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1、(10)申请公布号 CN 102965396 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965396 A *CN102965396A* (21)申请号 201210489489.4 (22)申请日 2012.11.27 C12P 5/02(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 30 号 (72)发明人 黄和 纪晓俊 商静生 高振 任璐静 胡学超 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用 (57) 摘要 一种含正己烷的裂殖壶菌菌体。
2、残渣的应用， 首先对裂殖壶菌菌体残渣进行预处理 ； 然后将裂 殖壶菌菌体预处理液作为氮源， 与稻草混合发酵 生产沼气， 裂殖壶菌菌体预处理液的添加量与稻 草的质量比为1:11:25， 发酵温度为3842。 本 发明使裂殖壶菌产 DHA 过程中产生的含有正己烷 的菌体残渣得到利用， 避免了资源的浪费、 环境的 污染， 同时降低了沼气的生产成本， 提高了生产效 益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 其特征在于包括如。
3、下步骤 ： 裂殖壶菌菌体残渣的预处理 ； 将步骤 1) 得到的裂殖壶菌菌体预处理液作为氮源， 与稻草混合发酵生产沼气， 裂殖壶 菌菌体预处理液的添加量与稻草的质量比为 1:11:25， 发酵温度为 3842。 2. 根据权利要求 1 所述的含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 其特征在于 ： 所述步 骤 1) 裂殖壶菌菌体残渣的预处理方法为 ： 加水稀释法或者复合酶解法中的一种或者两者 结合。 3. 根据权利要求 2 所述的含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 其特征在于 ： 所述加 水稀释法为 ： 将裂殖壶菌菌体残渣加水搅拌稀释至质量浓度为 1822% 的菌渣悬浊液。 4. 根据权利要求 2 所。
4、述的含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 其特征在于 ： 所述复 合酶解法为 ： 将裂殖壶菌菌体残渣升温至 4852， 添加占裂殖壶菌菌体残渣质量百分比 为 5% 的复合酶， 4852保温搅拌 30min， 所述复合酶为酸性蛋白酶、 碱性蛋白酶和中性蛋 白酶以 1:1:1（质量比） 的混合物。 5. 根据权利要求 1 所述的含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 其特征在于 ： 裂殖壶 菌菌体预处理液的添加量与稻草的质量比为 1:151:25。 权 利 要 求 书 CN 102965396 A 2 1/5 页 3 一种含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种含正己烷的裂殖。
5、壶菌菌体残渣的应用， 属于微生物发酵领域。 背景技术 0002 近年来， 长链多不饱和脂肪酸在人体中的生理和治疗功能得到了越来越多的重视 和发展。已经有大量的资料及文献在介绍利用生物的方法生产， 同时许多 PUFA 产品已经走 向了市场。富含 DHA（二十二碳六烯酸） 的油脂主要是利用裂殖壶菌发酵进行生产， 获得裂 殖壶菌菌体， 然后将富集的菌体通过碱性蛋白酶酶解处理， 加入有机溶剂正己烷进行萃取、 离心， 提取出 DHA 的同时获得大量裂殖壶菌菌体残渣。从实际生产中可以看到， 裂殖壶菌的 含油率在 50% 左右， 因此可以说每生产 1 吨的 DHA 油脂， 就会有一吨的干菌体残渣废弃， 由 。
6、于菌体以一种泥巴形态存在， 故生产 1 吨 DHA 油脂， 副产物湿菌渣达到近四吨。裂殖壶菌菌 体在油脂浸提的过程中， 基本上只将脂质成分浸提出， 其它成分几乎全部残留在生物体中， 含有裂殖壶菌的所有营养物质， 通过对裂殖壶菌菌体残渣的检测分析， 该物质含有丰富的 氮量， 属于优质的氮源。 0003 目前， 由于在 DHA 油脂的后提取过程中加入了有机溶剂正己烷， 从而使得裂殖壶 菌菌体残渣中有部分的正己烷残留。当前， 南京工业大学天凯生物科技对裂殖壶菌菌体残 渣是作为废弃物进行填埋处理。 现有的公开文献和专利都没有提到利用发酵的方法处理含 有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣。 发明内容 0004 本。
