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1、(10)申请公布号 CN 103073644 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103073644 A *CN103073644A* (21)申请号 201210590618.9 (22)申请日 2012.12.31 CCTCC NO:C201299 2012.09.25 C07K 16/28(2006.01) C12N 5/20(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 中国科学技术大学 地址 230026 安徽省合肥市包河区金寨路 96 号 (72)发明人 孙汭 毕嘉成 张清 郑晓东 田志刚 魏海明。
2、 (74)专利代理机构 北京市汉信律师事务所 11373 代理人 王文生 (54) 发明名称 特异性抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体及其制备 方法、 鉴定及应用 (57) 摘要 本发明涉及一种抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗 体, 本发明还涉及生产该单克隆抗体的杂交瘤细 胞 株 mTIGIT-mAb-13G6( 保 藏 编 号 : CCTCC NO : C201299), 本发明还涉及该单克隆抗体的制备 方法及应用, 本发明的单克隆抗体能高效阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合, 可以用于 Western blot、 ELISA、 Flow Cytometry 检测 mTIGIT 分子。 (。
3、83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103073644 A CN 103073644 A *CN103073644A* 1/1 页 2 1.一种特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体, 所述抗体由保藏号为CCTCC NO : C201299的 大鼠杂交瘤细胞株 mTIGIT-mAb-13G6 分泌产生。 2. 按照权利要求 1 所述的抗体, 其亚型为 IgG2a, 。 3. 按照权利要求 1。
4、 所述的抗体, 其能高效阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合。 4. 产生权利要求 1 所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株 mTIGIT-mAb-13G6, 其保藏号为 CCTCC NO : C201299。 5. 制备权利要求 1 所述的单克隆抗体的方法, 所述方法包括从保藏号为 CCTCC C201299 的杂交瘤细胞株 mTIGIT-mAb-13G6 培养上清中或者从腹腔接种所述杂交瘤细胞株 的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。 6.权利要求1的单克隆抗体在制备用于检测mTIGIT的试剂盒中的应用, 所述试剂盒利 用权利要求 1 的单克隆抗体通过 Western blot、 ELISA 或 F。
5、low Cytometry 来检测 mTIGIT。 7.一种检测mTIGIT的试剂盒, 所述试剂盒包含权利要求1所述的抗小鼠TIGIT的单克 隆抗体。 8. 一种检测 mTIGIT 的方法, 所述方法包括下述步骤 : (1) 将权利要求 1 所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育 ; (2) 判断是否有阳性反应。 9.根据权利要求8的方法, 其中所述阳性反应通过免疫印记、 ELISA或流式细胞术检测 进行判断。 权 利 要 求 书 CN 103073644 A 2 1/8 页 3 特异性抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体及其制备方法、 鉴定及 应用 技术领域 0001 本发明涉。
