 值并计算 RNA 含量 ； 0067 4.cDNA 的 获 得 ： 以 500ng 的 总 RNA 为 模 板，按 照 宝 生 物 公 司 TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time 试剂盒操作说明进行反转。

39、录获得 cDNA 备用 ； 0068 5. 设计特异性引物以进行实时荧光定量 PCR 分析基因在各器官与组织中的表 达量 ： 根据已经获得的郁金香 TfCHS 基因序列， 利用引物设计软件设计用于 Real-time PCR 中 TfCHS 基因定量分析的特异性引物， CS-F（5 AGCCAGACCATCCTCCCA-3） ， CS-R （5 -GCCAGCTTCAACTCCACC-3） ； 内参基因为 Actin（GenBank 登陆号 AB456684） ， 引物为 Actin-F （5 -AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3） ， Actin-R （5 -TCATAAGAG。

40、AGTCGGTCAAATCC- 3） ； 0069 6. 制作目的基因及内参基因的标准曲线 ： 用 EASY Dilution（试剂盒提供） 将标准 品cDNA溶液进行梯度稀释， 然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板， 以目的基因及内参基因 的特异性引物进行Real-time PCR扩增， 反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线， 分析溶解曲 线， 判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰， 以判断使用该引物能否得到单 一的 PCR 扩增产物， 通过标准曲线确定模板 cDNA 的合适稀释倍数 ； 0070 7. 待测样品中目的基因的实时荧光定量分析 ： 以合成的 cDNA 第一条链为模板， 分。

41、 别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析， Real-time PCR 反应在 BIO-RAD Chromo 4 实时定量仪上进行， 反应体系为 20L， 反应采用三步法， 94变性 20s， 说 明 书 CN 102965352 A 9 8/8 页 10 接着41个循环 ： 9415s ； 5615s ； 7225s ； 每次扩增完成后， 均做溶解曲线， 以检验扩增 产物是否为特异产生 ； 0071 8. 采用 2-Ct法作相对定量分析， 结果表明 TfCHS 基因的表达水平在花朵的发育 过程中不断上升， 花朵完全开放、 花瓣完全着色时 TfCHS 的表达量显著高于其它着色。

42、阶段， 为花瓣刚着色阶段表达量的 4.8 倍， 说明该基因的表达与花瓣的着色过程有明显的相关 性 ； TfCHS 基因在叶、 茎、 雄蕊、 雌蕊、 花瓣中均有表达， 表达量由多到少分别为茎花瓣 叶雄蕊雌蕊。TfCHS 基因在茎中的表达水平与在花瓣、 叶中的无显著差异， 但显著高于 在雄蕊和雌蕊中的表达水平， 分别为其 5.8 倍和 6.3 倍， 这说明 TfCHS 基因的表达具有明显 的空间差异性。 说 明 书 CN 102965352 A 10 1/4 页 11 0001 序 列 表 CN 102965352 A 11 2/4 页 12 0002 0003 序 列 表 CN 102965352 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 102965352 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 102965352 A 14 1/3 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102965352 A 15 2/3 页 16 图 2 说 明 书 附 图 CN 102965352 A 16 3/3 页 17 图 3 说 明 书 附 图 CN 102965352 A 17 。