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1、(10)申请公布号 CN 103088114 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103088114 A *CN103088114A* (21)申请号 201110345398.9 (22)申请日 2011.11.04 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中 国 - 澳大利亚绵羊育种研究中心 地址 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 沙依巴克区克拉玛依东街 151 号 (72)发明人 张雪梅 李文蓉 张宁 贺三刚 刘明军 (74)专利代理机构 乌鲁木齐新科联专利代理事 务所 ( 有限公司 ) 65107 代理人 欧咏 (54) 。
2、发明名称 一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的 PCR 方法 (57) 摘要 本发明提供了一种检测转基因羊转绿色荧 光蛋白基因及启动子的 PCR 方法， 针对转基因 羊， 依据 GFP 基因序列和 pLEX 载体 CMV 启动子 序列， 设计的两对特异性引物 ： 分别为 GFP- 上 游 引 物 ： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ； GFP- 下 游引物 :AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;CMV- 上 游 引 物 ： TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV- 下 游 引 物 :GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ； 以转基因羊基 因。
3、组 DNA 为模板， 扩增 GFP 基因， 其片段为 595bp ； 扩增 CMV 基因， 其片段为 421bp。本发明将单一的 PCR方法设计为双重的PCR方法， 可一次检测两种 基因结构有独到之处， 具有重要的实用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103088114 A CN 103088114 A *CN103088114A* 1/1 页 2 1. 一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子的。
4、 PCR 方法， 其特征在于 ： 针对转基 因羊， 依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列， 设计两对特异性引物， 其一为GFP-上 游引物 ： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ； GFP- 下游引物 : AGGACCATGTGATCGCGCTTCT; 其二 为 CMV- 上游引物 ： TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV- 下游引物 ： GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ； 以转基因羊基因组 DNA 为模板， 扩增的 GFP 基因的片段为 595bp ； 扩增的 CMV 基因的片段为 421bp ； 其中 DNA 模板的提取 ： 1。
5、） 取羊脐带组织的碎块 100g， 依次加入 0.5mL 的裂解液 ； 10mmol/LTris-Cl， pH7.5 ； 1mmol/L EDTA， pH7.5 ； 0.1（m/V） SDS ； 消化前加入 100mg/mLRNA 酶 15l、 10mg/mL 蛋白 酶 K 15l， 不停地摇动， 在 55下消化 58-63 分钟待用 ； 其中裂解液的配方 ： 取 10mmol/L Tris-Cl， pH7.5 ； 1mmol/L EDTA， pH7.5 ； 0.1（m/V） SDS ； 100mg/mLRNA 酶 ； 10mg/mL 蛋白酶 K， 置于试剂瓶中混合均匀即可 ； 2） 取上步消。
6、化物， 加入 0.5mL 的酚、 氯仿、 异戊醇的混合液， 其混合比为 25:24:1， 混合 均匀后置于室温下静置4-5分钟， 12000转/分钟、 离心8-10分钟， 取上清液， 用0.5mL氯仿 抽提一次， 室温下静置 5-6 分钟， 12000 转 / 分钟、 离心 10-12 分钟待用 ； 3） 取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇， 室温静置 7-10 分钟 , 沉淀 DNA ； 经 12000 转 / 分钟、 离心 9-11 分钟， 用 1mL 70乙醇洗涤 1 次 ； 12000 转 / 分钟、 离心 1.5-2.0 分钟， 弃上清， 室温静置干燥 7-12 分钟 ； 加入 50。
7、l TE， 即为 10mmol/L Tris-Cl, pH7.4 ； 1 mmol/ L EDTA， pH 8.0 ； 溶解 DNA， 4贮存备用 ； 其中 PCR 反应体系 ： 50l 反应体系为 :10PCR Taq Buffer 5l ;25mM MgCl2 4l ;dNTP Mix(2.5mM each ) 5l ; 引物(10pM/l)各 0.5l; DNA模板 100g/mL 6l ;Taq DNA Polymerse 1.25l ; Nuclease-free Water 26.75l; 总体积为 50l ； 其中 PCR 反应条件 ： 94预变性 5 分钟， 94变性 30 秒。
