一种N3氧化十二烷酰基L同型丝氨酸内酯核酸适体及其筛选方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102965376 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965376 A *CN102965376A* (21)申请号 201210313778.9 (22)申请日 2012.08.30 C12N 15/115(2010.01) C12N 15/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 广东医学院 地址 524023 广东省湛江市霞山区文明东路 2 号广东医学院 (72)发明人 赵祖国 刘仿 喻云梅 李国明 张腊喜 米娜 许壁榆 晏双双 (74)专利代理机构 东莞市华南。

2、专利商标事务所 有限公司 44215 代理人 刘克宽 (54) 发明名称 一种 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨 酸内酯核酸适体及其筛选方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一 种 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内 酯 (OdDHL) 核酸适体及其筛选方法和应用， 本 发明的核酸适体能够高亲和力和高特异性结合 OdDHL， 从而具有干扰铜绿假单胞菌的群体效应系 统， 抑制铜绿假单胞菌毒力基因的表达的潜力。 本 发明的核酸适体与 OdDHL 结合的亲和力与抗体相 当， 而且制备过程更加简单、 更易于操作， 且成本 更低。 (51)Int.C。

3、l. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 7 页 1/2 页 2 1. 一种 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内酯 (OdDHL) 核酸适体， 其特征在于 ： 所述核酸适体为 SEQ ID NO:1 所示的 DNA 分子。 2. 一种如权利要求 1 所述的核酸适体的筛选方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1) OdDHL 类似物与载体的偶联 用冰冷的 MES 缓冲液配制浓度均为 20mg/ml 的 OdDHL 类似物及 EDC 溶液， 将二者加入 到用ME。

4、S缓冲液充分洗涤后的氨基化纳米磁颗粒中， 室温下反应2h， OdDHL类似物通过其分 子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应， 使分子偶联到氨基化纳米磁颗 粒的表面 ； 偶联结束后， 用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHL类似物后， 获得的偶联有 OdDHL 类似物的氨基化纳米磁颗粒备用 ； (2) 随机单链 DNA 文库的设计 随机单链 DNA 文库是两端为固定的引物序列、 中间为 45 个碱基的随机序列 ： 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)- CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 ， 其中， N45表示 45 个随机。

5、 核苷酸 ； (3) 核酸适体的筛选 a） 正向筛选 随机单链 DNA 文库的预处理 将步骤 (2) 设计的随机单链 DNA 文库于 95变性 5min 后立即置于冰中 10min， 然后用 选择缓冲液稀释至所需体积 ； 随机单链 DNA 文库中单链 DNA 与 OdDHL 类似物的结合 将经过预处理后的随机单链 DNA 文库加入到步骤 (1) 获得的偶联有 OdDHL 类似物的氨 基化纳米磁颗粒中， 并于 37缓慢颠倒混合温育 45min， 在磁力架上静置 5min， 再用洗涤缓 冲液连续洗涤， 去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链 DNA ； 单链 DNA 的扩增 将所述步骤获得的溶液， 。

6、用 Tris-HCl 重悬氨基化纳米磁颗粒， 上磁力架， 取上清液 作为 PCR 模版， 用第一引物和生物素标记的第二引物进行 PCR 扩增 ； 用于下一轮筛选的单链 DNA 的制备 将所述步骤获得的 PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒进行回收， 然后加入到链亲和素 磁珠中， 室温下温育 30min 后， 上磁力架， 去掉上清， 向氨基化纳米磁颗粒中加入 200mol/ L 的氢氧化钠溶液， 使目的单链 DNA 脱离氨基化纳米磁颗粒 ； 然后在磁力架上静置后， 取上 清， 用 200mmol/L 的盐酸调节 pH 值至 6.8-7.2， 所获得的单链 DNA 即可用于下一轮筛选 ； b） 。

