一种DNA多位点定向突变方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103088015 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103088015 A *CN103088015A* (21)申请号 201310016659.1 (22)申请日 2013.01.16 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 上海中医药大学 地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路 1200 号 (72)发明人 赵淑娟 周禄斌 胡之璧 王峥涛 周吉燕 (74)专利代理机构 上海麦其知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31257 代理人 董红曼 (54) 发明名称 一种 DNA 多位点定向突变方法 (57) 摘要 本发明提供一。

2、种 DNA 多位点定向突变方法， 根据 DNA 突变位点设计包含 Class IIS 限制性内 切酶识别位点和切割位点的引物， 经分段 PCR 扩 增、 酶切、 连接反应得到连接产物， 并以该连接产 物直接进行PCR 扩增， 实现 DNA 多位点突变。 本发 明能快速高效地同时实现 DNA 多位点定向突变。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103088015 A CN 103088015 A *CN103088015A* 1/2 。

3、页 2 1. 一种 DNA 多位点定向突变方法， 其特征在于， 根据 DNA 突变位点设计包含 Class IIS 限制性内切酶识别位点和切割位点的引物， 经分段 PCR 扩增、 酶切、 连接反应得到连接产 物， 并以该连接产物直接进行 PCR 扩增， 实现 DNA 多位点突变。 2. 如权利要求 1 所述的 DNA 多位点定向突变方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： a. 构建引物 ： 所述引物包括外部引物和内部引物 ； 其中， 所述外部引物包括 5 端的正向外部引物和 3 端反向外部引物 ； 其中， 所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物 ； 所述内部引物自 5 端到 3 端 依次为。

4、 ： 保护碱基、 Class IIS 限制性内切酶识别位点、 Class IIS 限制性内切酶切割位点、 以及目标基因区域 ； b. 分段 PCR 扩增 ： 利用所述内部引物和所述外部引物， 进行分段高保真 PCR 扩增反应， 各扩增产物经琼 脂糖凝胶电泳， 回收获得各目的片段 ； c. 酶切、 纯化 ： 将回收的所述目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切， 经纯化， 得到酶切纯 化片段 ； d. 连接反应 ： 用 T4DNA 连接酶将步骤 c 中获得的所述酶切纯化片段连接， 得到连接产物 ； e.PCR 扩增全长反应 ： 利用外部引物， 以步骤 d 中的所述连接产物为模板， 进。

5、行高保真 PCR 扩增全长。 3.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变方法， 其特征在于， 所述突变是可同时在多 位点的缺失突变、 插入突变、 置换突变。 4.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述Class IIS限制 性内切酶包括 Eco31I、 BbvI、 BsaI、 Esp3I、 SapI。 5.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述高保真PCR反应 是使用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 反应。 6. 如权利要求 1 所述的 DNA 多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述 PCR 反应的反 应体系包括 ： 10l 5Bu。

6、ffer(Mg2+plus)， 4l dNTP mixture( 各 2.5mM)， 1l 正向引物 (10M)， 1l 反向引物 (10M)， 0.1 100ng 模板， 0.5l DNA 聚合酶 (2.5U/l)， 加灭 菌双蒸水至总体积 50l。 7. 如权利要求 1 所述的 DNA 多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述步骤 b、 d 中 PCR 反应条件包括 ： 94 98下变性 10 秒 5 分钟 ； 94 98下变性 10 30 秒， 45 65 下退火 0 30 秒， 68 72下延伸 0.5 5 分钟， 并进行 28 32 个循环 ； 72延伸 2 10 分钟。 8.如权。

7、利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述步骤c中酶切的 反应体系包括 ： 5l10Buffer， 2030l所述回收目的片段， 4l Class IIS限制性内 切酶， 加灭菌双蒸水至总体积50l ； 所述步骤c中酶切的反应条件包括 ： 先在3765条 件下反应 5 30 分钟， 再在 65 80下反应 5 30 分钟。 9.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述步骤d中连接反 权 利 要 求 书 CN 103088015 A 2 2/2 页 3 应体系为 ： 5l10Buffer， 酶切纯化产物片段， 1 5U T4DNA 连接酶， 加入灭菌。

