《一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103074237 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074237 A *CN103074237A* (21)申请号 201310023319.1 (22)申请日 2013.01.22 CGMCC No.6994 2012.12.17 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农业资源与农业区 划研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号中国农业科学院农业资源与农业 区划研究所， 中。
2、国农业微生物菌种保藏 管理中心 (72)发明人 顾金刚 李世贵 刘好宝 阮志勇 张晓霞 马晓彤 张瑞颍 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一株可可木霉及其在防治蔬菜 病害中的应用。本发明的可可木霉 （Trichoderma theobromicola） 的菌株号为 Gu11， 其在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记 入册编号为 CGMCC No.6994。本发明的可可木霉 Gu11 及其制剂对环境友好， 可抑制病害病原的耐 药和抗药性发展。
3、， 有利于绿色食品和有机农业的 推广， 并且成本低、 无污染、 对蔬菜作物安全。 在土 壤中引进拮抗微生物， 通过生物防治可以有效地 防治真菌病害并可以有效的改善环境， 维持农业 生态系统平衡， 为走可持续发展道路提供强劲的 后盾。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103074237 A CN 103074237 A *CN103074237A* 1/1 页 2 1. 可 可 木 霉 （Trichod。
4、erma theobromicola） ，其 特 征 在 于 ： 所 述 可 可 木 霉 （Trichoderma theobromicola） 的菌株号为 Gu11， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No.6994。 2. 权利要求 1 所述可可木霉在防治植物病害中的应用。 3.权利要求1所述的可可木霉和/或所述可可木霉的代谢物在制备植物病原菌抑制剂 或植物病害抑制剂中的应用。 4. 植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂， 它的活性成分是权利要求 1 所述的可可木霉 和 / 或所述可可木霉的代谢物。 5. 如权利要求 2 或 3 所述的应用或权利要求。
5、 4 所述的抑制剂， 其特征在于 ： 所述植物 病害为真菌病害。 6. 如权利要求 5 所述的应用或抑制剂， 其特征在于 ： 所述真菌病害为植物疫病、 植物灰 霉病、 植物菌核病、 植物黑星病、 植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一种 ； 或， 所述植物病原菌为植物疫病致病菌、 植物灰霉病致病菌、 植物菌核病致病菌、 植物黑星 病致病菌、 植物枯萎病致病菌和植物褐斑病致病菌中的至少一种。 7. 如权利要求 6 所述的应用或抑制剂， 其特征在于 ： 所述植物疫病由辣椒疫霉引起， 所 述植物灰霉病由灰葡萄孢菌引起， 所述植物菌核病由菌核核盘菌引起， 所述植物黑星病由 瓜疮痂枝孢霉菌引起， 所述植物枯萎。
6、病由尖孢镰刀菌引起， 所述植物褐斑病由瓜棒孢霉引 起 ； 或， 所述植物疫病致病菌为辣椒疫霉， 所述植物灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌， 所述植物 菌核病致病菌为菌核核盘菌， 所述植物黑星病致病菌为瓜疮痂枝孢霉菌， 所述植物枯萎病 致病菌为尖孢镰刀菌， 所述植物褐斑病致病菌为瓜棒孢霉。 8. 防治蔬菜疫病的方法， 包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤 ； 所述可可木 霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求 1 所述的可可木霉得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮液中 权利要求 1 所述的可可木霉的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml。 9. 防治蔬菜真菌病害的方法， 包括用可可木霉菌悬浮液。