7、反向筛选 为了除去文库中可能存在的与磁珠本身结合的核酸适体， 在每两轮正向筛选之间， 进 行一次反向筛选 ： 将经过正向筛选后获得的单链 DNA 加入到未与 OdDHL 类似物偶联的氨基 化纳米磁颗粒中， 于 37缓慢颠倒混合温育 45min， 使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分 结合， 然后在磁力架上静置后， 取上清， 用上清进行下一轮筛选 ； (4) 克隆测序 经过上述多轮正向筛选和反向筛选后， 将筛选所获的 PCR 产物， 克隆入 T-A 克隆载体， 转化大肠杆菌 DH5， 取阳性克隆进行测序， 制备核酸适体单链 DNA 并检测亲和力， 最终获 得核酸适体。 权 利 要 求 书 CN 10。

8、2965376 A 2 2/2 页 3 3. 根据权利要求 2 所述的核酸适体的筛选方法， 其特征在于 ： 步骤中， 所 述 第 一 引 物 的 序 列 为 ： 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-3 ； 所 述 第 二 引 物 的 序 列 为 ： 5 -TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 。 4. 根据权利要求 2 所述的核酸适体的筛选方法， 其特征在于 ： 步骤 a 中， 所述选择缓冲 液为pH7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA、 0.01%鲑鱼精DNA、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/ L MgCl2、 5 mmol/。

9、L KCl 和 0.05% Tween 20 配置而成的溶液。 5. 根据权利要求 2 所述的核酸适体的筛选方法， 其特征在于 ： 步骤 a 中， 所述洗涤缓冲 液为 pH 7.4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 0.05%（V/V） Tween 20 配置而成的溶液。 6. 一种如权利要求 1 所述的核酸适体的应用， 其特征在于 ： 在制备抑制铜绿假单胞菌 毒性的试剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102965376 A 3 1/8 页 4 一种 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内酯核酸适 体及其筛选方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域，。

10、 具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种能够与 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内酯发生高亲和力和特异性结合的核酸适体及其 筛选方法和应用。 背景技术 0002 铜绿假单胞菌 （Pseudomonase aeruginosa， PA） 是一种机会感染性致病菌， 它对临 床上应用的大部分抗生素都具有较强的耐药性， 而且其耐药性的发展速度非常快， 极易对 新型抗生素产生耐药性。 0003 研究表明， 铜绿假单胞菌产生的各种严重感染与其毒力因子的释放密切相关， 而 铜绿假单胞菌的绝大部分毒力因子的表达都受其群体效应系统 （quorum sensing， QS） 的正 性调控。N-(3-。

11、 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内酯 （N-(3-oxo-dodecanoyl)-l-homose rine lactone， 简称 OdDHL） 是铜绿假单胞菌群体效应系统的信号分子， 铜绿假单胞菌在生 长过程中， 不断向细胞外分泌 OdDHL， 当细菌周围环境中的 OdDHL 浓度达到阈值时， 便激活 铜绿假单胞菌的 QS 系统， 启动细菌毒力基因的表达， 增强铜绿假单胞菌的致病性。研究发 现， 干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统可以抑制细菌毒力， 降低其致病性， 具有治疗感染的 作用。 0004 目前， 国外已经报道了一类可以与 OdDHL 结合的鼠源性单克隆抗体， 亲和力在 5nM 。

12、150nM 之间。这类抗体在体外实验中可结合 OdDHL 分子， 干扰铜绿假单胞菌的 QS 系 统的信号转导， 从而可抑制细菌毒力的表达。 然而， 这类抗体虽然具有治疗铜绿假单胞菌感 染的潜在价值， 但由于鼠源性抗体对人类来说是一种异种蛋白， 如果直接将 OdDHL 的鼠源 性单克隆抗体应用于人体的治疗， 人体可产生针对鼠抗的抗体 （人抗鼠反应） ， 从而与抗体 结合并清除鼠抗， 降低其的疗效。而且， 直接应用鼠源性抗体还可能会诱发过敏反应， 对患 者造成损伤。由此， 鼠源性抗体需要通过人源化改造后才能应用于人体， 但是， 鼠源性抗体 的人源化改造是一个复杂、 费时的过程， 对技术要求相当高，。