8、双蒸水至 总体积为 50l。 10. 如权利要求 1 所述的 DNA 多位点定向突变的方法， 其特征在于， 所述步骤 d 中连接 反应的条件为 4过夜， 或 16或室温 15 分钟 3 小时。 权 利 要 求 书 CN 103088015 A 3 1/9 页 4 一种 DNA 多位点定向突变方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及一种基因定点突变方法， 具体涉及一种 DNA 多位 点定向突变的方法。 背景技术 0002 随着人类基因组计划的完成， 生物工作者越来越多地把研究重点转移到基因功能 上。基因定点突变技术正适应了这一要求， 通过有目的地将蛋白链上某一个或几个氨基酸 突变。

9、为其它氨基酸， 以确定蛋白的结构和功能中心。通过将启动子上顺式反应元件的一个 或几个碱基突变， 以探索该元件的功能中心。 另外， 定点突变技术也为基因工程改造、 优化、 提高酶的活性提供了一个途径。 0003 PCR 介导的定点突变技术因具有高效、 便捷、 经济等优点而倍受瞩目。基于 PCR 技 术的发展， 许多定点突变的方法得到进一步改进， 例如， 重叠 PCR 技术 (Gene Splicing by OverlapExtension PCR， OE-PCR)， 基于Class IIS限制性内切酶的DNA直接连接(Splicing by DirectedLigation， SDL) 技术以。

10、及反向 PCR 技术等。这些技术的共同之处都是采用 PCR 技术通过特定的引物设计引入突变位点， 不同之处在于获得带有全部突变位点的全长 DNA 片段的方法不同。OE-PCR 技术利用首轮 PCR 引入的相同序列的互补进行后续的延伸或 PCR 获得全长片段 ； SDL 技术利用酶切产生的粘性末端序列互补连接得到中间拼接产物， 再将 中间拼接片段连接到克隆载体， 进行克隆子转化、 筛选， 得到带有突变的基因片段。 0004 现有技术的上述方法， 在多位点定向突变的实践工作中均存有一些不足， 例如， OE-PCR 技术原理简单明了， 但在实际操作中， 当需要连接的中间片段数量多于三个时， 准 确拼。

11、接效率就会降低。改进的 OE-PCR 方法中 “两两混合法” (double-mixing)、“步步拼接 法” (Step-by-stepassembling)、“顺序连接法” (Sequentially connecting) 等， 虽提高了 片段的正确拼接效率， 但是多步的延伸、 PCR 反应都需要优化才能得到最适条件， 因而费时 费力。而 SDL 方法， 虽在多个中间片段连接中具有优势， 但通常都需要将拼接产物连接到克 隆载体、 通过转化、 菌落筛选才能得到需要的 DNA 片段， 耗时较多， 增加工作量， 因而应用并 不广泛。 发明内容 0005 本发明采用了 SDL 技术的基于 Cla。

12、ss IIS 内切酶和 T4 连接酶的中间片段连接策 略及 OE-PCR 技术获取全长片段 PCR 扩增策略， 克服了现有技术的上述缺陷， 其目的是提供 一种相对快速、 操作简单、 成本较低的 DNA 拼接及基因多位点定向突变的方法， 利用含有 Class IIS 限制性内切酶识别位点和切割位点的引物， 通过 PCR 扩增、 Class IIS 限制性内 切酶酶切、 T4DNA 连接酶连接、 连接产物直接 PCR 扩增的方法， 来实现对 DNA 片段进行拼接 及对多个位点同时突变的目的。 0006 本发明公开了一种 DNA 多位点定向突变方法， 根据 DNA 突变位点， 设计包含 Class 。

13、IIS 限制性内切酶识别位点和切割位点的引物， 经分段 PCR 扩增、 酶切、 连接反应得到连接 说 明 书 CN 103088015 A 4 2/9 页 5 产物， 并以该连接产物直接进行 PCR 扩增， 实现 DNA 多位点突变。 0007 本发明 DNA 多位点定向突变方法， 包括以下步骤 ： 0008 步骤 a) 构建引物 ； 所述引物包括外部引物和内部引物 ； 0009 其中， 所述外部引物有两条 ： 5 端的正向外部引物和 3 端反向外部引物， 所述外 部引物的长度通常为 18-30 个碱基。正向外部引物序列与目标基因 5 端序列相同 ； 反向外 部引物序列为目标基因 3 端序列的。

