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1、(10)申请公布号 CN 103074413 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074413 A *CN103074413A* (21)申请号 201110326915.8 (22)申请日 2011.10.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国北京出入境检验检 疫局 地址 100026 北京市朝阳区甜水园街 6 号 (72)发明人 张捷 张惠媛 张昕 汪琦 顾德周 陈广全 (54) 发明名称 一种用于检测副溶血性弧菌的分子马达生物 传感器试剂盒 (57) 摘。
2、要 一种用于检测副溶血性弧菌的分子马达生物 传感器试剂盒属于食品微生物快速检测领域， 主 要解决传统检测方法时间过长 ( 约 4 天 )。本发 明的核心技术是利用载色体 Chromatophore 上的 F0F1-ATPase 分子马达生物传感器， F0F1-ATP 合酶 由于能快速地旋转， 通过旋转它建立了催化位点 与质子转运之间的偶联。 首先在 ATP 合酶的 亚 基上连接 toxR 探针， 将待测样品和阴性对照分别 与生物传感器结合后， 比较其催化 ATP 合成 30 分 钟后的ATP产生量， ATP合成的多寡可以通过环境 中H+的量进行测量， 而H +的多寡通过H-DHPE所体 现的荧。
3、光强度大小来获得。本试剂盒可对待测样 本中的副溶血性弧菌进行快速、 灵敏、 高通量的检 测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103074413 A CN 103074413 A *CN103074413A* 1/1 页 2 本发明要求保护的内容有 ： 1. 特异性核酸探针与 F0F1-ATP 合酶连接的方式 ： 在 F0F1-ATP 合酶的 亚基上依次连 接 亚基抗体、 生物素、 链霉亲和素、 生物素标记的 toxR 探针。 2。
4、. 试剂盒检测体系的反应条件 ： 37恒温摇床中温育 30min。 3.合成buffer、 启动buffer、 PBS的配方。 合成buffer ： 甘油20， 氯化镁5mM， Tricine 50mM， 磷酸氢二钾 5mM ； 启动 buffer ： ADP(1.6mM) 上述合成 buffer 1 3(v/v) ； PBS ： 137mM 氯化钠， 2.7mM 氯化钾， 10mM 磷酸氢二钠， 2mM 磷酸二氢钾。 权 利 要 求 书 CN 103074413 A 2 1/4 页 3 一种用于检测副溶血性弧菌的分子马达生物传感器试剂盒 技术领域 0001 本发明是关于食品微生物快速检测技术。
5、的一种。 背景技术 0002 传统的副溶血性弧菌检测方法要求对每个检验项目进行非选择性增菌、 选择性增 菌、 分离、 筛选和鉴定等步骤， 一般需要 4 天才能出具检测报告， 严重影响货物的品质和货 架寿命。一些新的技术如 PCR 技术、 免疫学检测技术、 生物芯片技术等检测方法仍依赖于传 统的检测步骤， 即需要进行增菌， 耗时耗力， 完成一次检测通常需要几天的时间。这样不仅 增加了实验室的工作量， 而且也不利于食品工业中生产流程的监测、 终产品的质量控制以 及政府部门对食品安全的管理和控制。 发明内容 0003 以受控分子马达技术为核心， 集成核酸探针识别、 荧光探针标记与检测等技术， 建 立。
6、了一个全新概念的快速检测技术体系。利用 ATP 酶作为载体对目标物进行检测具有灵敏 度高、 特异性强、 快速的特点。 在F0F1-ATPase分子马达连接上特异的核酸探针， 可以实现对 特定食品微生物的快速、 特异性、 高通量的检测。本发明可将检测时间缩短至 2 天， 且检测 灵敏度能达到 102CFU/ml， 满足现有的食品微生物检测范围。 附图说明 0004 附图 1 为分子马达生物传感器模式图 ( 其中 a、 b、 c、 、 、 、 、 均为 ATP 合酶亚基 )， 1 为 亚基抗体， 2 为链霉亲和素 (Strptavidin)， 3 为 N-biotin， 4 为 toxR 探 针，。
7、 5 为副溶血性弧菌单链 DNA。 0005 附图2为chro toxR对不同种菌株的检测结果， 纵坐标表示荧光值， 横坐标表示检 测的样本， 其中 1 为水， 2 为副溶血性弧菌， 3 为沙门氏菌， 4 为单增李斯特氏菌， 5 为霍乱弧 菌， 6 为大肠杆菌。 0006 附图 3 为 chro toxR 对 30 株副溶血性弧菌样本的检测结果， 纵坐标表示荧光值， 横坐标表示检测的样本， 1 30 为食品检测样本编号。 具体实施方式 0007 根据沙门氏菌 toxR 基因设计特异性核酸探针 5 -gtcttctgacgcaatcgttg， 其中探 针的 5 用生物素进行标记。将该探针通过生物。