13、 而且在改造过程中容易导致抗 体亲和力降低， 甚至完全丧失， 这导致鼠源性抗体应用于治疗的开发逐渐被放弃。 0005 与抗体相比， 核酸适体是通过体外筛选技术 SELEX( 指数富集配体系统进化 ) 从 DNA/RNA 文库中筛选出来的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段 （ssDNA 或 ssRNA） ， 它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子， 一些与疾病密切相关的生长 因子、 酶、 受体等物质均能成为核酸适体的靶标， 而且其化学性质稳定， 因此， 亟需要研究和 发展能够特异性抑制铜绿假单胞菌毒性的核酸适体， 从而为疾病治疗的临床应用奠定基 础。 发明内容 0006 本发明的。

14、目的之一在于克服现有技术中的不足之处而提供一种易于制备、 节约成 说 明 书 CN 102965376 A 4 2/8 页 5 本、 安全性好的能够与 OdDHL 高亲和力和高特异性结合的核酸适体。 0007 本发明的目的之二在于克服现有技术中的不足之处， 提供一种上述核酸适体的筛 选方法。 0008 本发明的目的之三在于克服现有技术中的不足之处， 提供一种上述核酸适体在制 备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。 0009 本发明的目的由以下技术措施实现 ： 提供一种 N-(3- 氧化十二烷酰基 )-L- 同型丝氨酸内酯 （OdDHL） 核酸适体， 所述核酸适 体为 SEQ ID NO:1 核。

15、苷酸序列所示的 DNA 分子。 0010 本发明还提供一种上述核酸适体的筛选方法， 包括以下步骤 ： (1) OdDHL 类似物与载体的偶联 用冰冷的 MES 缓冲液配制浓度均为 20mg/ml 的 OdDHL 类似物及 EDC 溶液， 将二者加入 到用MES缓冲液充分洗涤后的氨基化纳米磁颗粒中， 室温下反应2h， OdDHL类似物通过其分 子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应， 使分子偶联到氨基化纳米磁颗 粒的表面 ； 偶联结束后， 用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHL类似物后， 获得的偶联有 OdDHL 类似物的氨基化纳米磁颗粒备用 ； (2) 随机。

16、单链 DNA 文库的设计 随机单链 DNA 文库是两端为固定的引物序列、 中间为 45 个碱基的随机序列 ： 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)- CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 ， 其中， N45表示 45 个随机 核苷酸 ； (3) 核酸适体的筛选 a） 正向筛选 随机单链 DNA 文库的预处理 将步骤 (2) 设计的随机单链 DNA 文库于 95变性 5min 后立即置于冰中 10min， 然后用 选择缓冲液稀释至所需体积 ； 随机单链 DNA 文库中单链 DNA 与 OdDHL 类似物的结合 将经过预处理后的随机单链 DNA 文库加入到步骤 (。

17、1) 获得的偶联有 OdDHL 类似物的氨 基化纳米磁颗粒中， 并于 37缓慢颠倒混合温育 45min， 在磁力架上静置 5min， 再用洗涤缓 冲液连续洗涤， 去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链 DNA ； 单链 DNA 的扩增 将所述步骤获得的溶液， 用 Tris-HCl 重悬氨基化纳米磁颗粒， 上磁力架， 取上清液 作为 PCR 模版， 用第一引物和生物素标记的第二引物进行 PCR 扩增 ； 用于下一轮筛选的单链 DNA 的制备 将所述步骤获得的 PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒进行回收， 然后加入到链亲和素 磁珠中， 室温下温育 30min 后， 上磁力架， 去掉上清， 向氨基。

18、化纳米磁颗粒中加入 200mol/ L 的氢氧化钠溶液， 使目的单链 DNA 脱离氨基化纳米磁颗粒 ； 然后在磁力架上静置后， 取上 清， 用 200mmol/L 的盐酸调节 pH 值至 6.8-7.2， 所获得的单链 DNA 即可用于下一轮筛选 ； b） 反向筛选 为了除去文库中可能存在的与磁珠本身结合的核酸适体， 在每两轮正向筛选之间， 进 行一次反向筛选 ： 将经过正向筛选后获得的单链 DNA 加入到未与 OdDHL 类似物偶联的氨基 说 明 书 CN 102965376 A 5 3/8 页 6 化纳米磁颗粒中， 于 37缓慢颠倒混合温育 45min， 使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分 。