7、发明所要解决的问题是针对上述现有的技术， 提供一种含正己烷的裂殖壶菌菌 体残渣的一种环保科学的应用方法， 将含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣作为沼气生产中的 氮源， 从而实现资源的有效利用， 减少环境的污染， 同时消除一定的安全隐患。 0005 本发明为解决上述问题所采用的技术方案为 ： 一种含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用， 包括如下步骤 ： 1)裂殖壶菌菌体残渣的预处理。 由于收获的菌渣是一种泥状， 粘度非常的大， 预处理是 为了使其能更好的与稻草混合， 提高利用率。 0006 2) 将步骤 1) 得到的裂殖壶菌菌体预处理液作为氮源， 与稻草混合发酵生产沼气， 裂殖壶菌菌体预处理液的添加量与稻。
8、草的质量比为 1:11:25， 发酵温度为 3842。 0007 所述步骤 1) 裂殖壶菌菌体残渣的预处理方法为 ： 加水稀释法或者复合酶解法中 的一种或者两者结合。 0008 所述加水稀释法为 ： 将裂殖壶菌菌体残渣加水搅拌稀释至质量浓度为 1822% 的 菌体悬浊液。 通过稀释处理后， 再添加到稻草中进行发酵生产沼气， 使得菌体残渣可以有效 的分布在含有稻草的发酵培养基中。 0009 所述复合酶解法为 ： 将裂殖壶菌菌体残渣升温至 4852， 添加占裂殖壶菌菌体 残渣质量百分比为 5% 的复合酶， 4852温度间保温搅拌 30min， 所述复合酶为从湖北立业 说 明 书 CN 102965。
9、396 A 3 2/5 页 4 生物制品有限公司购买的工业用的酸性蛋白酶、 碱性蛋白酶和中性蛋白酶 1:1:1（质量比） 的混合物。通过复合酶处理， 使得裂殖壶菌菌体残渣中的高分子物质 - 蛋白质得到降解， 降 解的小分子物质， 能更有效地被菌体吸收利用。 0010 裂殖壶菌菌体预处理液的添加量与稻草的质量比优选为 1:151:25。 0011 在发酵过程中使用的发酵液为南京工业大学生物能源与环境生物技术研究所沼 气产业化用菌。 0012 有益效果 ： 1、 使得裂殖壶菌发酵生产 DHA 的过程中产生的含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣得 到了利用， 避免了资源的浪费， 减少了环境的污染， 同时消除。
10、了一定的安全隐患。 0013 2、 含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣经稀释、 酶解等预处理后作为氮源加入到沼气 发酵培养基中， 可以显著提高菌体残渣的利用率和沼气的产量。 0014 3、 将含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣替代尿素作为氮源加入到沼气发酵培养基 中， 在实现资源有效率利用的同时， 还降低了沼气的生产成本， 提高了生产效益。 具体实施方式 0016 下面结合实施例进一步介绍本发明， 以下实施例并不看成对本发明的限制。 0017 实施例 1 含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣中的正己烷含量的测定 ： 取泥巴状的裂殖壶菌菌体残渣 100.1024g 加入到锥形瓶中， 采用油浴进行加热， 在 110下。
11、常压蒸馏， 蒸馏出来的气体先通过冰浴进行冷凝， 在一锥形瓶中收集， 后边连接一 锥形瓶， 防止气体析出。同时连接一尾气处理装置。蒸馏时间为 4 个小时左右， 将收集到的 液体进行称重， 得到正己烷的质量为 25.4532g。泥巴状的裂殖壶菌菌体残渣中粗正己烷含 量为 25.43%。 0018 实施例 2 含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的预处理 a、 加水稀释处理 称取一定质量的裂殖壶菌菌体残渣， 为了尽可能的稀释菌体残渣， 添加水稀释成质量 百分比浓度为 1822% 的混浊液， pH 值保持自然， 搅拌均匀， 使菌体残渣完全溶解。得到的 裂殖壶菌菌体残渣稀释液作为氮源添加到沼气培养基中。 001。
12、9 b、 复合酶解处理 称取一定质量的裂殖壶菌菌体残渣， 升温至 50， 添加占裂殖壶菌菌体残渣质量百分 比为5%的复合酶， 50下保温， 在自动搅拌器下搅拌30min。 得到的酶解物作为氮源添加到 沼气培养基中。复合酶为从湖北立业生物制品有限公司购买的酸性蛋白酶、 碱性蛋白酶和 中性蛋白酶 1:1:1 的混合物。 0020 c、 稀释酶解处理 称取一定质量的裂殖壶菌菌体残渣， 添加水稀释成质量百分比浓度为 18-22% 的混浊 液， pH值保持自然， 升温至50， 添加占裂殖壶菌菌体残渣质量百分比为5%的复合酶， 50 下保温， 在自动搅拌器下搅拌 30min， 得到的稀释酶解液作为氮源添加。