7、喷施蔬菜植株的步骤 ； 所述可 可木霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求 1 所述的可可木霉得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮 液中权利要求 1 所述的可可木霉的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml ； 所述蔬菜真菌病害为蔬菜灰霉病、 蔬菜菌核病、 蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少一种。 10. 防治蔬菜枯萎病的方法， 包括用可可木霉菌悬浮液浸泡蔬菜胚根的步骤 ； 所述可 可木霉菌悬浮液是用水悬浮权利要求 1 所述的可可木霉得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮 液中权利要求 1 所述的可可木霉的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml。 权 利 要 求 书 CN 1030。
8、74237 A 2 1/10 页 3 一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一株可可木霉及其在防治蔬菜病害中的应用。 背景技术 0002 目前， 我国蔬菜种植面积已经超过 15,000 万亩， 其中大棚蔬菜和设施园艺植物已 超过 2010 万亩。由于蔬菜温室栽培面积的扩大和重茬连作， 为病虫害的发生提供了有利的 生态条件。蔬菜枯萎病， 灰霉病， 立枯病等多种真菌病害在蔬菜种植中普遍发生， 发生严重 时， 造成大幅度减产， 是农民在育苗、 种植过程中常遇到的棘手问题。 0003 辣椒疫病是由青椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)引起的。
9、一种土传病害， 是青椒的毁灭性病害， 在青椒的整个生育期内均可发病。 青椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian) 是鞭毛菌亚门的真菌。病菌以卵孢子在土壤中或病残体中越冬， 借风、 雨、 灌水及 其他农事活动传播。发病后可产生新的孢子囊， 形成游动孢子进行再侵染。病菌生育温度 范围为 10 37， 最适宜温度为 20 30。空气相对湿度达 90% 以上时发病迅速 ； 重茬、 低洼地、 排水不良， 氮肥使用偏多、 密度过大、 植株衰弱均有利于该病的发生和蔓延。 大水漫 灌和高温高湿的条件容易引起青椒疫病的大面积流行， 常造成辣椒减产， 甚至绝收， 辣椒疫 病已成为世界范围。
10、内青椒的毁灭性病害。 0004 灰霉病在我国北方菜区是一种危害性很大的病害。塑料大棚、 温室、 小拱棚等保 护设施栽培的番茄、 辣椒、 黄瓜、 菜豆等蔬菜常发生灰霉病的流行， 严重时减产达 20-30% 以上。番茄灰霉病的病原是灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea Pers.） ， 属于半知菌的一 种真菌。分生孢子梗细长， 有分隔和分枝， 灰至灰褐色， 成丛从寄主表皮长出， 大小为 280-55012-24 微米。分生孢子近球形或卵形， 单细胞、 淡色， 大小为 9-156.5-10 微米。 病菌还可产生黑褐色、 不规则形的菌核。病菌寄主范围较广， 除侵染茄科蔬菜外， 还可侵染 瓜类。
11、、 甘蓝、 菜豆、 莴苣、 洋葱、 苹果等作物。病菌主要以菌丝体或微菌核随病残体或遗留在 土壤中越冬， 成为下一个生长季初侵染的菌源。在我国南方的病菌也可以在保护栽培设施 内终年存活。 病菌的分生孢子可通过风雨、 昆虫、 甚至农事操作而传播， 条件适宜时即萌发， 多从伤口或衰老、 坏死组织侵入。 初侵染发病后又长出大量新的分生孢子， 通过传播可不断 进行再侵染。 0005 目前生产上多采用化学药剂防治， 但是长期大量地使用农药致使病原菌产生抗 性， 且严重破坏农业生态系统， 造成对环境的污染。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种可可木霉及其应用。 0007 本发明提供的可可木霉 （Tr。
12、ichoderma theobromicola） ， 名称为 Gu11, 已于 2012 年 12 月 17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101） ， 保藏号为 CGMCCNo.6994。 可可木霉 （Trichoderma theobromicola） Gu11CGMCC No.6994在下文中简称可可木霉Gu11。 说 明 书 CN 103074237 A 3 2/10 页 4 0008 所述可可木霉 Gu11 可以分生孢子、 厚垣孢子、 菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝 体的。