19、结合， 然后在磁力架上静置后， 取上清， 用上清进行下一轮筛选 ； (4) 克隆测序 经过上述多轮正向筛选和反向筛选后， 将筛选所获的 PCR 产物， 克隆入 T-A 克隆载体， 转化大肠杆菌 DH5， 取阳性克隆进行测序， 并制备单链 DNA 并进行亲和力检测， 最终获得 核酸适体。 0011 其中， 步骤中， 所述第一引物的序列为 ： 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-3 ； 所述第二 引物的序列为 ： 5 -TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 。 0012 其中， 步骤a中， 所述选择缓冲液为pH7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA、 。

20、0.01% 鲑鱼精 DNA、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L KCl 和 0.05% Tween 20 配置而成的溶液。 0013 其中， 步骤 a 中， 所述洗涤缓冲液为 pH 7.4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 0.05%（V/ V） Tween 20 配置而成的溶液。 0014 本发明的核酸适体可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂 ： 由于上述核酸适体能够特异性结合 OdDHL 分子， 干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统系 统的信号转导， 从而可抑制铜绿假单胞菌毒力的表达， 并对核酸适体抑制铜绿假单胞菌群 体效应系统介导的。

21、毒力表达功能进行验证 ： 采用一株由哥本哈根大学Michael Givskov教授赠送的表达绿色荧光的铜绿假单胞菌 报告菌株 PAO1 验证核酸适体的功能 ； 由于PAO1细菌能够表达一种受弹性蛋白酶B毒素启动子调控的绿色荧光蛋白， 而弹性 蛋白酶 B 毒素启动子又受群体效应系统的调控， 因此， 绿色荧光蛋白的表受到群体效应系 统的调控， 故可以用绿色荧光蛋白的表达与否或者表达量的高低来表示铜绿假单胞菌群体 效应系统的激活状态及毒素的表达水平， 从而验证核酸适体干扰其群体效应系统并抑制毒 力因子表达的功能 ； 向 PAO1 细菌培养物中加入核酸适体至终浓度为 0.05、 0.1、 0.2、 0。

22、.3、 0.4 及 0.5mol/ L， 在37培养16小时后， 在synergy biotek多功能酶标仪上读取荧光值， 激发光为485nm， 发射光为 525nm， 同时设置不加核酸适体的空白对照和加入无关 DNA 的阴性对照 ； 实验结果表明， 该核酸适体可以有效地抑制铜绿假单胞菌毒力的表达。 0015 本发明的优点和有益效果 ： 本发明采用 SELEX 技术筛选到一种能够与 OdDHL 高亲和力和高特异性结合的核酸适 体， 该核酸适体能结合 OdDHL， 因而具有干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统， 抑制铜绿假单 胞菌毒力基因的表达的作用。由于干扰细菌群体效应系统并不具有杀菌或者抑菌的作用。

23、， 不对细菌的生长产生选择压力， 因此， 本发明的核酸适体既具有抗铜绿假单胞菌感染的潜 力， 又不存在诱发耐药性的风险 ； 核酸适体仅需要通过简单的 PCR 技术即可大量制备， 与抗体相比， 核酸适体的生产过 程更加简单， 成本更低， 无明显的毒性及过敏源性， 而且核酸适体是一种 DNA 分子或者经过 修饰后的RNA， 其理化性质相当稳定， 无需特殊条件即可以稳定保存。 另一方面， 单克隆抗体 的分子量为 160KD， 而核酸适体的分子量介于 4.95KD-29KD 之间， 在相同质量的情况下， 核 酸适体捕获的靶分子较抗体多， 治疗效果可能会更好， 到目前为止， 尚未发现核酸适体具有 说 明。