14、反向互补序列。优选地， 根据实验需要， 也可以在外部 引物的外侧引入限制性内切酶位点。 0010 其中， 所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物。 优选地， 根据突变实验的 具体要求的不同， 内部引物可设计为多条。所述内部引物的一般序列组成自 5 端到 3 端 依次为 ： 保护碱基、 Class IIS 限制性内切酶识别位点、 Class IIS 限制性内切酶切割位点、 以及目标基因区域。进一步优选地， 内部引物设计序列由 5 端到 3 端依次为 ： 2-3 个保护 碱基、 Class IIS 限制性内切酶识别位点、 Class IIS 限制性内切酶切割位点 ( 即拟突变碱 基区域 )、 。

15、目标基因区域。 0011 本发明中， 根据拟突变碱基所处序列的位点及突变方式， 分别设计所述内部引物 的 ClassIIS 限制性内切酶切割位点序列组成。具体地， 当拟突变位点为单个碱基突变， 包 括插入、 缺失和置换突变， 该突变碱基可以直接在 Class IIS 限制性内切酶切割位点体现 ； 当拟突变位点为多个连续碱基的缺失突变时， Class IIS 限制性内切酶切割位点应该设计 为目标基因序列。 0012 本发明中， 目标基因区域是指要进行研究的特定基因的序列。例如， 实施例 1 中的 AnSh基因序列即为该实施例中引物设计所指的目标基因区域。 优选地， 内部引物设计时， 目 标基因区。

16、域的碱基数为 17-30bp。进一步优选地， 目标基因区域的碱基数为 18-25bp。 0013 本发明中， 由于相邻两个片段的拼接是通过以酶切产生的粘性末端互补进行， 因 此， 将要连接的 DNA 片段对应的引物切割位点的碱基应该是互补序列。如， 实施例 1 中 R1 与 F2， R2 与 F3， R3 与 F4， R4 与 F5， R5 与 F6 中的切割位点序列都是互补的。 0014 步骤 b) 分段 PCR 扩增 ： 0015 利用步骤 a 中构建的所述内部引物和外部引物， 以目标基因为模板， 将目标基因 对应的引物两两组合， 通过分段高保真 PCR 扩增， 分别扩增出各段序列， 然后。

17、， 将各扩增产 物分别进行琼脂糖凝胶电泳， 并分别回收各个目的片段。 本发明中， 目的片段指实验设计分 段PCR扩增想要获得的目标基因分段的DNA片段， 如实施例中以目标基因为模板， 分别以F1 和 R1、 F2 和 R2、 F3 和 R4、 F5 和 R6 为引物， 扩增得到的 F1R1 片段、 F2R2 片段、 F3R4 片段、 F5R6 片段等目的片段。 0016 步骤 c) 酶切并纯化 ： 0017 将步骤b)中回收获得的各个目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切， 将酶切产物进行纯化， 得到酶切纯化片段。 0018 步骤 d) 连接反应 ： 0019 利用T4DNA连接。

18、酶， 将步骤c获得的各个酶切纯化片段进行连接反应， 获得连接产 物。 0020 步骤 e) 全长 PCR 扩增反应 0021 利用步骤a)构建得到的外部引物， 以步骤d)获得的连接产物作为模板， 用高保真 说 明 书 CN 103088015 A 5 3/9 页 6 酶进行 PCR 扩增全长， 得到带有突变的全长目标基因。 0022 本发明中， 所述突变可以同时用于多位点的缺失突变、 插入突变、 置换突变。本发 明中的缺失突变， 是指在目标基因中进行碱基缺失的突变， 包括单个碱基缺失和多个碱基 连续缺失。 本发明中的插入突变， 是指在目标基因中插入单个碱基或多个连续碱基的突变。 本发明的置换突。