8、， 61退火 30 秒， 72延伸 30 秒， 35 个循环 ； 72 延伸 7 分钟 ； 其中琼脂糖凝胶电泳检测 ： PCR 扩增产物在 2的琼脂糖凝胶中电泳， 电压 80V， 电泳结束、 凝胶成像， 在 595bp 和 421bp 处出现清晰条带。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 选用的Tris-Cl为三羟甲基氨基甲烷-盐 酸溶液， EDTA 为乙二胺四乙酸， SDS 为十二烷基磺酸钠， GFP 为绿色荧光蛋白， 均购自北 京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 ； RNA 酶购自上海生物工程有限公司 ； 蛋白酶 K 购自 Amerisco 公司。 权 利 要 求 书 CN 103。
9、088114 A 2 1/4 页 3 一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的 PCR 方法 技术领域 0001 本发明涉及一次同时检测转基因羊两种基因结构的 PCR 方法， 特别针对携带两 种外源基因的转基因羊的检测， 与常规方法相比， 双重 PCR 方法不仅可节约样本材料， 而且 可以降低检测成本。 背景技术 0002 转基因动物是指人工地把外源基因导入动物的受精卵 ( 或早期胚胎细胞 )， 使之 与动物本身的基因组整合在一起， 因而外源基因能随细胞的分裂而增殖， 并能稳定地遗传 给下一代的一类动物。 开展家畜转基因新品种培育， 需高度重视转基因家畜的生物安全性。 因此， 对转基因羊外源基因结。
10、构的检测是进行安全评价必不可少的。转基因羊外源基因结 构检测包括调控元件如启动子、 增强子、 标记基因、 报告基因等的检测和目的基因检测。 0003 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein， GFP)是一类存在于腔肠动物体内的 生物发光蛋白， 其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发现清晰可见的绿光 ； 由于 检测方便， 对生物体基本没有毒性， 在很多领域已有取代 LacZ， 荧光素酶等传统标记方法的 趋势， 在制作转基因动物过程中更是如此。由于直接检测外源基因在动物体内的表达和分 布常常是困难的， 因此在制作转基因动物时， 一般在目的基因旁边加上一段表达产物易于 。
11、检测的标记基因 （如 GFP） ， 由于 GFP 发光时不需底物， 能对活体进行检测等优点， 已作为一 种报告基因得到广泛应用。 0004 启动子是指位于转录起始位点上游、 确保转录精确而有效起始的 DNA 序列， 是结 合 RNA 聚合酶并形成转录起始复合物的区域， 通常还包括促进这一过程的调节蛋白质结合 位点。 CMV启动子可在多数动物细胞和组织中高效表达， 在转基因上已被用于多种功能蛋白 或标记基因的启动子， 因此对转基因羊进行标记基因 GFP 和 CMV 启动子的检测非常必要。 0005 文献检索披露 ; 冯湘玲等在 生命科学研究 2001， 5(4):339-341.） 发表的 “一。
12、 种快速检测启动子特异性的方法” 的论文， 揭示了利用绿色荧光蛋白 (GFP) 的特性 , 与不 同的基因启动子连接， 并运用显微注射技术制备转基因蟾。根据 GFP 表达情况， 可初步判断 启动子的特异性。纪喜文等在 化学与生物工程 2010， 27(9).） 上发表的 “一种新型转 基因斑马鱼毒物检测系统的建立” 的论文， 揭示了利用转基因技术成功建立一套绿色荧光 蛋白 ( GFP) 转基因斑马鱼毒物检测系统。选用芳香烃反应元件 AH RDtk 片段和 pFRMwg+ plasmid 载体， 通过酶切、 连接和 PCR 鉴定等程序成功构建载体 DNA， 然后通过显微注射 转入斑马鱼， 经不断。
13、传代和筛选得到稳定的、 受芳香烃反应元件 AHRDtk 控制的转基因斑马 鱼。王趁芳等在 畜牧兽医学报 .2009， 40(2):185-190.） 上发表的 “转基因小鼠的多重 PCR 快速检测技术 “的论文， 揭示了采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组 DNA， 用 PCR 方法检 测其中的外源基因结构如 cytomegalovirus (CMV)启动子、 hGH polyA 终止子及目的基因 跨膜蛋白 66 ( Transmembrane protein 66， Tmem66) ,筛选到阳性样品。 优化了多重 PCR 引物退火温度及缓冲液浓度， 并探讨了扩增速率对多重 PCR 的影响。专利名称。
14、为 转红 色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应检测方法 ， 公开号为 CN 101906477A 的发明， 公开了 说 明 书 CN 103088114 A 3 2/4 页 4 它根据转红色荧光蛋白基因唐鱼外源红色荧光蛋白基因序列设计引物， 建立了快速、 有效 的能特异性检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的 PCR 方法。披露的已有技术与本发明有显著差 异。 0006 本发明通过慢病毒卵周隙注射， 制备了转绿色荧光蛋白基因绵羊， 采用苯酚氯仿 抽提法快速提取羊尾基因组 DNA， 用双重 PCR 方法同时检测标记基因 GFP 和其中的 CMV 启 动子， 得到很好的扩增效果 ； 此转基因检测技术的标准化也将。