24、 书 CN 102965376 A 6 4/8 页 7 明显的毒性或过敏源性， 因而， 本发明的核酸适体完全可以替代抗体， 可用于制备抑制铜绿 假单胞菌毒性的试剂， 其具有极佳的临床治疗应用前景。 附图说明 0016 图 1 为本发明的 OdDHLS 的核磁共振碳谱图。 图 2 为本发明的 OdDHLS 的核磁共振氢谱图。 图 3 为本发明的 OdDHLS 在 MES 缓冲液 (pH5.0) 中的 HPLC 检测结果图。 图 4 为本发明的 OdDHLS 在 Tris-HCl 缓冲液 (pH7.4) 中的 HPLC 检测结果图。 图 5 为本发明的核酸适体对 OdHLS 亲和力的 SPR 检测。

25、结果图。 图 6 为本发明的荧光竞争法检测核酸适体对 OdHL 亲和力的检测结果图。 图 7 为本发明的核酸适体抑制 LasB 毒素分泌的作用结果图。 具体实施方式 以下通过实施例对本发明进行进一步描述。 0017 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0018 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0019 实施例 1 核酸适体 核酸适体的核苷酸序列为 ： GCAATGGTACGGTACTTCCACCTTGAGAGCTGTCTGATCTGTACACGCCCTTTTACATGCTCATCCAAAAGTG CACGCTACTTTGCTAA。

26、 （SEQ ID NO:1） 。 0020 实施例 2 核酸适体的筛选方法 一、 主要试剂及缓冲液 ： （一） 主要试剂 ： 1. OdDHL 类似物 （OdDHL surrogates， OdDHLS） 本发明选用的 OdDHLS 为 ： 7-oxo-7-(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl amino-Heptanoic acid， 是由上海科胜药物研发有限公司合成。 0021 OdDHL 和 OdDHLS 的化学式 ： OdDHLS 的核磁共振 （NMR） 及稳定性检测结果如下 ： 1） OdDHLS 的核磁共振检测 如图 1 和图 2 所示， 分别为 OdDHLS 的核磁。

27、共振碳谱图和氢谱图， 其中 ： 图 1 ： 1H NMR (CD3OD,400MHz),ppm ： 4.52-4.47 (m,1H,-HCN-) ； 3.42-3.36 (m,2H,-HNCH2-) ； 2.53-2.50(m,1H,ringHCHe-) ； 2.38-2.22(m, 4 H, HNCOCH2-) ； 2.08-1.92(m,1H,ringHCHa-) ； 2.70-2.57(m,4H,2(-CH2-) ； 1.45-1.38 (m,2H,-CH2-) ； 图 2 ： 13C NMR (CD3OD, 400MHz),ppm ： 177.84 (O-C=O) ； 176.44 (。

28、2(-NHC=O) ； 51.77 (-CH-NH-) ； 40.18 (-H2C-COOH) ； 36.86 (-NHCO-CH2-) ； 34.88 (NH2-CH2-) ； 29.83(-CH2-) ； 29.56(-CH2-) ； 26.61(ring,-CH2-) ； 25.88(-CH2-)。 0022 图 1 和图 2 所示的核磁共振碳谱和氢谱的解谱结果表明 ： 合成的分子即为预期的 OdDHLS 分子。 0023 ） OdDHLS 的稳定性检测 ： 将 OdDHLS 分别溶解在 Tri-HCl 缓冲液 (50mM, pH7.4) 和 MES 缓冲液 (0.1M, 说 明 书 C。

29、N 102965376 A 7 5/8 页 8 pH5.0) 中， 至终浓度 1mg/ml， 然后用 HPLC 检测 0、 2、 4、 8、 12 和 24 小时的稳定性 (Agilent XDB-C18 250mm4.6mm, 5m ； 流速 ： 1.0ml/min ； 温度 ： 30 ； 检测器 ： 210nm)。 0024 HPLC 检测结果如图 3 和图 4 所示 ： 图 3 中， Blank 表示 MES 缓冲液的 HPLC 出峰图， 其余的为 OdDHLS 在 0 24h 的稳定性 检测结果 ； 箭头表示 OdDHLS 的峰位置。 0025 结果表明， 在 MES 缓冲液中， Od。