6、及到一株抗小鼠TIGIT(全称T cell Ig and ITIM domain)的单克隆抗 体。具体地说, 涉及到对 TIGIT 有特异性的单克隆抗体, 本发明还涉及产生该单克隆抗体的 杂交瘤细胞株, 以及所述单克隆抗体的制备方法及应用。 背景技术 0002 天然杀伤细胞 ( 即, NK 细胞 ) 作为主要的天然免疫细胞, 在机体杀伤病毒感染细 胞以及肿瘤细胞方面起着重要的作用, NK 细胞通过其表面不同的活化型受体和抑制型受体 来控制 NK 细胞的活化、 增殖和杀伤等功能。 0003 TIGIT(T cell Ig and ITIM domain) 分子是 2009 年新发现表达在 NK 。
7、细胞表面 的抑制性受体, 主要包含胞外 IgV- 样结构域, 跨膜区和胞内 ITIM 基序 (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif), 以高亲和力结合配体 PVR(poliovirus receptor), 并通过胞内 ITIM 基序传递抑制信号, 从而抑制 NK 细胞的杀伤功能, 与活化性受体 CD226/ CD96 协同调控 NK 细胞的活化与功能。 0004 在黑色瘤荷瘤小鼠中, TIGIT表达上调, 肿瘤细胞又高表达配体PVR, 并且TIGIT结 合PVR的能力远高于CD226/CD96, 这使得NK细胞活性受到抑制, 会造成肿瘤。
8、免疫耐受, 导致 肿瘤免疫逃逸。 0005 真核表达 mTIGIT-hFc 融合蛋白, 免疫大鼠, 取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤 IR983F 细胞融合, 筛选出能分泌对 mTIGIT 有反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞, 且其抗体能 高效阻断 mTIGIT 与配体 mPVR 的结合, 从杂交瘤培养上清中或者从腹腔接种杂交瘤细胞的 裸鼠腹水中获取单克隆抗体。 0006 制备 mTIGIT 阻断性单克隆抗体, 为 mTIGIT 分子的检测以及 mTIGIT 功能的研究提 供了基础, 该抗体可广泛用于分子免疫学的研究中, 并且可作为打破肿瘤免疫耐受的潜在 治疗工具。 发明内容 0007 本发明的一个目。
9、的是提供对小鼠 TIGIT(mTIGIT) 有特异性的单克隆抗体。 0008 本发明的再一个目的是提供产生特异性抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体的杂交瘤细 胞株。 0009 本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。 0010 本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体用于检测 mTIGIT 的应用, 所述 单克隆抗体能够阻断mTIGIT与其配体PVR的结合, 能通过用于Western blot、 ELISA或Flow Cytometry 检测 mTIGIT。 0011 本发明的一个方面涉及一种对 mTIGIT 有特异性的单克隆抗体以及其制备方法, 所述抗体的类型为 IgG2a, 。
10、, 并且能高效阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合。 说 明 书 CN 103073644 A 3 2/8 页 4 0012 本发明的另外一个方面涉及一株稳定分泌 mTIGIT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 其命名为 mTIGIT-mAb-13G6, 保藏编号为 CCTCC NO : C201299, 于 2012 年 9 月 25 日保藏于中 国典型培养物保藏中心 ( 地址 : 中国武汉, 武汉大学, 邮编 : 430072)。 0013 本发明的另外一个方面涉及筛选能够表达特异性结合小鼠 TIGIT 的抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法, 所述方法包括 : mTIGIT。