19、变， 是指在目标基因中进行碱基置换的突变， 包括单个碱基置换和多个碱 基置换。上述三种突变方式都可以通过内部引物设计来完成。 0023 本发明中， 所述Class IIS限制性内切酶是一类DNA限制性内切酶， 其特点是识别 位点与切割位点不是同一个序列， 切割位点在识别位点之外。所述 Class IIS 限制性内切 酶的识别位点与其切割位点分别位于双链 DNA 的不同区域， 且该切割位点碱基序列组成与 该内切酶是否能发挥内切酶功能相互之间没有关联。优选地， 所述 Class IIS 限制性内切 酶包括 Eco31I、 BbvI、 BsaI、 Esp3I、 SapI 等。 0024 本发明中， 。

20、所述步骤 b 的分段高保真 PCR 反应、 步骤 d 中的 PCR 扩增全长反应均是 使用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 反应。 0025 本发明中， 所述步骤 b、 步骤 d 中的 PCR 反应的反应体系如下 ： 0026 0027 0028 本发明中， 所述步骤 b、 步骤 d 中的 PCR 反应的反应条件为 ： 0029 94 98下变性 0 5 分钟 ； 0030 94 98下变性 5 30 秒， 55 65下退火 0 30 秒， 68 72下延伸 0.5 5 分钟， 并进行 28 32 个循环。 0031 优选地， 所述步骤b、 d中PCR反应条件包括 ： 9498下变性10秒5。

21、分钟 ； 94 98下变性 10 30 秒， 45 65下退火 0 30 秒， 68 72下延伸 0.5 5 分钟， 并进 行 28 32 个循环 ； 72延伸 2 10 分钟。 0032 本发明中， 所述步骤 b 中回收目的片段采用的是 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒。 0033 本发明中， 所述步骤 c 中酶切反应体系如下 ： 说 明 书 CN 103088015 A 6 4/9 页 7 0034 0035 本发明中， 所述步骤 c 中的酶切反应条件为 ： 根据所使用限制性内切酶的不同， 先 在 37 65条件下反应 5 30 分钟进行酶切， 再在 65 80下反应 5-30 分钟， 使酶 。

22、失活。 0036 本发明中， 所述步骤 c 中酶切产物纯化采用的是 PCR 产物纯化试剂盒。 0037 本发明中， 所述步骤 d 中连接反应体系如下 ： 0038 0039 本发明中， 所述步骤 d 中连接反应条件为 4过夜， 或 16或室温下反应 15 分 钟 3 小时。 0040 本发明 DNA 多位点定向突变方法的有益效果在于 ： 本发明巧妙地构建了包含 Class IIS 限制性内切酶的识别位点和切割位点的引物， 利用引物进行分段 PCR 扩增、 并将 连接产物直接作为模板用于下一轮的 PCR 扩增， 通过分段 PCR、 酶切、 纯化、 T4DNA 连接酶连 接、 连接产物直接 PCR。

23、 反应， 从而实现快速拼接 DNA 以及同时对 DNA 进行多位点的定向突 变。 0041 本发明方法对 DNA 模板没有限制， 对需要突变的目标基因 DNA 可以是线性 DNA， 也 可以是质粒， 并且对质粒大小也没有严格要求， 适用范围广。 通过分段PCR扩增， 多个DNA片 段拼接及多位点定向突变 ( 缺失、 插入、 置换 ) 可以同时进行。将连接产物直接进行 PCR 扩 增全长， 富集了突变后的全长 DNA 片段， 为直接测序进行突变验证提供了可能， 可以通过对 全长扩增产物的直接测序来判断突变是否成功， 也为后续操作提供了方便。且整个过程不 需要构建克隆载体及克隆子筛选， 避免了耗时。

24、的克隆子筛选过程， 节省时间， 提高效率。此 外， 本发明方法操作简单， 仅需要借助 PCR、 酶切、 连接等常规分子生物学技术， 且实验条件 可参照有关试剂盒说明进行， 不需要耗时进行反应条件优化， 重复性好， 提高了 DNA 拼接及 多位点定向突变研究的工作效率。在需要突变位点较多时， 即分段 PCR 产生较多的中间片 段需要连接时， 本发明的优点尤为明显。 附图说明 0042 图 1 为以 Class IIS 限制性酶中 Eco31I 限制性内切酶为例说明本发明中的酶切、 说 明 书 CN 103088015 A 7 5/9 页 8 连接过程示意图。 0043 图 2 为本发明的技术路线。