30、DHLS 在 24 小时内无明显降解， 能够稳定存在， 完全 可用于通过 EDC 在 MES 缓冲液中进行偶联。 0026 图 4 中， Blank 表示 Tris-HCl 缓冲液的 HPLC 检测的出峰图， 其余的为 OdDHLS 在 0h 24h 的稳定性检测结果 ； 箭头表示 OdDHLS 的峰位置。 0027 结果表明， 在 pH 值为 7.4 的 Tris-HCl 缓冲液中， OdDHLS 能够稳定存在， 完全可以 用 pH 值为 7.4 的 Tris-HCl 缓冲液进行核酸适体的筛选。 0028 其他主要试剂 PCR 产物纯化试剂盒 （购自 Qaigen 公司） 、 T-A 克隆试。

31、剂盒及 Taq DNA 聚合酶 （购自宝 生物大连有限公司） 、 Oligreen 单链 DNA 染料 （购自 Invitrogen 公司） 、 氨基化纳米磁颗粒 Dynabeads M-270 Amine磁珠及链亲和素磁珠 （购自Invitrogen公司） 、 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid（MES， Ameresco） 、 生物素及 EDC（购自 Thermofisher 公司） ， 牛血清 白蛋 （bovin serum album， BSA） 购自罗氏公司。 0029 （二） 主要缓冲液及溶液 1.Tris-HCl 缓冲液 ： 50 mmol/。

32、L Tris-HCl， pH 7.4 ； 2.MES 缓冲液 ： 0.1M， pH5.0 ； 3. 选择缓冲液 （selection buffer， SB） ： pH 7.4 的 50 mmol/L Tris-HCl 含 1% BSA、 0.01% 鲑鱼精 DNA、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L KCl 和 0.05% Tween 20 ； 4. 洗涤缓冲液 ： 50 mmol/L Tris-HCl 含 0.05%（V/V） Tween 20， pH 7.4 ； 5.40% 丙烯酰胺溶液 ： 分别加入 38g 丙烯酰胺和 2g 亚甲双丙烯酰。

33、胺， 用蒸馏水定溶 至 100ml ； 6.DNA 上样缓冲液 ： 尿素 4.8g、 0.5M EDTA 0.4ml、 1M Tris-HCl（pH 8.5） 0.05ml、 溴 酚蓝 0.025g、 超纯水定容至 10ml， 4贮存 ； 7. 包被缓冲液 ： pH 9.5， 每升含 1.59g Na2CO3， 2.93g NaHCO3， 2mL 10% NaN3； 8. 封闭缓冲液 ： 即含有 1% BSA 和 0.05%Tween 20 的 PBS 缓冲液。 0030 二、 OdDHL 核酸适体的筛选方法， 包括以下步骤 ： 1. OdDHLS 与载体的偶联 用冰冷的MES缓冲液配制浓度均。

34、为20mg/ml的OdDHLS及EDC溶液， 将二者加入到用MES 缓冲液充分洗涤后的 100l 氨基化纳米磁颗粒 （羧基结合容量为 0.152mol/ml） 中， 室温 下反应 2h， OdDHLS 通过其分子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应， 使 分子偶联到氨基化纳米磁颗粒的表面 ； 偶联结束后， 用 Tris-HCl 缓冲液充分洗涤去除 EDC 及未偶联的 OdDHLS 后， 获得的偶联有 OdDHLS 的氨基化纳米磁颗粒备用。 0031 随机单链 DNA 文库的设计 随机单链 DNA 文库由 Invitrogen 广州公司合成， 中间 45 个碱基为随机序列， 两端为固。

35、 定的引物序列， 库容量大约为 1015， 如下 ： 说 明 书 CN 102965376 A 8 6/8 页 9 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 。 0032 引物由 Invitrogen 广州公司合成， 用于核酸适体的扩增、 扩增结果的检测及从 PCR 产物中分离单链 DNA 的分离 ： 第一引物 ： 5 -GCAATGGTACGGTACTTCC-3 ； 生物素标记的第二引物 ： 5 -TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 ； 3. 核酸适体的筛选 a） 正向筛选 随机单链 DNA 文库的预处理 。