13、形式存在。 0009 本发明所提供的可可木霉 Gu11 的应用为下述任一种 ： 0010 1、 可可木霉 Gu11 在防治植物病害中的应用。 0011 2、 可可木霉 Gu11 和 / 或可可木霉 Gu11 的代谢物在制备植物病原菌抑制剂中的应 用。 0012 3、 可可木霉 Gu11 和 / 或可可木霉 Gu11 的代谢物在制备植物病害抑制剂中的应 用。 0013 4、 植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂， 它的活性成分是可可木霉Gu11和/或可 可木霉 Gu11 的代谢物。 0014 5、 防治蔬菜疫病的方法， 包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤 ； 所述可 可木霉菌悬浮液是用水悬浮可。
14、可木霉 Gu11 得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮液中可可木 霉 Gu11 的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml（如 107cfu/ml） 。 0015 6、 防治蔬菜真菌病害的方法， 包括用可可木霉菌悬浮液喷施蔬菜植株的步骤 ； 所 述可可木霉菌悬浮液是用水悬浮可可木霉 Gu11 得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮液中可 可木霉 Gu11 的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml（如 107cfu/ml） ； 0016 所述蔬菜真菌病害为蔬菜灰霉病、 蔬菜菌核病、 蔬菜黑星病和蔬菜褐斑病中至少 一种。 0017 7、 防治蔬菜枯萎病的方法， 包括用可。
15、可木霉菌悬浮液浸泡蔬菜胚根的步骤 ； 所述 可可木霉菌悬浮液是用水悬浮可可木霉 Gu11 得到的液体， 所述可可木霉菌悬浮液中可可 木霉 Gu11 的含量为 （2.0104） -（5.0107） cfu/ml（如 107cfu/ml） 。 0018 上文中， 所述植物病害可为真菌病害。所述真菌病害可为植物疫病、 植物灰霉病、 植物菌核病、 植物黑星病、 植物枯萎病和植物褐斑病中的至少一种。 所述植物疫病可由辣椒 疫霉引起， 所述植物灰霉病可由灰葡萄孢菌引起， 所述植物菌核病可由菌核核盘菌引起， 所 述植物黑星病可由瓜疮痂枝孢霉菌引起， 所述植物枯萎病可由尖孢镰刀菌引起， 所述植物 褐斑病可由瓜。
16、棒孢霉引起。所述植物疫病具体可为辣椒疫病。所述植物灰霉病具体可为番 茄灰霉病。所述植物菌核病具体可为黄瓜菌核病。所述植物黑星病具体可为黄瓜黑星病。 所述植物枯萎病具体可为黄瓜枯萎病。所述植物褐斑病具体可为黄瓜褐斑病。 0019 上文中， 所述植物病原菌可为植物疫病致病菌、 植物灰霉病致病菌、 植物菌核病致 病菌、 植物黑星病致病菌、 植物枯萎病致病菌、 植物褐斑病致病菌和植物纹枯病致病菌中的 至少一种。所述植物疫病致病菌具体可为辣椒疫霉， 所述植物灰霉病致病菌具体可为灰葡 萄孢菌， 所述植物菌核病致病菌具体可为菌核核盘菌， 所述植物黑星病致病菌具体可为瓜 疮痂枝孢霉菌， 所述植物枯萎病致病菌具。
17、体可为尖孢镰刀菌， 所述植物褐斑病致病菌具体 可为瓜棒孢霉。 0020 上文中， 所述防治具体可为预防和 / 或治疗。所述可可木霉 Gu11 的代谢物可从可 可木霉 Gu11 的发酵液中获得。所述可可木霉 Gu11 的代谢物具体可按照如下方法制备， 在 液体培养基中培养可可木霉 Gu11， 除去液体培养物 （发酵液） 中的可可木霉 Gu11 即得到所 述可可木霉 Gu11 的代谢物。 0021 上文中， 所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中除所述活性成分外， 还含有 说 明 书 CN 103074237 A 4 3/10 页 5 载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述。
18、载体可为固体载体 或液体载体 ； 所述固体载体可为矿物材料、 植物材料或高分子化合物 ； 所述矿物材料可为 粘土、 滑石、 高岭土、 蒙脱石、 白碳、 沸石、 硅石和硅藻土中的至少一种 ； 所述植物材料可为玉 米粉、 豆粉和淀粉中的至少一种 ； 所述高分子化合物可为聚乙烯醇和 / 或聚二醇 ； 所述液体 载体可为有机溶剂、 植物油、 矿物油或水 ； 所述有机溶剂可为癸烷和 / 或十二烷。 0022 所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中， 所述可可木霉 Gu11 可以分生孢子、 厚垣孢子、 菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。 0023 所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂的剂型可为多。