25、示意图。 0044 图 3 为本发明实施例 1 实施过程示意图。 0045 图 4a 为实施例 1 中分段 PCR 电泳结果图。 0046 图 4b 为实施例 1 中连接产物直接 PCR 电泳结果图。 0047 图 5 为本发明实施例 2 中一个 AnSh 基因四碱基缺失突变序列对比图。 0048 图 6a 为实施例 2 中分段 PCR 电泳结果图。 0049 图 6b 为实施例 2 中连接产物直接 PCR 琼脂糖凝胶电泳结果图。 具体实施方式 0050 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。实施本发明的过程、 条件、 实验方。

26、法等， 除以下专门提及的内 容之外， 均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明没有特别限制内容。应当理解， 此处所 描述的具体实施例仅用以解释本发明， 并不因此限定本发明。本发明的保护内容不局限于 以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下， 本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中， 并且以所附的权利要求书为保护范围。 0051 本发明 DNA 多位点定向突变方法， 其反应路线如图 2 所示。图 2 中， 长方框表示外 显子， 线条表示内含子。长方框上方和下方的短线表示 PCR 扩增所用引物。上方的短线表 示为正向引物， 例如， F1、 F2、 F3、 F4、 F5、 F6。下。

27、方的短线表示为反向引物， 例如， R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6。外部引物是位于两个端点位置上， 例如， F1、 R6。内部引物是位于外显子和内含 子的连接处， 例如， F2、 F3、 F4、 F5、 F6、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5。长方框两侧小方块表示分段 PCR 扩增后引入的限制性内切酶位点， 其中， 深色方块表示 Class IIS 限制性内切酶识别位点， 浅色方块表示通常的一般限制性内切酶位点。 0052 以 Class IIS 限制性酶中 Eco31I 限制性内切酶为例说明本发明 DNA 多位点定向 突变方法中的酶切过程、 连接过程等， 如图 1 所示。图。

28、 1 中， 标有 X、 Y 的灰色长方框分别表 示目标基因的上下游区域 ； Eco31I 下划线表示的 Eco31I 内切酶的识别位点 ； 带有折线的 “1234” 表示 Eco31I 内切酶的切割位点， 表示内切酶切割后产生的粘性末端为 “1234” 碱基 ； “1、 2、 3、 4、 N” 表示此处的碱基可以是 A、 T、 C、 G 四种碱基中的任意一种。 0053 实 施 例 1 黑 曲 霉 水 杨 酸 羟 化 酶 Aspergillus niger salicylate hydroxylase(AnSh， Genbanknumber ： NT_166526) 基因内含子的去除 0054。

29、 黑 曲 霉 水 杨 酸 羟 化 酶 Aspergillus niger salicylate hydroxylase(AnSh， Genbank number ： NT_166526) 基因全长 1718bp， 包括 5 段内含子和 6 段外显子， 如图 3 所 示。图 3 中， 长方框表示外显子， 线条表示内含子。长方框上方和下方的短线表示 PCR 扩增 所用引物， 其中， 上方的短线表示为正向引物， 例如， F1、 F2、 F3、 F4、 F5、 F6。下方的短线表 示为反向引物， 例如， R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6。其中， 外部引物是 F1、 R6。内部引物是 F2、。

30、 F3、 F4、 F5、 F6、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5。 0055 图 3 中， 长方框两侧小方块表示分段 PCR 扩增后引入的限制性内切酶位点， 其 中， 深色方块表示 Class IIS 限制性内切酶识别位点 ； 该 Class IIS 限制性内切酶可以是 Eco31I、 BbvI、 BsaI、 Esp3I、 或 SapI 等 DNA 内切酶之任意一种。浅色方块表示一般限制性内 说 明 书 CN 103088015 A 8 6/9 页 9 切酶位点， 该一般限制性内切酶指识别位点与切割位点一致的限制性内切酶， 例如， EcoRI、 HindIII、 BamHI、 XbaI 。