11、 与人 Fc 的融合蛋 白 mTIGIT-hFc 的表达与纯化, 用 mTIGIT-hFc 免疫大鼠, 取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤 IR983F 细胞融合, 筛选杂交瘤细胞, 其分泌的单克隆抗体能特异性高亲和 mTIGIT-hFc, 将 筛选得到的细胞株命名为 mTIGIT-mAb-13G6, 保藏编号为 CCTCC NO : C201299。 0014 由细胞株 mTIGIT-mAb-13G6 分泌的抗小鼠 TIGIT 单克隆抗体能高效阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合。 0015 另外, 本发明所述的抗小鼠 TIGIT 单克隆抗体也称为 13G6 单克隆抗体。 0016 本发明的一。
12、个优选方面涉及制备抗小鼠 TIGIT 单克隆抗体的方法, 所述方法包括 从保藏号为 CCTCC NO : C201299 的杂交瘤细胞株 mTIGIT-mAb-13G6 培养上清中或者从腹腔 接种所述杂交瘤细胞株的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。 0017 本发明的另一方面涉及单克隆抗体对 mTIGIT 和 mPVR 结合的阻断作用。用本发明 的单克隆抗体检测阻断效率, 结果显示, 单克隆抗体能高效的阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合。 0018 本发明的另一方面涉及单克隆抗体在 Western blot 检测 mTIGIT 中应用。用本 发明的单克隆抗体鉴定 mTIGIT 蛋白的表达, 。
13、Western blot 实验显示 : 单克隆抗体能在 Western blot 水平用于检测 mTIGIT-hFc 融合蛋白。 0019 本发明的另一方面涉及单克隆抗体在 ELISA 水平检测 mTIGIT 的应用。用本发 明的单克隆抗体检测不同浓度的 mTIGIT-hFc, 结果显示 : 单克隆抗体能用于 ELISA 检测 mTIGIT-hFc 蛋白。 0020 本发明的另一方面涉及单克隆抗体能用于 Flow Cytometry 检测 mTIGIT。用本发 明的单克隆抗体标记可以用于标记 mTIGIT 阳性细胞, 而不标记 mTIGIT 阴性细胞。表明本 发明的单克隆抗体能用于 Flow 。
14、Cytometry 检测 mTIGIT 的表达。 0021 本发明还涉及本发明的抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体在制备用于检测 mTIGIT 的 试剂盒中的应用, 所述试剂盒利用本发明所述的抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体通过 Western blot、 ELISA 或 Flow Cytometry 来检测 mTIGIT。 0022 本发明还涉及一种检测 mTIGIT 的试剂盒, 所述试剂盒包含本发明所述的抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体。 0023 本发明还涉及一种检测 mTIGIT 的方法, 所述方法包括下述步骤 : (1) 将本发明的 单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育,。
15、 (2) 判断是否有阳性反应。其 中所述阳性反应是指本发明的特异性抗 mTIGIT 抗体与待测样品中 mTIGIT 的结合, 所述阳 性反应可以通过免疫印记、 ELISA 或流式细胞术检测进行判断。 0024 本发明中, 术语 “单克隆抗体的特异性” 是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或 者抗原决定簇并与之结合的性质。 0025 术语 “单克隆抗体的反应性” 是指在合适的反应条件下, 单克隆抗体与抗原结合的 能力。 0026 术语 “细胞株” 是指通过筛选或者有限稀释方法, 从原代培养物或者细胞系获得的 说 明 书 CN 103073644 A 4 3/8 页 5 单细胞培养物。 0027 根。