19、种剂型， 如液剂、 乳剂、 悬 浮剂、 粉剂、 颗粒剂、 可湿性粉剂或水分散粒剂。 0024 根据需要， 所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中还可添加表面活性剂 （如 吐温 20、 吐温 80 等） 、 粘合剂、 稳定剂 （如抗氧化剂） 、 pH 调节剂等。 0025 本发明的制剂中的菌株 Gu11 的分生孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固体 制剂中， 分生孢子的数量为 （1105） -（1108） cfu/ 克， 如 （1106） -（1107） 个 cfu/ 克。 对于液体制剂， 稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为 （2.0104） -（5.0107） cfu 孢 子 /mL， 如 。
20、107cfu/mL。 0026 所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂可以与其它适合的化学农药配合使用， 从而降低化学农药剂的用量， 减少对环境的污染。 0027 上述防治蔬菜疫病的方法中， 所述蔬菜疫病可为辣椒疫病， 所述蔬菜可为辣椒。 0028 上述防治蔬菜真菌病害的方法中， 所述蔬菜可为黄瓜和 / 番茄。所述蔬菜灰霉病 可为番茄灰霉病， 所述蔬菜菌核病可为黄瓜菌核病， 所述蔬菜黑星病可为黄瓜黑星病， 所述 蔬菜褐斑病可为黄瓜褐斑病。 0029 上述防治蔬菜枯萎病的方法中， 所述蔬菜枯萎病为黄瓜枯萎病， 所述蔬菜为黄瓜。 0030 实验证明， 可可木霉 Gu11 菌剂 （107cfu/mL）。
21、 对褐斑病的防治效果是百菌清溶液的 0.463倍， 对灰霉病的防治效果是百菌清溶液的0.931倍， 对黑星病的防治效果是福星EC溶 液0.752倍， 对纹枯病的防治效果是井岗霉素溶液的0.568倍， 对菌核病的防治效果是嘧霉 胺悬浮剂溶液的0.831倍， 对枯萎病的防治效果是甲基托布津溶液的0.581倍， 对疫病的防 治效果是烯酰吗啉溶液的 1.10 倍。本发明的可可木霉 Gu11 及其制剂对环境友好， 可抑制 病害病原的耐药和抗药性发展， 有利于绿色食品和有机农业的推广， 并且成本低、 无污染、 对蔬菜作物安全。在土壤中引进拮抗微生物， 通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可 以有效的改善环。
22、境， 维持农业生态系统平衡， 为走可持续发展道路提供强劲的后盾。 0031 生物材料保藏说明 0032 分类命名 ： 可可木霉 （Trichoderma theobromicola） 0033 菌株编号 ： Gu11 0034 保藏机构 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0035 保藏机构简称 ： CGMCC 0036 地址 ： 北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所 0037 保藏日期 ： 2012 年 12 月 17 日 0038 保藏中心登记入册编号 ： CGMCC No.6994 0039 下面结合具体实施例详细描述本发明， 这些实施例用于理解而不是限制本发明。 说 明。
23、 书 CN 103074237 A 5 4/10 页 6 具体实施方式 0040 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0041 下 述 实 施 例 中 所 用 的 黑 星 病 致 病 菌 为 瓜 疮 痂 枝 孢 霉 菌 (Cladosporium cucumerinum)， 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC36060。 0042 下述实施例中所用的枯萎病致病菌为尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum。
24、)， 购自中 国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC36468。 0043 下述实施例中所用的褐斑病致病菌为瓜棒孢霉 （Corynespora cassiicola Wei） ， 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC36068。 0044 下述实施例中所用的疫病致病菌为辣椒疫霉 (Phytophthora capsisi， 购自中国 农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC37401。 0045 下述实施例中所用的灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌 (Botrytis Cinerea)， 购自中国 农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC36041。 00。