36、将步骤 (2) 设计的随机单链 DNA 文库于 95变性 5min 后立即置于冰中 10min， 然后用 选择缓冲液稀释至 100l ； 随机单链 DNA 文库中单链 DNA 与 OdDHL 类似物的结合 将经过预处理后的随机单链 DNA 文库加入到步骤 (1) 获得的偶联有 OdDHL 类似物的氨 基化纳米磁颗粒中， 并于37缓慢颠倒混合温育45min， 在磁力架上静置5min， 再用200l 洗涤缓冲液连续洗涤 5 次， 每次 3min， 去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链 DNA， 如此 重复 5 次 ； 单链 DNA 的扩增 将所述步骤获得的溶液， 用 100l Tris-HCl 重。

37、悬氨基化纳米磁颗粒， 95 处理 5min， 上磁力架， 取上清液作为 PCR 模版， 用第一引物和第二引物按照下述方案进行 PCR 扩 增 ： 94 5min 后， 进行 3 个循环 ： 94 1min， 37 1min 20sec， 58 40sec ； 然后 58 2min ； 取 1l 上述 PCR 产物为模板， 再次 PCR 扩增， 每 3 个循环取样进行凝胶电泳分析 ： i) 制备聚丙烯酰胺凝胶 ： 将尿素 3.78g、 40% 丙烯酰胺溶液 2.7ml、 10TBE 0.9ml、 超 纯水 3.2ml、 TEMED 90l 及 10% 过硫酸铵 90l 混合制成尿素 - 聚丙烯酰。

38、胺凝胶 ； ii) 将 DNA 样品与 DNA 上样缓冲液混合， 80处理 5min， 加样， 在 100V 恒压下进行 电泳， 电泳结束后， 取胶进行银染， 检测 DNA 电泳的条带 ； 根据电泳结果， 选择 PCR 产量大、 无杂带的循环数为最佳循环数， 然后按最佳循环次 数将剩余 PCR 产物扩增成双链 DNA ； 用于下一轮筛选的单链 DNA 的制备 将所述步骤获得的 PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒进行回收， 然后加入到链亲和素 磁珠中， 室温下温育 30min 后， 上磁力架， 去掉上清， 向氨基化纳米磁颗粒中加入 200mol/ L 的氢氧化钠溶液， 处理 30min， 使。

39、目的单链 DNA 脱离氨基化纳米磁颗粒 ； 在磁力架上静置 5min， 取上清， 用 200mmol/L 的盐酸调节 pH 值至 7.0 左右， 所获得的单链 DNA 即可用于下一 轮筛选。 0033 反向筛选 为了除去文库中可能存在的与磁珠本身结合的核酸适体， 在每两轮正向筛选之间， 进 行一次反向筛选 ： 将经过正向筛选后获得的单链 DNA 加入到未与 OdDHL 类似物偶联的氨基 化纳米磁颗粒中， 于 37缓慢颠倒混合温育 45min， 使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分 结合， 然后再磁力架上静置 5min， 取上清， 用上清进行下一轮筛选 ； (4) 克隆测序 经过上述多轮正向筛选和反。

40、向筛选后， 取第 14 轮筛选所获的 PCR 产物， 克隆入 T-A 克 说 明 书 CN 102965376 A 9 7/8 页 10 隆载体， 转化大肠杆菌 DH5， 取阳性克隆进行测序， 并制备单链 DNA， 最终获得优化的核酸 适体。 0034 三、 核酸适体与 OdDHLS 的亲和力 （解离平衡常数Kd） 的检测 1.SPR 技术检测 采用 strepavidin 芯片， 在 Biacore3000 上进行表面等离子共振检测， 检测温度为 25； 芯片用 30 l 1M NaCl （含 50 mM NaOH） 洗涤两次， 然后在第一通道注射溶于工作缓 冲液 （50mM Tris-HC。