16、据本发明的公开, 选择 mTIGIT-hFc 融合蛋白, 按照本文描述的方法制备有特异 性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的, 应该视为包含在本发明的范围 内。 0028 综上所述, 本发明的有益效果在于 : 本发明提供了一种抗小鼠 TIGIT 的单克隆 抗体的制备方法、 鉴定及应用, 该单克隆抗体具有效价高, 特异性好等优点, 且能高效阻断 mTIGIT 与 mPVR 的结合, 适用于不同标本的检测。本发明提供的单克隆抗体, 可以广泛用于 Western blot、 ELISA、 flowCytometry 等不同手段检测 mTIGIT 蛋白, 为研究 mTIGIT 的功能 提供。
17、了基础。 0029 缩略语的含义 : 0030 mTIGIT : 小鼠 TIGIT(T cell Ig and ITIM domain) 0031 mPVR : 小鼠 PVR(poliovirus receptor), 小鼠 TIGIT 的配体 附图说明 0032 从下面结合附图的详细描述中, 本发明的上述特征和优点将更明显, 其中 : 0033 图 1, 载体 pcDNA3-mTIGIT-hFc 的构建。 0034 图 2, mTIGIT-hFc 融合蛋白表达、 纯化及鉴定, 其中 : 0035 图 2A, mTIGIT-hFc 融合蛋白纯化的鉴定结果 ; 0036 图 2B, mTIGIT。
18、-hFc 融合蛋白的 Western blot 鉴定结果 ; 0037 图 3, 本发明的单克隆抗体纯度鉴定结果。 0038 图 4, 本发明的单克隆抗体特异性鉴定结果, 其中 : 0039 图 4A, Flow cytometry 方法鉴定单克隆抗体对 mTIGIT 特异性的结果 ; 0040 1)293T-mTIGIT/hTIGIT/mCD226/mCD96 阳性率检测 0041 2) 本发明的单克隆抗体不识别细胞表面的 hTIGIT/CD226/CD96 分子 0042 图 4B, 间接 ELISA 法验证单克隆抗体对 mTIGIT 的特异性的结果 ; 0043 图 4C, Wester。
19、n blot 方法鉴定单克隆抗体对 mTIGIT 特异性的结果。 0044 图 5, 本发明的单克隆抗体阻断功能的鉴定结果, 其中 : 0045 图 5A, 293T-mPVR 转染效率检测 ; 0046 图 5B, 本发明的单克隆抗体高效阻断 293T-mPVR 和 mTIGIT-hFc 蛋白的结合 ; 0047 图 6, 本发明的单克隆抗体用于 Western blot 检测 mTIGIT 的结果。 0048 图 7, 本发明的单克隆抗体用于 ELISA 检测 mTIGIT 的结果。 0049 图 8, 本发明的单克隆抗体用于 FACS 检测 mTIGIT 的结果。 0050 A. 本发明。
20、的单克隆抗体检测 293A-mTIGIT 细胞表面的 mTIGIT ; 0051 B.商品化的流式抗体(Anti-Mouse TIGIT Alexa647, eBioscience, Cat. NO.50-9501) 检测 293A-mTIGIT 细胞表面的 mTIGIT。 0052 保藏说明 0053 分泌特异性抗小鼠 TIGIT 的单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞株 mTIGIT-mAb-13G6 于 2012 年 9 月 25 日保藏于中国典型培养物保藏中心 ( 地址 : 中国武汉, 武汉大学, 邮编 : 430072), 保藏编号为 CCTCC NO : C201299。 说 明 书 CN 。
21、103073644 A 5 4/8 页 6 0054 序列表说明 0055 具体实施方式 0056 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明, 但不以任何形式 限制本发明。 0057 实施例中的实验方法, 如无特别说明, 均采用本领域常规技术, 实验试剂均为市售 产品。 0058 实施例 1 : 真核表达载体 pcDNA3-mTIGIT-hFc 的构建 0059 从 pMD18-T- 全长小鼠 TIGIT 载体 (pMD18-T 购自 Takara, Code : D103A) 中 PCR 扩增小鼠 TIGIT 胞外段编码序列, 将序列片段与 pcDNA3-hFc 重组质粒 (p。