15、为我国转基因羊的检测、 生物 安全评价、 相关法律法规的制定提供科学依据和技术支撑。 发明内容 0007 本发明的目在于 ： 提供检测转基因羊的PCR方法， 特别针对GFP基因及CMV启动子 的特异检测 ； 双重 PCR 方法为我国转基因羊和转基因羊生物安全评价提供科学依据 。 0008 本发明的目的是这样实现的 ： 一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子 的 PCR 方法， 针对转基因羊， 依据 GFP 基因序列和 pLEX 载体 CMV 启动子序列， 设计两对 特异性引物， 其一为 GFP- 上游引物 ： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ； GFP- 下游引物 : A。
16、GGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二为CMV-上游引物 ： TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下游引物 ： GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ； 以转基因羊基因组 DNA 为模板， 扩增的 GFP 基因的片段为 595bp ； 扩增的 CMV 基因的片段为 421bp ； 其中 DNA 模板的提取 ： 1） 取羊脐带组织的碎块 100g， 依次加入 0.5mL 的裂解液 ； 10mmol/LTris-Cl， pH7.5 ； 1mmol/L EDTA， pH7.5 ； 0.1（m/V） SDS ； 消化前加入 100mg/mLRNA 酶 15l、 1。
17、0mg/mL 蛋白 酶 K 15l， 不停地摇动， 在 55下消化 58-63 分钟待用 ； 其中裂解液的配方 ： 取 10mmol/L Tris-Cl， pH7.5 ； 1mmol/L EDTA， pH7.5 ； 0.1（m/V） SDS ； 100mg/mLRNA 酶 ； 10mg/mL 蛋白酶 K， 置于试剂瓶中混合均匀即可 ； 2） 取上步消化物， 加入 0.5mL 的酚、 氯仿、 异戊醇的混合液， 其混合比为 25:24:1， 混合 均匀后置于室温下静置4-5分钟， 12000转/分钟、 离心8-10分钟， 取上清液， 用0.5mL氯仿 抽提一次， 室温下静置 5-6 分钟， 120。
18、00 转 / 分钟、 离心 10-12 分钟待用 ； 3） 取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇， 室温静置 7-10 分钟 , 沉淀 DNA ； 经 12000 转 / 分钟、 离心 9-11 分钟， 用 1mL 70乙醇洗涤 1 次 ； 12000 转 / 分钟、 离心 1.5-2.0 分钟， 弃上清， 室温静置干燥 7-12 分钟 ； 加入 50l TE， 即为 10mmol/L Tris-Cl, pH7.4 ； 1 mmol/ L EDTA， pH 8.0 ； 溶解 DNA， 4贮存备用 ； 其中 PCR 反应体系 ： 50l 反应体系为 :10PCR Taq Buffer 5l ;25。
19、mM MgCl2 4l ;dNTP Mix(2.5mM each ) 5l ; 引物(10pM/l)各 0.5l; DNA模板 100g/mL 6l ;Taq DNA Polymerse 1.25l ; Nuclease-free Water 26.75l; 总体积为 50l ； 其中 PCR 反应条件 ： 94预变性 5 分钟， 94变性 30 秒， 61退火 30 秒， 72延伸 30 秒， 35 个循环 ； 72 延伸 7 分钟 ； 其中琼脂糖凝胶电泳检测 ： PCR 扩增产物在 2的琼脂糖凝胶中电泳， 电压 80V， 电泳结束、 凝胶成像， 在 595bp 和 说 明 书 CN 103。
20、088114 A 4 3/4 页 5 421bp 处出现清晰条带。 0009 本发明提供的双重 PCR 检测方法 ： 包括 （1） 引物设计根据绿色荧光蛋白 （GFP） 基 因序列和 pLEX 载体的 CMV 启动子序列设计两对特异性引物 GFP- 上游引物、 GFP- 下游引 物 ； CMV- 上游引物、 CMV- 下游引物 : 以转基因羊基因组 DNA 为模板， 扩增 GFP 基因， 片段为 595bp ； 扩增 CMV 基因， 片段为 421bp ；（2） 模板 DNA 的提取 ；（3） PCR 反应体系及反应条件设 计 ；（4） 琼脂糖凝胶电泳检测， PCR 扩增产物在 2的琼脂糖凝胶。
21、中电泳， 电压为 80V， 凝胶 成像等技术特征。 0010 本发明的构思是将单一的 PCR 方法设计为双重的 PCR 方法， 针对 GFP 基因及 CMV 启动子的特异检测 , 十分高效精准， 具有重要的实用价值， 彰显技术进步。 0011 附图说明 0012 本发明结合附图作进一步的说明。 0013 附图为 GFP 检测结果的对照基因片段图 ； 如图所述 ： M:150bp Marker; 水 : 阴性对照 ;+: 非转基因羊阳性对照 ;1,2,4,6,8 为转 GFP 基因阳性羊 ;3,5,7 为转 GFP 基因阴性羊。 具体实施方式 实施例 0014 对转基因羊体内绿色荧光蛋白基因及启。