25、46 下 述 实 施 例 中 所 用 的 菌 核 病 致 病 菌 为 菌 核 核 盘 菌 （Sclerotinia sclerotiorumm） ， 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号 ACCC30096。 0047 实施例 1、 可可木霉 (Trichoderma theobromicola)Gu11 的获得和保藏 0048 一、 采样 0049 从北京、 河北、 新疆、 山东、 湖北等采集土样。 0050 二、 菌株分离 0051 采用涂布法分离菌株。 0052 每个土样称取 10g， 分别倒入加有少许吐温 80、 玻璃珠以及 100ml 蒸馏水无菌的 500ml 三角瓶中， 。
26、摇匀， 标号， 用摇床摇 30 分钟。然后用微量注射器吸 5ml 土壤悬浊液于加 入到含45ml灭菌蒸馏水的250ml三角瓶中， 摇匀， 再从250ml三角瓶中吸1ml加入到含9ml 灭菌蒸馏水的试管中， 进行倍比稀释， 将样品梯度稀释到10-4和10-5的每个样品吸0.1ml滴 于 PDA 平板， 涂布， 28培养 48-72 小时， 从中挑选出产绿色分生孢子的菌落， 进行斜面接 种， 待菌落长出后， 将转接于 PDA 平板上分离、 纯化， 直到获得木霉纯培养。置于冰箱 4保 存。 0053 三、 菌株筛选 0054 1、 平皿拮抗筛选 0055 在 PDA 平板中心接种木霉菌块， 在半径 。
27、2.5cm 左右的圆周上， 等距离接种 3 点等量 不同病原菌， 将每三种不同的病原菌作为一组， 共有三组， 每组设三个重复。用记号笔做好 标记菌株编号， 以备观察记录。将接种好的培养皿放于 28的培养箱中培养 7-10d 左右。 隔日对所做的实验进行拍照， 测量病原菌指向木霉的半径R和r。 记录木霉与病原菌之间的 形态特征。病菌与木霉交接后， 观察病原菌对木霉菌落的包围、 抑制、 侵入和占领其营养空 间的过程。筛选木霉菌株， 依据以下原则进行 ：（1） 生长速度明显高于病原菌的木霉， 能够 与病原菌争夺营养， 从而显著抑制病原菌的生长 ；（2） 与病原菌之间有 0.2cm 左右空隙， 即 产。
28、生了抑菌带， 说明木霉在代谢过程中产生了某种抗生物质。结果见表 1。 说 明 书 CN 103074237 A 6 5/10 页 7 0056 表 1 木霉菌株与 9 种病原菌之间平皿对峙记录 0057 菌株编号棉花黄萎 茄子黄萎禾谷镰刀 番茄灰霉黄瓜枯萎 西瓜枯萎黄瓜炭疽 人参立枯 棉花立枯 Gu11+ 0058 注 ： 木霉菌株对病原菌的生长抑制作用， 由强到弱， 分为 +、 +、 +、 - 四个等级。 0059 2、 盆栽活体筛选 0060 （1） 木霉菌悬液的制备 0061 将平皿拮抗筛选出的木霉重新接种于倒有PDA培养基的平皿上， 培养5d左右长出 孢子。用毛笔刷下孢子， 配成浓度为。
29、 107/ml 的菌悬液。 0062 （2） 木霉发酵液的制备 0063 将筛选出的木霉分别接种于 PDA 培养基的平皿中， 培养 5 天后， 转接到内有 100ml 培养液的 250ml 的三角瓶中， 放入摇床中 30培养 3 天。 0064 （3） 筛选 0065 将供试木霉菌悬液及对照药剂分别按试验浓度配好， 黑星病致病菌、 褐斑病致病 菌的接种方式采用孢子悬浮液喷雾接种， 灰霉病致病菌和菌核病致病菌的接种方式采用菌 苔叶面接种法、 枯萎病致病菌采用胚根接种法， 疫病致病菌采用离体叶菌苔叶面接种方法。 0066 首先施木霉菌悬液， 灰霉病致病菌、 黑星病致病菌、 褐斑病致病菌、 菌核病致。
30、病菌、 疫病致病菌采用喷雾喷施的方式， 待喷施木霉菌悬液后 2h 后再接种病原菌， 枯萎病致病菌 浸泡施药的方式， 接种后保湿培养。 0067 将分离获得的木霉菌株与 9 种普遍发生的病原真菌进行平板对峙试验， 筛选出上 述对有明显拮抗作用的木霉对 6 种病原菌进行室内盆栽试验， 筛选出对疫病致病菌、 菌核 病致病菌、 灰霉病致病菌等 3 种病害均具有较好的防治效果的木霉菌株 Gu11， 该菌株具有 多抗特性， 适合推广生产。对木霉菌株 Gu11 进行下述步骤四的鉴定。 0068 四、 菌株鉴定 0069 （1） 菌株的形态学鉴定 0070 将菌株接种在 PDA 培养基上， 26恒温培养 3 。
31、天， 记录菌落形态。取直径 2cm 的菌 饼放在铺有两层湿润滤纸的培养皿中， 4 天后制作玻片， 观察记录孢子形态及产孢结构， 测 量孢子 （30 个） 和孢子梗宽度等。 0071 木霉菌株 Gu11 的形态特征 ： 0072 菌落直径在 PDA 上黑暗培养， 25-30培养 72h 为 50-60mm， 在 40培养 24mm ； 在 SNA 培养基上为 25-30培养 72h 为 20mm ； 在 PDA 上 30-40培养的情况下， 分生孢子量大 且致密， 主要集中于菌落中央平坦部分 ； 在 SNA 分生孢子产生于环状排列的垫状产孢簇上。 分生孢子梗在具有可以分辨的主轴， 分枝较多， 分。