22、cDNA3 购自 Invitrogen, 编号 V790-20) 在 EcoRI 和 Xho I 处酶切后进行连接, 连接产物转化 DH5 大 肠杆菌, 涂板生长过夜, 并对筛选得到的菌株进行PCR检测, 将PCR鉴定阳性的克隆进行DNA 测序, 测序结果表明载体pcDNA3-mTIGIT-hFc构建成功。 真核表达载体pcDNA3-mTIGIT-hFc 的构建流程如图 1 所示。 0060 实施例 2 : 融合蛋白 mTIGIT-hFc 的表达、 纯化与鉴定 0061 1, 融合蛋白 mTIGIT-hFc (SEQ ID NO : 3) 的表达 0062 将 pcDNA3-mTIGIT-hF。
23、c 载体转染 293A 细胞 ( 购自上海细胞库, 目录号 : GNHu 1), 收集无血清培养物上清, 30kD 膜 ( 购自碧云天 ) 浓缩上清, 用 Protein G 纯化柱 ( 购自 GE Healthcare, HiTrap Protein G HP, 货号 : 1700404-01) 对浓缩上清进行目的蛋白的富集, 然后用酸性 PBS(pH2.8) 进行洗脱, 再对洗脱的蛋白溶液用碱性的 Tris 缓冲液 (pH9.0) 进 行中和, 即得到 mTIGIT-hFc 蛋白溶液。结果如图 2A 所示。 0063 2, 融合蛋白的鉴定 0064 将纯化的 mTIGIT-hFc 蛋白进行。
24、 SDS-PAGE&Western Blot 鉴定 ; 结果如图 2B。 0065 实施例 3 : 单克隆抗体的制备 0066 1, 脾细胞的制备 0067 纯 化 的 mTIGIT-hFc 蛋 白 与 等 体 积 完 全 弗 氏 佐 剂 (CFA, 购 自 Sigma, 货 号 F5881-10ML) 混合, mTIGIT-hFc 的终浓度为 100g/ml, 将混合物充分混匀形成油包水, 取 大鼠 ( 购自上海斯莱克, 雄性, 8 周龄 ) 进行初次免疫, 每只大鼠注射 40-60g mTIGIT-hFc 蛋白 ( 免疫剂量为 133-200g/kg 大鼠体重 ), 间隔 2 周免疫一次。。
25、免疫 5 次后, 酶联免疫 吸附实验 (ELISA) 检测大鼠的血清效价很高, 将大鼠处死之后取大鼠脾脏, 过 200 目细胞 筛, 收集滤过的脾细胞, 静置数分钟之后, 吸取上层脾细胞。 说 明 书 CN 103073644 A 6 5/8 页 7 0068 酶联免疫吸附实验 (ELISA) 检测抗体效价的方法如下 : 用包被液 (0.1M 碳酸盐 缓冲液 pH 9.6) 稀释纯化的蛋白至 10g/ml, 100l/ 孔包被 96 孔 ELISA 板, 4过夜, 用 PBST(0.05 Tween20-PBS pH 7.4) 清洗 3 遍, 1 BSA 封闭, 37孵育 2 小时。PBST 。
26、清洗 3 遍, 加入待测倍比稀释的大鼠血清(实验组), 设置6-7个梯度, 未免疫健康大鼠血清做阴性 对照, 100l/ 孔, 37孵育 1 小时。PBST 清洗 3 遍, 每孔加入 100l 1 10000 稀释的辣 根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗鼠抗体 ( 购自 Boster 公司, 货号 BA1050), 37孵育 1 小 时。清洗后加入 TMB 底物液 ( 购自 eBioscience 公司, 货号 00-4201-56), 100l/ 孔, 避光 显色 15 分钟, 加入终止液 (2MH2SO4)50l/ 孔, 终止后立即检测 OD490。 0069 2, 饲养细胞的制备 00。
27、70 在细胞融合前一天, 制备大鼠腹腔巨噬细胞, 作为饲养层细胞。具体方法如下 : 将 8 周龄正常大鼠脱臼处死, 75酒精消毒, 暴露腹部, 剪开腹膜。用 10ml 注射器吸取 5ml DMEM 不完全培养液 ( 购自 Gibco 公司 ) 注入小鼠腹腔, 反复抽吸数次。用注射器回抽腹腔 内液体, 注入离心管。用 DMEM 不完全培养基洗涤 2 次, 300g 4离心 10min, 弃上清。用 DMEM( 含 10小牛血清 ) 培养液重悬细胞, 调整细胞浓度为 2105/ml, 加 100 入 96 孔中, 每孔 100l, 放入细胞培养箱, 37, 5 CO2条件下培养。 0071 3, 。