41、l, 150mM NaCl, pH 7.4， 0.005%（V/V） Tween 20） 的 10nM 生物素化 的 OdDHL 样品， 上样流速为 5 ul/ml， 第二通道同时注射工作缓冲液， 作为对照。 0035 将核酸适体溶于工作缓冲液 （10 至 500 nM） 后上样， 上样时间为 120s， 滞留 300s， 然后洗涤五次 ； 芯片表面用溶于工作缓冲液的 30 l 的 5 M 尿素进行再生， 用仪器自带的 软件进行Kd的分析。 0036 核酸适体对 OdHLS 亲和力的 SPR 检测结果如图 5 所示。 核酸适体对 OdHLS 亲和力的 SPR 检测结果表明， 核酸适体与 OdD。

42、HL 的亲和力的解离平 衡常数Kd 为 30nM， 由于Ka 为Kd 的倒数，Ka 为 3.3107 L/mol。 0037 荧光竞争法检测 由于天然的 OdDHL 分子的内酯环容易水解， 因此， 无法采用上述 SPR 技术检测亲和力， 只能采用荧光竞争法检测。 0038 用不同浓度的OdDHLS-BSA包被96孔酶免疫板4过夜， 用PBST充分洗涤5次后， 用封闭缓冲液封闭 2h， 然后用洗涤缓冲液洗涤 5 次 ； 加入 100l 含有 200ng 的核酸适体， 37温育30min， 充分洗涤后， 加入0nM1M的ODDHL分子溶液100l， 37温育30min ； 用洗涤缓冲液充分洗涤后，。

43、 加入同 1 ： 200 倍稀释的 oligreen 染料， 室温下温育 15min， 在多 功能酶标仪 Synergy BioTek 上检测荧光 （激发光为 480nm， 发射光为 520nm） 。每个浓度重 复三次。采用 Oligo7.0 软件拟合曲线。核酸适体使最大荧光值下降 50% 的 ODDHL 溶液的 浓度即为核酸适体的亲和力，Kd。 0039 如图 6 所示， 荧光竞争法检测核酸适体对 OdHL 亲和力检测结果， 通过拟合方程计 算出Kd为 55nM。 0040 四、 核酸适体抑制铜绿假单胞菌群体效应系统介导的毒力表达功能的验证 采用一株由哥本哈根大学Michael Givsko。

44、v教授赠送的表达绿色荧光的铜绿假单胞菌 报告菌株 （PAO1） 来验证核酸适体在抑制铜绿假单胞菌群体效应系统介导的毒力因子表达 的功能。 0041 该细菌能够表达一种受弹性蛋白酶 B（简称 LasB） 毒素启动子调控的绿色荧光蛋 白， 而 LasB 毒素启动子又受群体效应系统的调控， 因此， 绿色荧光蛋白的表受到群体效应 系统的调控， 故可以用绿色荧光蛋白的表达与否或者表达量的高低来表示铜绿假单胞菌群 体效应系统的激活状态及毒素的表达水平， 从而验证核酸适体干扰其群体效应系统并抑制 毒力因子表达的功能。 0042 具体方法为 ： 向 PAO1 细菌培养物中加入核酸适体至终浓度为 0.05、 0。

45、.1、 0.2、 0.3、 0.4 及 0.5mol/L， 在 37培养 16 小时后， 在 synergy biotek 多功能酶标仪上读取荧光 值， 激发光为485nm， 发射光为525nm ； 同时设置不加核酸适体的空白对照和加入无关DNA的 阴性对照。 说 明 书 CN 102965376 A 10 8/8 页 11 0043 检测结果如图 7 所示， 随着核酸适体浓度的增加， 抑制 LasB 毒素分泌的作用也随 之增加， 在浓度为 0.5mol/L 时， 可抑制 96% 的该 LasB 毒素的分泌。 0044 结果表明， 该核酸适体可以有效地抑制铜绿假单胞菌毒力的表达。 0045 最。

46、后应当说明的是， 以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明 保护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应 当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。 说 明 书 CN 102965376 A 11 1/7 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 12 2/7 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 13 3/7 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 14 4/7 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 15 5/7 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 16 6/7 页 17 图 6 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 17 7/7 页 18 图 7 说 明 书 附 图 CN 102965376 A 18 。