13、到沼气培养基中。 0021 实施例 3 采用实施例 2a 加水稀释处理的含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣预处理液 ( 菌渣 ) 与 稻草按不同质量比混合发酵生产沼气。其中沼气培养基的基本配方 ： 物料 （秸秆和菌渣） 占 说 明 书 CN 102965396 A 4 3/5 页 5 总质量的3%8%， 菌液接种量为50%， 水占42%47%， 配比如表1， 发酵温度为3842， 发酵时 间为 13 天， 并测定每天产生的气体体积， 以尿素作为氮源发酵产沼气作为对照， 结果见表 2。 0022 表 1 ： 沼气发酵培养基 配比稻草 (g) 菌渣 (g) 菌液 (g) 水 (g)总量 (g) 稻草 ：。
14、 菌渣 (1:1)2828400344800 稻草 ： 菌渣 (2:1)2814400358800 稻草 ： 菌渣 (5:1)285.6400366.4800 稻草 ： 菌渣 (10:1)282.8400369.2800 稻草 ： 菌渣 (15:1)281.86400370.14 800 稻草 ： 菌渣 (20:1)281.4400370.6800 稻草 ： 菌渣 (25:1)281.12400370.88 800 表 2 发酵时间 （d） 尿素作为 氮源 (mL) 稻 草 : 菌 渣 (1:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (2:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (5:1)(mL) 稻 草 。
15、: 菌 渣 (10:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (15:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (20:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (25:1)(mL) 1200165132128136146149138 22851007090108138124203 34419248513014493126 484135581047710385100 51633.56823107148118136 614384371186155159181 721191217161161182192 82826664307028093203 99833128022200104150 1096380001397798 。
16、1158250001103261 124312000681874 1350000059467 总产气量 1757613.55881025927185112381729 实施例 4 采用实施例 2b 复合酶解处理的含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣预处理液 ( 菌渣 ) 与 稻草按不同质量比混合发酵生产沼气， 其余操作同实施例 3， 每天测定产生的气体体积， 结 果见表 3。 0023 表 3 发 酵 时 间 （d） 尿素作为 氮源 (mL) 稻 草 : 菌 渣 (1:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (2:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (5:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (10:1)(mL)。
17、 稻 草 : 菌 渣 (15:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (20:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (25:1)(mL) 1204178126139128138224156 22581146193116126143178 31268747104971183.5117 41043617858214634108 514526524268158144147 61571549676314766171 7186236110517615036195 819539527556249116192 913427299243231148128 1098417642114641136 114618027094。
18、2451 12397000521438 1350000047027 总产气量17426115018938501802993.51644 说 明 书 CN 102965396 A 5 发酵时间 （d） 尿素作为 氮源 (mL) 稻 草 : 菌 渣 (1:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (2:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (5:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (10:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (15:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (20:1)(mL) 稻 草 : 菌 渣 (25:1)(mL) 1192196146156153167187157 22751438798126142。