28、细胞融合及杂交瘤细胞的制备 0072 取制备好的脾细胞 (10-15107) 和骨髓瘤细胞 IR983F( 购自通派 ( 上海 ) 生物 科技有限公司, 5107) 的在无血清 DMEM 培养基中充分混匀, 离心后洗净培养基, 轻轻弹起 细胞, 加入预热的 PEG( 分子量 1,000-6,000) 溶液, PEG 的终浓度为 50 (W/V), 60 秒之后 加入无血清DMEM培养基(购自Gibco公司), 离心之后收集沉淀的细胞, 加入HAT选择培养 基重悬。HAT 选择培养基为包含 20 FCS( 小牛血清 )、 10mM sodiumhypoxanthine( 次黄嘌 呤 )、 40m。
29、M aminopterin( 氨基蝶呤 )、 1.6mMthymidine( 胸腺嘧啶 ) 的 DMEM 培养基。 0073 融合的细胞悬液加到预先制备的饲养细胞 ( 即, 上述 2 中制备的饲养细胞 ) 中, 融合细胞在 HAT 选择培养基培养一周之后, 换用 HT 培养基 ( 包含 20 FCS、 10mM sodium hypoxanthine、 1.6mM thymidine 的 DMEM 培养基 ) 持续培养足够的时间, 然后筛选产生目 的抗体的杂交瘤细胞并进行 ELISA 检测。同时用含有 10小牛血清的 DMEM 培养液取代 HT 培养液进行培养。 0074 将得到的产生本发明单。
30、克隆抗体的杂交瘤细胞采用有限稀释方法进行亚克隆化, ELISA多次筛选后得到杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6, 连续体外培养2个月以上或者冻存 6 个月之后, 该细胞株仍能稳定和大量分泌抗小鼠 TIGIT 的抗体。该杂交瘤细胞株于 2012 年 9 月 25 日保藏于中国典型培养物保藏中心 ( 地址 : 中国武汉, 武汉大学, 邮编 : 430072), 保藏编号为 CCTCC NO : C201299。 0075 3, 单克隆抗体的制备 0076 制备单克隆抗体时, 其一, 可以从上述杂交瘤细胞培养上清中获得抗体, 具体来 说, 细胞传代培养 2 天后收培养上清, 上清中含有较高浓。
31、度的单克隆抗体。其二, 可以将所 述杂交瘤细胞注射到用石蜡预先免疫的裸鼠腹腔, 通过抽取裸鼠腹水进行提取获得单克隆 抗体, 具体来说, 石蜡免疫 8-10 周龄的雌性裸鼠, 每只裸鼠腹腔注射 500l 无菌的液体石 蜡 ; 一周之后腹腔注射杂交瘤细胞, 每只裸鼠注射 1-2106细胞, 7-10 天左右产生腹水, 收 集裸鼠腹水, 离心收上清即腹水抗体。通过上述方法获得的抗体, 可以用 Protein G 亲和层 说 明 书 CN 103073644 A 7 6/8 页 8 析方法纯化, 抗体的纯度用 SDS-PAGE 鉴定。如图 3 所示, 经过纯化的单克隆抗体的纯度接 近 100, 单克隆。
32、抗体分子量约 140kDa, 其中重链约 45kDa, 轻链约 25kDa。 0077 实施例 4 : 单克隆抗体的鉴定 0078 1, 间接 ELISA 测定单克隆抗体效价 0079 ELISA 检测单克隆抗体效价的方法如下 : 0080 用 0.1M 碳酸缓冲液稀释 mTIGIT-hFc 蛋白至 0.25g/ml, 100l/ 孔, 包被 96 孔 ELISA板, 4过夜, 用PBST(0.05Tween20-PBS, pH 7.4)清洗3遍, 1BSA封闭, 37孵育 2 小时。PBST 清洗 3 遍, 加入经过倍比稀释的杂交瘤细胞 mTIGIT-mAb-13G6 培养物上清或 腹水, 。
33、设置 8-12 个梯度, 用其他的杂交瘤细胞 ( 例如, pK136, 购自中科院上海细胞库 ) 培养 物上清或腹水当阴性对照, 设 PBS 为调零孔, 100l/ 孔, 37孵育 1 小时。PBST 清洗 3 遍, 每孔加入 100l 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗大鼠 IgG(OLIGOAB02H) 抗体 (1 2000 稀释, 该抗体购自 Absea), 37孵育 1 小时。清洗后加入 TMB 底物液 ( 购自 eBioscience 公司, 货号 00-4201-56), 100l/ 孔, 避光显色 10-15 分钟, 加入终止液 (2M H2SO4)100l/ 孔, 酶标仪终止。