32、枝间距短， 瓶梗单生， 直接着生在次级分 枝上顶端， 瓶梗直， 长度 5.5m-9.5m。分生孢子在 CMD 上绿色， 长形到长卵圆形 , 光滑， 大小 3.5-4.53.5-4.0m。 0073 （2） 菌株的分子鉴定 0074 在 PDA 平板上铺玻璃纸， 然后把木霉菌株 Gu11 接种到玻璃纸上， 菌种接种于平皿 中央， 28黑暗培养72h。 采用CTAB法进行DNA提取， 采用绵阳高新区天泽基因工程公司制 说 明 书 CN 103074237 A 7 6/10 页 8 造的 DNAOUT 提取试剂盒， 按照 White 等 （1990） 条件进行 ITS 扩增， PCR 产物送英俊生物。
33、技 术有限公司测序。将木霉菌株 Gu11 的 ITS 信息 （见序列表的序列 1） 进行 BLAST 分析， 给出 菌株的鉴定结果。 0075 根据上述分子鉴定与形态学鉴定结果， 将木霉菌株 Gu11 鉴定为可可木霉 （Trichoderma theobromicola） 。可可木霉 Gu11 已经于 2012 年 12 月 17 日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.6994。可可木霉 Gu11 隶 属木霉属 （Trichoderma） 、 粘孢菌类 （Gliolosporae） 、 丝孢目 （Hyphomycetales） 、 丝孢纲 （Hyp。
34、homycetes） 、 半知菌亚门 (Deuteromycotina)。 0076 实施例 2、 可可木霉 Gu11 在防治蔬菜病害中的应用 0077 1、 供试药剂 ： 0078 1.1 可可木霉 Gu11 菌剂 0079 可可木霉Gu11菌剂的制备方法如下 ： 将可可木霉Gu11接种于PDA培养基平板上， 培养 5 天左右长出孢子， 用毛笔刷下孢子， 用无菌水配成浓度为 107cfu/ml 的菌悬液， 该菌 悬液即为可可木霉 Gu11 菌剂。 0080 1.2 井岗霉素溶液 0081 井岗霉素溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g3% 井岗霉素水剂 （浙江省桐庐汇丰生物 化工有限公司） 。
35、溶于 20ml 水， 得到井岗霉素溶液。 0082 1.3 烯酰吗啉溶液 0083 烯酰吗啉溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g50% 烯酰吗啉 （河北上瑞化工有限公司） 溶于 20ml 水， 得到烯酰吗啉溶液。 0084 1.4 百菌清溶液 0085 百菌清溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g75% 百菌清 （新沂丰乐化工有限公司） 溶于 20ml 水， 得到百菌清溶液。 0086 1.5 福星 EC 溶液 0087 福星 EC 溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g40% 福星 EC500（杜邦中国集团有限公司） 溶于 20ml 水， 得到福星 EC 溶液。 0088 1.6 嘧霉胺悬。
36、浮剂溶液 0089 嘧霉胺悬浮剂溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g40% 嘧霉胺悬浮剂 （烟台科达化工有 限公司） 溶于 20ml 水， 得到嘧霉胺悬浮剂溶液。 0090 1.7 甲基托布津溶液 0091 甲基托布津溶液的制备方法如下 ： 将 0.01g70% 甲基托布津 （山东华阳农药化工集 团有限公司） 溶于 20ml 水， 得到 70% 甲基托布津溶液。 0092 2、 供试病原菌 0093 2.1 黑星病致病菌 ： 瓜疮痂枝孢霉菌 (Cladosporium cucumerinum)ACCC36060。 0094 2.2 枯萎病致病菌 ： 尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysp。
37、orum)ACCC36468。 0095 2.3 褐斑病致病菌 ： 瓜棒孢霉 （Corynespora cassiicola ACCC36068。 0096 2.4 疫病致病菌 ： 辣椒疫霉 (Phytophthora capsisi ACCC37401。 0097 2.5 灰霉病致病菌 ： 灰葡萄孢菌 (Botrytis Cinerea)ACCC36041。 0098 2.6 菌核病致病菌 ： 菌核核盘菌 （Sclerotinia sclerotiorumm） ACCC30096。 说 明 书 CN 103074237 A 8 7/10 页 9 0099 3、 试验方法 0100 在温室内，。