8、素抗体连接在分子马达上面， 利用分子马达 生物传感器即可对待测样本的DNA进行检测， 当样品为副溶血性弧菌DNA时， 检测体系的荧 光值会发生明显的变化， 通过这一变化即可判断样本为阳性。为此， 我们设计了一个试剂 盒， 可以方便、 快速对食品中的副溶血性弧菌进行检测。 0008 试剂盒组成 ： 0009 说 明 书 CN 103074413 A 3 2/4 页 4 编号 组分名称 数量 保存条件 1 Chro toxR 20l -20 2 合成 buffer 10ml 室温 3 ADP(1.6mol/l) 1ml -20 4 1PBS 25ml 室温 5 荧光素酶 / 荧光素 100 个单位。
9、 -20 6 荧光素酶 / 荧光素重组缓冲液 12ml -20 7 无菌水 5ml 室温 0010 操作步骤如下 ： 0011 1. 取 1.5ml EP 管， 加入待测样本 10l。 0012 2. 将上述 EP 管放入沸水中 3min， 然后立即转移到冰上至完全冷却。 0013 3.取2l chro toxR， 用合成buffer稀释到一定的倍数。 取稀释后的chro 10l 加入上述 FP 管。 0014 4. 另取 1 个 FP 管加入 10l 无菌水， 沸水中 3min， 然后立即转移到冰上至完全冷 却， 再加入 10l 合成 buffer 作为本底对照， 短暂振荡使反应体系混匀。 。
10、0015 5. 再向 2 个 EP 管中分别加入 30l 启动 buffer( 启动 buffer 由 ADP(1.6mol/l) 和合成 buffer 按体积比 1 3 配制， 每次实验按需要取一定的量配制， 现用现配 )， 振荡使 反应体系混匀， 然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠。 0016 6. 将上述反应体系放入 37恒温摇床中温育 30min。 0017 7. 将 EP 管从摇床中取出， 分别加入 450l PBS 缓冲液， 振荡使体系混匀。 0018 8.取一块干净的96孔板， 将2管中的最终反应体系加入其中， 每个体系加3孔， 每 孔加样 50l， 然后对每个加样孔分别加入。
11、 30l 已配置好的荧光素酶溶液 ( 将荧光素酶 / 荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶 / 荧光素的棕色玻璃瓶中， 盖上瓶塞， 反复颠倒几次 混匀， 不可振荡。使用前应将混合液在室温放置 1h)， 用枪反复吹打几次使体系混匀。 0019 9. 将 96 孔板上机检测， 处理数据， 对各组数据取平均值， 然后用样本数值减去本 底数值即为样本的实际荧光值。 0020 通过实验， 分子马达生物传感器 chro toxR 具有良好的特异性， 用 chro toxR 对 水、 副溶血性弧菌、 沙门氏菌、 霍乱弧菌、 单增李斯特氏菌、 大肠杆菌进行检测， 副溶血性弧 菌的荧光值明显低于水和其他对照菌的荧光。
12、值， 具体数据见下表， 结果见附图 2。 0021 说 明 书 CN 103074413 A 4 3/4 页 5 样品 (10ng/mL) 荧光值 水 123389 副溶血性弧菌 94218 沙门氏菌 134561 单增李斯特氏菌 124393 霍乱弧菌 129645 大肠杆菌 127119 0022 用chro toxR对30株食品样本进行检测， 均能检出， 具体数据见下表， 结果见附图 3。 0023 样本编号 荧光值 样本编号 荧光值 水 331117 16 240244 1 229336 17 245423 2 233980 18 244344 3 239941 19 224345 4。
13、 240928 20 231852 5 234759 21 239362 6 239551 22 225946 7 229842 23 197955 8 263842 24 232360 说 明 书 CN 103074413 A 5 4/4 页 6 9 274551 25 237951 10 277343 26 225722 11 232402 27 236187 12 225755 28 241615 13 221433 29 244725 14 229372 30 245188 15 207543 0024 实验结果表明， 该试剂盒对副溶血性弧菌 DNA 的检测时间为 1h， 检出限为 10ng/ ml。对 30 株食品检测样本菌株的检出结果与 PCR 检测的结果一致。通过大量的实验验证 该分子马达生物传感器具有良好的特异性和较高的灵敏度， 并可通过 96 孔化学发光板高 通量的对样本进行检测。 说 明 书 CN 103074413 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103074413 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103074413 A 8 。