31、等。 0056 本实施例具体包括 ： 0057 1. 引物设计 0058 在外显子和内含子的连接处， 构建设计引入 Class IIS 限制性内切酶识别位点的 内部引物， Class IIS 限制性内切酶采用 Eco31I， 如图 3 所示。本发明中， 还可以分别选用 BbvI、 BsaI、 Esp3I 或 SapI 等之任意一种 Class IIS 限制性内切酶作为本方法所采用的 DNA 内切酶， 获得的实验效果均与本实施例 1 或 2 相同。 0059 本实施例中构建的引物序列如下 ： 0060 0061 0062 注 ： 斜体大写字母是 Eco31I 限制酶的识别位点， 斜体小写字母分别。

32、是 HindIII 和 EcoRI 酶切位点。方框中字母为连接互补碱基， 即， 此处碱基在引物 R1 与 F2、 R2 与 F3、 R4 与 F5、 R5 与 F6 中分别互补。 说 明 书 CN 103088015 A 9 7/9 页 10 0063 2. 分段 PCR 扩增 0064 提取黑曲霉基因组DNA(包含有AnSh(Genbank number ： NT_166526)基因在内的全 基因组 DNA)， 以此基因组 DNA 为模板， 利用外部引物和内部引物的两两组合 (F1 与 R1， F2 与 R2， F3 与 R4， F5 与 R6)， 进行分段 PCR 扩增反应。以 F1 和 。

33、R1 为引物进行 PCR 扩增得片 段 exon1， 即 F1R1 片段 ； 以 F2 和 R2 为引物进行 PCR 扩增片段得 exon2， 即 F2R2 片段 ； 以 F3 和 R4 为引物进行 PCR 扩增片段 exon3 至 exon4， 即 F3R4 片段 ； 以 F5 和 R6 为引物进行 PCR 扩增片段 exon5 至 exon6， 即 F5R6 片段。上述分段 PCR 扩增反应可以在各自反应体系下同 时进行。 0065 上 述 分 段 PCR 扩 增 反 应 中，使 用 TaKaRa 高 保 真 酶 PrimerSTAR HS DNA Polymerase， 反应体系和反应条。

34、件如下 ： 0066 0067 0068 PCR 反应条件 ： 98， 10 秒 ； 68， 30 秒 ； 循环 30 次。 0069 3. 回收目的片段 0070 将上述分段 PCR 扩增反应获得的各个扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳， 如图 4a 所示， 图 4a 表示分段 PCR 电泳结果图， 其中， M ： DNA 分子量标准 ； 1、 2、 3、 4 ： 分段 PCR 扩增产 物， 依次表示 exon1、 exon2、 exon3-4、 exon5-6 片段， 即分别为 F1R1 片段、 F2R2 片段、 F3R4 片段、 F5R6 片段。使用胶回收试剂盒 ( 上海捷瑞生物有限公司 )。

35、 回收目的片段。 0071 4. 酶切并纯化 0072 酶切 ： 使用限制性内切酶 FastDigestEco31I(Fermentas) 对回收目的片段 ( 胶回 收产物 ) 进行酶切， 酶切反应体系如下 ： 0073 说 明 书 CN 103088015 A 10 8/9 页 11 0074 酶切反应条件 ： 37水浴 15 分钟， 65水浴 5 分钟使酶失活。 0075 纯化 ： 酶切产物用 PCR 产物纯化试剂盒 ( 上海捷瑞生物有限公司 ) 进行纯化。优 选地， 通过纯化可以减少碎片序列的影响， 从而提高正确连接效率。 0076 5. 连接。 0077 使用 T4DNA 连接酶 (P。

36、romega) 将等摩尔数的各个酶切纯化片段进行连接。连接反 应体系如下 ： 0078 0079 0080 连接反应条件为 ： 室温放置 5-15 分钟。 0081 6. 第二次分段 PCR、 第二次 Eco31I 酶切、 第二次 T4DNA 连接酶连接 0082 优选地， 本发明 DNA 多位点定向突变方法可以采用多次分段 PCR、 多次 Eco31I 酶 切、 多次 T4DNA 连接酶连接反应。本实施例中， 考虑到 exon3 和 exon5 片段较短可能会和引 物二聚体混淆， 采用两次分段 PCR、 酶切及 T4DNA 酶连接。 0083 以本实施例步骤 5 中获得的连接产物为模板， 分。