38、 通过人工接种方法， 分别测定可可木霉 Gu11 对黑星病致病菌、 枯萎病 致病菌、 褐斑病致病菌、 疫病致病菌、 灰霉病致病菌和菌核病致病菌病害的抑制情况。 0101 3.1 可可木霉 Gu11 对疫病防治实验 0102 将幼苗期辣椒中椒 106（购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 植株分为三 组， 每组设置 5 个平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处理 ： 0103 第一组 ： 将 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂用喷雾器均匀喷洒在叶子上 ； 0104 第二组 （阳性对照） ： 将 1.3 的烯酰吗啉溶液用喷雾器均匀喷洒在叶子上 ； 0105 第三组 （阴性对照） ： 将无。
39、菌水用喷雾器均匀喷洒在叶子上 ； 0106 将上述三组处理后的叶片保湿 1 小时 ； 然后将 2.4 的疫病致病菌平板打直径 0.5cm 菌片接种在叶子上， 每株辣椒接种 2 片叶子， 每片叶子接种一个菌片。待阴性对照发 病时(接种致病菌后48小时， 即病原菌在叶片上定殖， 导致接种点叶片与健康部位相比， 出 现病理性变化)， 调查记录三组辣椒植株叶片的病斑面积情况。 按照下述公式计算供试药剂 对疫病致病菌的防治效果 ： 0107 0108 3.2、 可可木霉 Gu11 对灰霉病防治实验 0109 将番茄中杂 201（购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 种子种于小穴盘中， 到子叶平展期分为三组。
40、， 每组设置 5 个平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处理 ： 0110 第一组 ： 将 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0111 第二组 （阳性对照） ： 将 1.4 的百菌清溶液用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0112 第三组 （阴性对照） ： 将无菌水用喷雾器均匀喷洒在子叶上， 每片叶子喷洒 ； 0113 将上述三组处理后的叶片保湿 6 小时 ； 然后将 2.5 的灰霉病致病菌平板打直径 0.5cm 的菌片接种在叶子上， 每株接种 2 片叶子， 每片子叶接种一个菌片 ； 接种致病菌后 24 小时保湿。待阴性对照发病时 （即待病原菌在叶片上定殖，。
41、 导致接种点叶片与健康部位相 比， 出现病理性变化） ， 调查三组番茄植株叶片病斑面积。按照下述公式计算供试药剂对灰 霉病致病菌的防治效果 ： 0114 0115 3.3 可可木霉 Gu11 对褐斑病防治实验 0116 将2.3的褐斑病致病菌在PDA平板上培养六天后， 用毛笔将孢子刷下， 配成浓度为 106个 /ml 的孢子悬液， 即褐斑病致病菌菌悬液。 0117 将黄瓜中杂 16 （购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 种子种于小穴盘中， 到 黄瓜子叶平展期分为三组， 每组设置 5 个平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处 说 明 书 CN 103074237 A 9 8/10 页。
42、 10 理 ： 0118 第一组 ： 将 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0119 第二组 （阳性对照） ： 将 1.4 百菌清溶液用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0120 第三组 （阴性对照） ： 将无菌水用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0121 将上述三组处理后的叶片保湿 6 小时 ； 然后将上述褐斑病致病菌菌悬液均匀的喷 洒到处理过的子叶上， 接种致病菌后 24 小时保湿。待阴性对照发病时 （即待病原菌在叶片 上定殖， 导致接种点叶片与健康部位相比， 出现病理性变化） ， 调查三组黄瓜植株叶片病斑 面积。按照下述公式计算供试药剂对褐斑病致病菌的防治效果 ： 0。