22、动子同时进行检测的双重 PCR 方法分步 实施 ： （一） 引物设计 根据绿色荧光蛋白 （GFP）基因序列和 pLEX 载体的 CMV 启动子序列设计特异性引物 GFP- 上游引物、 GFP- 下游引物 ； CMV- 上游引物、 CMV- 下游引物 : GFP- 上游引物 ： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC GFP- 下游引物 ： AGGACCATGTGATCGCGCTTCT CMV- 上游引物 ： TCCCATAGTAACGCCAATAG CMV- 下游引物 ： GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA 以转基因羊基因组 DNA 为模板扩增 GFP 基因， 以转。
23、基因羊基因组 DNA 为模板扩增 CMV 基因， 非转基因羊基因组 DNA 为模板无扩增片段出现。 0015 （二） 模板 DNA 的提取 （1） 取待检测的转基因羊脐带组织约 100g 剪碎后 （同时以非转基因羊脐带组织做对 照） ， 加入 0.5mL 的裂解液， 其配方为 10mmol/LTris-Cl （三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸） ， pH7.5 ； 1mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸） ； ， pH7.5， 0.1（m/V） SDS( 十二烷基磺酸钠 ) ； 临用前加 入 100mg/mLRNA 酶 15l ； 10mg/mL 蛋白酶 K 15 微升， 在 55下消化 1 小时，。
24、 其间不时轻轻 摇动 ； （2） 取上述消化物， 加入 0.5mL 的按 25:24:1 比例混合的酚、 氯仿、 异戊醇混合物 , 颠 倒混匀， 室温下静置 5 分钟后， 12000 转 / 分钟、 离心 10 分钟， 取上清液， 再用 0.5mL 氯仿抽 说 明 书 CN 103088114 A 5 4/4 页 6 提一次， 室温下静置 5 分钟后， 12000 转 / 分钟、 离心 10 分钟， 取上清液 ； （3） 取上部上清液加入两倍体积的无水乙醇， 室温静置 10 分钟沉淀 DNA， 12000 转 / 分 钟、 离心 10 分钟 ； （4） 用 1mL70乙醇洗涤 1 次， 120。
25、00 转 / 分钟离心 2 分钟， 吸去上清， 室温静置干燥 10 分钟， 加入 50l TE（10mmol/L Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸） , pH7.4 ； 1 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸） ， pH 8.0） 溶解 DNA， 4贮存备用。 0016 （三） PCR 反应体系 50l 反应体系为 :10PCR Taq Buffer 5l ;25mM MgCl2 4l ;dNTP Mix(2.5mM each ) 5l ; 引物(10pM/l)各 0.5l;模板DNA(100g/mL) 6l ;Taq DNA Polymerse 1.25l ; Nuclease-。
26、free Water 26.75l; 总体积为 50l。 0017 （四） PCR 反应条件 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒， 61退火 30 秒， 72延伸 30 秒， 35 个循环 ； 72 延伸 7 分钟。 0018 （五） 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物在 2的琼脂糖凝胶中电泳， 电压 80V， 电泳结束后， 凝胶成像显示在 595bp 和 421bp 处出现清晰条带。 0019 所述的方法， 选用的 Tris-Cl 为三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸溶液， EDTA 为乙二胺四 乙酸， SDS 为十二烷基磺酸钠， GFP 为绿色荧光蛋白， 均购自北京鼎国昌盛生物技术有限。
27、责 任公司 ； RNA 酶购自上海生工生物工程有限公司 ； 蛋白酶 K 购自 Amerisco 公司。 说 明 书 CN 103088114 A 6 1/1 页 7 cgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca 。
28、ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tgg。
29、ccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 本设计特异性扩增 GFP 的引物为 ： 。
30、上游引物 （5-3） ： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ； 下游引物 （5-3） :AGGACCATGTGATCGCGCTTCT; ta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 。
31、actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatc 本设计特异性扩增 CMV 的引物为 ： 上游引物 （5-3） :TCCCATAGTAACGCCAATAG; 下游引物 （5-3） : GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ； 序 列 表 CN 103088114 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103088114 A 8 。