37、别以 F1 和 R3、 F4 和 R5、 F6 和 R6 为引物进行第二次分段 PCR 扩增反应、 以及第二次 Eco31I 酶切、 第二次 T4DNAligase 连接。 以进一步去除 exon3 和 exon4 间的内含子、 exon5 和 exon6 间的内含子。第二次的反应条 件均分别与前述相应步骤相同。 0084 7. 连接产物直接进行全长 PCR 扩增反应 0085 使用TaKaRa高保真酶PrimerSTAR HS DNA Polymerase， 以外部引物F1和R6为引 物， 以本实施例步骤 6 中获得的连接产物为模板， 直接进行全长 PCR 扩增。反应体系如下 ： 说 明 书。

38、 CN 103088015 A 11 9/9 页 12 0086 0087 反应条件 ： 98， 10 秒 ； 68， 90 秒 ； 循环 30 次。 0088 8. 产物 ( 突变结果 ) 0089 将以上获得的全长 PCR 扩增反应产物进行 1琼脂糖凝胶电泳， 如图 4b 所示。图 4b 为连接产物直接 PCR 电泳结果图， 其中， M ： DNA 分子量标准 ； AnSh ： 全部内含子已去除的 全长 AnSh 基因 PCR 扩增产物。电泳结果表明， 所获得的扩增产物大小与预期大小一致。将 PCR 产物直接进行测序， 并将其与原 AnSh 基因序列进行对比分析， 结果表明 ： 基于连接产。

39、物 直接 PCR 扩增所得到的全长 DNA 片段序列为 AnSh 基因内含子全部去除的基因序列， 实验结 果与预期结果一致。 0090 实施例 2 黑曲霉水杨酸羟化酶碱基缺失突变体的修复 0091 本实施例对黑曲霉水杨酸羟化酶碱基缺失突变体进行修复。 一个黑曲霉水杨酸羟 化酶突变体在 888-890bp 和 894bp 处出现 4 个碱基的缺失突变， 如图 5 所示的 AnSh 基因四 碱基缺失突变序列对比图。图 5 中， 方框中表示突变发生的碱基位置。斜体并用下划线标 出碱基为引物设计时参照的目标基因区域。其中， 加黑字体的碱基 CACC 为拟连接处互补序 列。 0092 本实施例中， 根据。

40、 DNA 突变位点设计的引物如下 ： 0093 外部引物 ： 与实施例 1 中的 1F( 正向引物 ) 和 R6( 反向引物 ) 相同。 0094 内部引物 ： 0095 P1R ： 5 ATATCACCCAGAGACGCCA 3 ； 0096 P2F ： 5 GGCGAACCATACCCATA 3。 0097 其中， 斜体大写字母是 Eco31I 限制酶的识别位点， 方框中大写字母为互补碱基。 0098 本实施例中的分段 PCR 扩增、 酶切、 连接方法、 连接产物全长 PCR 扩增等步骤参照 实施例 1， 分段 PCR 所用引物组合为 F1 和 P1-R， P2-F 和 R6。实验结果如图。

41、 6 所示的琼脂 糖凝胶电泳结果图， 其中， M ： DNA 分子量标准 ； 图 6a 中， 1、 2 表示分段 PCR 扩增产物， 1 表示 F1P1R 片段、 2 表示 P2FR6 片段 ； AnSh ： 表示突变已完成的全长 AnSh 基因 PCR 扩增产物。 0099 对本实施例的产物进行测序， 并将测序结果进行比对， 结果表明突变位点完全正 确。 说 明 书 CN 103088015 A 12 1/3 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103088015 A 13 2/3 页 14 图 3 图 4(a) 图 4(b) 说 明 书 附 图 CN 103088015 A 14 3/3 页 15 图 5 图 6(a) 图 6(b) 说 明 书 附 图 CN 103088015 A 15 。