43、122 0123 3.4 可可木霉 Gu11 对黑星病的防治实验 0124 将2.1的黑星病致病菌在PDA平板上培养六天后， 用毛笔将孢子刷下， 配成浓度为 106个 /ml 的孢子悬液， 即黑星病致病菌菌悬液。 0125 将黄瓜中杂 16 （购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 种子种于小穴盘中， 到 黄瓜子叶平展期分为三组， 每组设置 5 个平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处 理 ： 0126 第一组 ： 将 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0127 第二组 （阳性对照） ： 将 1.5 的福星 EC 溶液用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0128。
44、 第三组 （阴性对照） ： 将无菌水用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0129 将上述三组处理后的叶片保湿 6 小时 ； 然后将上述黑星病致病菌菌悬液均匀的喷 洒到处理过的子叶上 ； 接种致病菌后 24 小时保湿。待阴性对照发病时 （即待病原菌在叶片 上定殖， 导致接种点叶片与健康部位相比， 出现病理性变化） ， 调查三组黄瓜植株叶片病斑 面积。按照下述公式计算供试药剂对黑星病致病菌的防治效果 ： 0130 0131 3.5 可可木霉 Gu11 对菌核病原菌活体抑制实验 0132 将黄瓜中杂 16 （购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 种子种于小穴盘中， 到 子叶平展期分为三组， 每组设置 5 个。
45、平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处理 ： 0133 第一组 ： 将 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0134 第二组 （阳性对照） ： 将 1.6 的嘧霉胺悬浮剂溶液用喷雾器均匀喷洒在子叶上 ； 0135 第三组 （阴性对照） ： 将无菌水用喷雾器均匀喷洒在子叶上， 每片叶子喷洒 ； 0136 将上述三组处理后的叶片保湿 6 小时 ； 然后将 2.7 的菌核病致病菌平板打直径 0.5cm 的菌片接种在叶子上， 每株接种 2 片叶子， 每片子叶接种一个菌片 ； 接种致病菌后 24 小时保湿。待阴性对照发病时 （即待病原菌在叶片上定殖， 导致接种点叶。
46、片与健康部位相 说 明 书 CN 103074237 A 10 9/10 页 11 比， 出现病理性变化） ， 调查三组黄瓜植株叶片病斑面积。照下述公式计算供试药剂对菌核 病致病菌的防治效果 ： 0137 0138 3.6 可可木霉 Gu11 对枯萎病防治实验 0139 将2.2的枯萎病致病菌在PDA平板上培养六天后， 用毛笔将孢子刷下， 配成浓度为 106个 /ml 的孢子悬液， 即枯萎病致病菌菌悬液。 0140 将黄瓜中杂 16 （购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所） 种子种于小穴盘中， 到 子叶平展期分为三组， 每组设置 5 个平行处理， 每个平行处理 30 株。分别进行如下处理 ： 01。
47、41 第一组 ： 用 1.1 的可可木霉 Gu11 菌剂浸泡胚根 10 分钟 ； 0142 第二组 （阳性对照） ： 采用 1.7 的甲基托布津溶液浸泡胚根 10 分钟 ； 0143 第三组 （阴性对照） ： 用无菌水浸泡胚根 10 分钟 ； 0144 将上述三组处理后胚根保湿 6 小时， 然后将上述枯萎病致病菌菌悬液浸泡胚根 10 分钟， 接种致病菌后 24 小时保湿。待阴性对照发病时， 即待黄瓜植株维管束变色， 出现萎蔫 症状， 调查三组黄瓜植株枯萎病发病率情况。照下述公式计算供试药剂对枯萎病致病菌的 防治效果 ： 0145 0146 0147 4、 实验结果 0148 可可木霉 Gu11。
48、 菌剂对上述致病菌引起的病害的防治效果如表 2 所示， 表明可可 木霉 Gu11 对植物褐斑病、 灰霉病、 黑星病、 菌核病、 枯萎病、 疫病均有防治效果， 其中， 可可 木霉 Gu11 菌剂对褐斑病的防治效果是百菌清溶液的 0.463 倍 （31.025%/67.000%） ， 可可木 霉 Gu11 菌剂对灰霉病的防治效果是百菌清溶液的 0.931 倍 （74.352%/79.897%） ， 可可木霉 Gu11 菌剂对黑星病的防治效果是福星 EC 溶液 0.752 倍 （62.929%/83.698%） ， 对菌核病的防 治效果是嘧霉胺悬浮剂溶液的 0.831 倍 （61.003%/73.429%） ， 可可木霉 Gu11 菌剂对枯萎病 的防治效果是甲基托布津溶液的 0.581 倍 （54.887%/94.452%） ， 可可木霉 Gu11 菌剂对疫病 的防治效果是烯酰吗啉溶液的 1.10 倍 （95.698%/87.346%） 。 0149 表 2 可可木霉 Gu11 对蔬菜主要病害防治效果 0150 说 明 书 CN 103074237 A 11 10/10 页 12 说 明 书 CN 103074237 A 12 1/2 页 13。