34、后立即检测 OD450 和 OD630。与 PBS 孔相比, 当测试抗体检测值 / 阴性对照 值 ( 比值 ) 大于 2.1 设为阳性, 以最大稀释度的阳性孔为抗体的滴度。 0081 2, BIAcore 3000 测定单克隆抗体的亲和常数。 0082 放入 CM5 芯片, Dock, 用 PBS 作流动相, 致敏两次。先注射 50mMNaOH+0.05 SDS(10l/min, 2min), 然后注射 50mM NaOH(10l/min, 2min) 冲洗芯片表面。首先摸索适 宜的 mTIGIT-hFc 浓度及 pH, 最终确定抗原浓度为 10g/ml, pH 5.0。 0083 注射活化液。
35、 (pH 5.5 和 pH 5.0 的醋酸钠按 1 1 体积比混匀 )(5l/min, 7min, ) 活化芯片, 用 PH 5.0 的 NaAc 将抗原 ( 即, mTIGIT-hFc) 稀释至 10g/ml, 注射稀释 的抗原, 开始进行抗原标记, 只标记一个通道, 留另一个通道做空白对照。 用乙醇胺封闭, 封 闭时间流速与活化时相同。1PBS 致敏两次, 用不同抗体浓度测试标记效果, 同时摸索再 生条件, 可确定 50mM NaOH 是比较合适的再生条件。将 13G6 单克隆抗体 ( 即, 本发明的抗 小鼠 TIGIT 单克隆抗体 ) 用 1PBS 倍比稀释至 0.24g/ml, 0.0。
36、8g/ml, 0.0267g/ml, 0.0089g/ml, 0.00296g/ml, 0.0001g/ml, 0.000033g/ml 七个浓度, 设定程序测定 13G6单克隆抗体对抗原mTIGIT-hFc的亲和力。 得到亲和力曲线后进行拟合, 得出亲和力常 数 K, 单位 L/M, 见下表 1。 0084 3, 单克隆抗体的 Ig 亚类测定 0085 单克隆抗体的亚类、 培养上清效价、 腹水抗体效价和亲和常数的结果见表 1。 0086 表 1. 本发明的单克隆抗体的亚类、 培养上清效价、 腹水抗体效价和亲和常数 0087 亚类IgG2a, 培养上清抗体效价10-4 10-3 腹水抗体效价1。
37、10-12 亲和常数 (L/M)7.141011 0088 4, 单克隆抗体的特异性鉴定 说 明 书 CN 103073644 A 8 7/8 页 9 0089 hTIGIT、 mCD226和mCD96分子与mTIGIT分子高度同源, 以13G6mAb为一抗, 分别与 细胞 293T-mTIGIT、 293T-hTIGIT、 293T-mCD226 和 293T-mCD96 结合 ( 上述四种细胞由本发 明人按照常规方法制备 : 构建重组载体 pcDNA3-mTIGIT、 pcDNA3-hTIGIT、 pcDNA3-mCD226 和 pcDNA3-mCD96, 将构建的重组载体分别转染 293。
38、T 细胞 (293T 细胞购自上海细胞库 ), 再用 PE- 抗大鼠 IgG2a( 购自 eBioscience, 货号 12-4817) 为二抗检测 13G6 单克隆抗体, 结果如 图 4A 所示, 13G6 仅能特异性识别 mTIGIT 分子, 对其余三种分子无识别, 说明 13G6mAb 是针 对 mTIGIT 的特异性单克隆抗体。 0090 用 间 接 ELISA 法 验 证 单 抗 的 特 异 性, 13G6mAb 为 一 抗, HRP 标 记 的 抗 大 鼠 IgG(OLIGOAB02H)( 购自 Absea) 作为二抗进行 ELISA 检测, 13G6mAb 基本不结合 eGFP。
39、-hFc, 如图 4B 所示。 0091 采用免疫印迹的法进行特异性检测, 我们以该单克隆抗体作为一抗, HRP 标 记的抗大鼠 IgG(OLIGOAB02H)( 购自 Absea) 作为二抗进行 Western blot 检测, 检测 融 合 蛋 白 mTIGIT-hFc 和 eGFP-hFc, 经 Western blot 鉴 定, 如 图 4C 所 示, 在 分 子 量 41kDa(mTIGIT-hFc) 处有一特异性条带, 而在 55kDa 左右 (eGFP-hFc) 处没有特异性条带。 进一步证明杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体对hFc无反应, 是针对mTIGIT的特异性单克隆 抗体。5。