19、139195 313892581139412676132 41147643871091159483 5158547968121164123168 6140436897204173176194 7195832157165152201215 8207794319485258126231 9106188310822234101142 1093461579017684107 1183140001392489 12510000731594 13390000421937 总产气量 179176965411571079196113651844 实施例 5 采用实施例2c先稀释后酶解处理的含有正己烷的裂殖壶菌。
20、菌体残渣预处理液(菌渣) 与稻草按不同质量比混合发酵生产沼气， 其余操作同实施例 3， 每天测定产生的气体体积， 结果见表 4。 0024 表 4 从表2、 表3、 表4中我们可以得到， 以预处理过的含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣作为 氮源， 添加到稻草中进行沼气发酵是可行的， 其中稻草 : 菌渣 (15:1) 和稻草 : 菌渣 (25:1) 表现出比尿素作为氮源相近甚至更高的发酵水平， 产气量更高。 0025 实施例 6 采用实施例 2a 加水稀释处理的含有正己烷的裂殖壶菌菌体残渣预处理液 ( 菌渣 ) 与 稻草按不同质量比混合发酵生产沼气。增大发酵液体积扩大培养， 配比如表 5， 发酵温度为。
21、 3842， 发酵时间为 13 天， 并测定每天产生的气体体积， 以尿素作为氮源发酵产沼气作为 对照， 结果见表 6。 0026 表 5 配比稻草 (g) 菌渣 (g) 菌液 (g) 水 (g) 总量 (g) 稻草 ： 菌渣 (15:1)15010250023405000 稻草 ： 菌渣 (25:1)1506250023445000 表 6 发酵时间 (d)尿素作为氮源 (mL)稻草 : 菌渣 (25:1)(mL)稻草 : 菌渣 (15:1)(mL) 1132414232066 2127313821852 3173612282022 4169613583419 5199016493399 62。
22、37919762312 7233016881915 8242320932208 9195619001821 10124314692736 1196312951983 12012381343 13013821539 总产气量193132008128615 说 明 书 4/5 页 6 CN 102965396 A 6 5/5 页 7 实施例 7 实施例 7 与实施例 6 区别仅在于采用实施例 2b 复合酶解处理的含有正己烷的裂殖 壶菌菌体残渣预处理液 ( 菌渣 ) 与稻草按不同质量比混合发酵生产沼气， 其余操作同实施 例 6， 每天测定产生的气体体积， 结果见表 7。 0027 表 7 发酵时间 。
23、(d)尿素作为氮源 (mL)稻草 : 菌渣 (25:1)(mL)稻草 : 菌渣 (15:1)(mL) 1125915742179 2123112381767 3182413593247 4164312432186 5200615892489 6241920172969 7216915792576 8235819342132 9179420141956 10125313682531 1174211291794 1275210421427 1324812371184 总产气量196981932328437 实施例 8 实施例 8 与实施例 6 区别仅在于采用实施例 2c 先稀释后酶解处理的含有正己。
24、烷的 裂殖壶菌菌体残渣预处理液 ( 菌渣 ) 与稻草按不同质量比混合发酵生产沼气， 其余操作同 实施例 6， 每天测定产生的气体体积， 结果见表 8。 0028 表 8 发酵时间 (d)尿素作为氮源 (mL)稻草 : 菌渣 (25:1)(mL)稻草 : 菌渣 (15:1)(mL) 1143113652238 2123914791942 3165311351979 4170512462841 5184218243524 6216920982691 7257115282317 8202619432025 9203120471936 10142815822417 1196311632268 1246215821825 1357113011671 总产气量200912029329674 说 明 书 CN 102965396 A 7 。