40、, 单克隆抗体阻断功能的鉴定 0092 13G6mAb 细胞培养物上清先与 1g mTIGIT-hFc 蛋白孵育, 4, 20min ; 再用孵育 混合物重悬 293T-mPVR 细胞 (293T 细胞购自上海细胞库, 目录号 : GNHu17), 4, 20min ; PBS 清洗 3 遍, 3500rpm 离心 5min, 标记流式抗体 PE- 山羊抗人 Fc( 购自 BD Bioscience), 4, 20min, 转入流式管, 用小型流式细胞仪检测 (BD FACSCalibur) 检测。结果如图 5B 所示, 对 比全阻断和未阻断组, 13G6mAb 基本能完全阻断 mTIGIT 。
41、与 mPVR 的结合, 说明该单抗有高效 的阻断能力。实施例 5 : 抗小鼠 TIGIT 单克隆抗体的应用 0093 1) 用于 Western blot 检测 mTIGIT 0094 用纯化的单克隆抗体作为一抗, HR 标记的兔抗大鼠抗体 ( 购自 BOSTER, 货号 : BA1058) 作为二抗进行 Western blot 检测, 如图 6, 该单克隆抗体能够检测 293A-mTIGIT-hFc 细胞全裂解液中的 mTIGIT-hFc 蛋白, 293A-eGFP-hFc 总蛋白中未检测到 信号。 0095 2) 用于 ELISA 检测 mTIGIT 0096 分别用不同浓度的融合蛋白 。
42、mTIGIT-hFc 包被 96 孔板, 所制备的单克隆抗体作为 一抗, HRP 标记的抗大鼠 IgG(OLIGOAB02H)( 购自 Absea) 作为二抗, 最后加入 TMB 显色液 ( 购自 eBioscience, 货号 00-4201-56), 检测 OD450 和 OD630, 计算 450 OD450-OD630, 做不同浓度的融合蛋白 mTIGIT-hFc 对应的 450 曲线图, 经过拟合之后 R2可以达到 ELISA 要求。结果见如图 7, 表明该单克隆抗体能够用于 ELISA 检测 mTIGIT 蛋白。 0097 3) 用于 Flow Cytometry 检测 mTIGI。
43、T 0098 FACS 检测 mTIGIT 在细胞系 293A-mTIGIT(pcNDA3-mTIGIT 质粒转染 293A 细胞, 293A 购自上海细胞库 ) 和 293A 表面的表达, 所制备的单克隆抗体作为一抗, 用 PE- 抗大鼠 IgG2a( 购自 BD Bioscience) 作为二抗, 用本发明的单克隆抗体 13G6 标记表达 mTIGIT 的 阳性细胞 (293A-mTIGIT) 和阴性细胞 (293A), 如图 8(A) 所示, 所制备的单克隆抗体能结合 到 293A-mTIGIT 细胞表面, 但不与 293A 细胞结合。对比商品化的 Alexa 647/mTIGIT 标记。
44、 说 明 书 CN 103073644 A 9 8/8 页 10 mTIGIT, 如图 8(B), 两者比例接近, 结果表明本发明的单克隆抗体可以用于流式检测小鼠 TIGIT 分子。 0099 应该理解, 尽管参考其示例性的实施方案, 已经对本发明进行具体地显示和描述, 但是本领域的普通技术人员应该理解, 在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范 围的条件下, 可以在其中进行各种形式和细节的变化, 可以进行各种实施方案的任意组合。 说 明 书 CN 103073644 A 10 1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103073644 A 11 2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 103073644 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 103073644 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 103073644 A 14 1/3 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103073644 A 15 2/3 页 16 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103073644 A 16 3/3 页 17 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103073644 A 17 。